外源性DNA残留量测定法(qPCR法)

重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体

外源性DNA残留量测定法(qPCR法)

1原理

实时定量PCR（qPCR）扩增分2个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应，产物增长速度变慢，反应进入平台期。

反应最初，虽然产物呈指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。但积累了足够的扩增产物，才可检测到的荧光信号，这个循环数叫初始循环数，即C T。C T值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。如果模板初始浓度高，只需要较少的扩增循环就可以积累足够的产物，产生高过背景的荧光信号，因此，反应就有一个小或早出现的C T；相反，如果模板初始浓度低，需要较多的扩增循环才能产生高过背景的荧光信号，反应就有一个大或迟出现的C T。两者之间关系的建立是qPCR用于定量的依据。

2主要仪器

3主要试剂

4溶液配制

4.1 蛋白酶K混合液（新配）

附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法

（qPCR）

4.2 裂解混合液（新配）

4.3 DNA标准品稀释

5测定方法

5.1样品处理

5.1.1除蛋白

1）在2ml离心管中加入100μl样品；

2）每100μl的样品中加入70μl的蛋白酶K混合液，混合均匀，56℃水浴30min；

3）每100μl的样品中加入360μl的裂解液，室温裂解2小时以上。

5.1.2 DNA的纯化

1）磁珠使用前于37℃温浴10min，高速涡旋，彻底悬浮磁珠；

2）每100μl的样品加入30μl的磁珠悬浮液；

3）每100μl的样品加入300μl的Binding Solution，涡旋混合5min；

4）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置5min直至溶液清澈，弃上清；

5）从磁力架上取下离心管，加入300μl的Wash Buffer，涡旋混合5 sec；

6）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置2min，弃上清；

7）重复步骤6）1次，打开离心管的盖子，室温下风干；

8）加入50μl的Elution Buffer，高速涡旋10 sec，70℃处理10min，在温浴过程中，涡旋2~3次；

9）12000r/min离心30sec，将离心管放置于磁力架上，静置2min，将含有洗脱DNA的液体转移到新的1.5ml的离心管中，用于进行qPCR反应。

附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法

（qPCR）

5.2 PCR反应体系

1）标准品、NTC和样品均做2个复孔；

2）反应母液用量按表4进行计算：

5.3 PCR仪运行程序设置

5.3.1 PCR反应体系

1）标准品、NTC和样品均做2个复孔；

2）反应母液用量按表5进行计算：

5.2.2 PCR仪运行程序设置

1）荧光基团选择FAM；

2）96孔反应模块设置见下表，样品根据实际数量依次设置：

附件13-14重组抗人表皮生长因子受体人源化单克隆抗体外源性DNA残留量测定法

（qPCR）

3）PCR反应条件设置

4）运行上述设置的程序。

6接受标准

1）标准曲线：扩增效率（E）：90%~130%；R2≥0.980；斜率（Slope）：

-2.7~-3.6。

2）样品数据：2个复孔测定值SQ的CV≤20%。

7结果计算与判断

外源性DNA残留量（pg/ml）=SQ×50，SQ代表测定平均值。

根据检测样品的蛋白质浓度，得出样品中每剂量所残留的外源性DNA量。