大鼠胸主动脉内皮细胞的体外培养技术

大鼠胸主动脉内皮细胞的体外培养技术

发表时间：2014-12-26T14:14:42.107Z 来源：《医药前沿》2014年第23期供稿作者：杨帆

[导读] 原代培养5～7 d后，可见细胞从组织块边缘爬出，逐渐长成梭形或多角形。

杨帆

(安徽医科大学第一附属医院儿科安徽合肥 230032)

【摘要】目的建立有效、易行、成本低的血管内皮细胞培养方法。方法取幼鼠胸主动脉，分别用酶消化法、机械刮取法、组织块贴壁法、瞬间热处理植环法原代培养大鼠主动脉内皮细胞，消化、传代，观察细胞形态，VIII因子相关抗原免疫细胞化学染色进行细胞鉴定，确定建立动脉内皮细胞体外细胞模型的最有效、易行的培养技术。结果瞬间热处理植环法原代培养大鼠主动脉内皮细胞的细胞纯度和细胞活力都远较酶消化法、机械刮取法、组织块贴壁法高。结论瞬间热处理植环法原代培养大鼠主动脉内皮细胞可获取数量多、纯度高、活性好的细胞，是大鼠胸主动脉内皮细胞的体外培养最有效、易行的培养技术。

【关键词】大鼠主动脉内皮细胞培养

【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）23-0038-01

血管内皮细胞为覆盖于血管内膜表面的单层扁平或多角形的细胞，不仅是血液和组织的屏障，还具有减少血管通透性、抗血栓、调节血管平滑肌功能、抑制壁细胞的游走和增殖的作用，内皮细胞功能的改变是血管性疾病的重要环节，因此建立有效的血管内皮细胞培养方法有助于众多与血管相关疾病的研究。

1 材料与方法

1.1实验动物:体重100-130 g雄性4-5周龄SD大鼠，SPF级。

1.2瞬间热处理植环法原代培养大鼠内皮细胞

1%明胶包被培养皿，4℃过夜后PBS冲洗培养皿，置培养箱2h备用。取材前30 min，大鼠腹腔注射肝素钠800 u/kg。处死大鼠，75%乙醇浸泡5分钟灭菌。准备培养皿A，加入4℃PBS液，培养皿B加入预温过的培养液。取胸主动脉并放入培养皿A中，去除血管外的脂肪、结缔组织、动脉分支，PBS冲洗血管。以血管钳将血管两端结扎，置60℃无菌水中停留2S后取出至B皿。将血管切成1 mm厚度的血管环，移至明胶包被过的培养皿，每皿20-25个血管环，血管轴垂直于培养皿底，置培养箱干培养2h后加入培养液3ml。静置培养72h后，去除血管环，部分换液继续培养。

1.3传代培养原代细胞培养10-14d后，细胞汇合成单层。PBS冲洗2次后加0.25% 胰蛋白酶室温消化约1 min。当镜下见细胞连接松解时加等体积含胎牛血清的DMEM液终止消化，吹打细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入2 mL新的培养液，吹打混匀，(2-3)×105个/皿的密度接种到培养皿中，继续培养，每3d换液一次。

1.4内皮细胞鉴定—SP法

VonWillebrand Factor/Ⅷ因子相关抗原位于内皮细胞胞浆是内皮细胞的可靠标记物[1]。方法如下:内皮细胞接种于盖玻片，约24-48h待细胞爬满玻片，弃培养液，PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗5 min×3次；0.2%TritonX-100，室温下渗透20 min；PBS洗5 min×3次；3%H2O2孵育15 min；羊血清室温阻断15 min，弃血清勿洗，加入鼠Ⅷ因子相关抗原抗体，4℃过夜；PBS洗3 min×3次；滴加二抗（羊抗兔），室温15 min；PBS洗3 min×3次；加S-P复合物，室温15 min；PBS洗3 min×3次，培养孔中滴加DAB显色剂，约5～30 min后ddH2O快速中止反应；自来水冲洗、脱水、透明、封片。

2 实验结果

原代培养5～7 d后，可见细胞从组织块边缘爬出，逐渐长成梭形或多角形。10-14 d后细胞生长融合，呈单层铺路石镶嵌状排列生长。传代培养的细胞0.5 h开始贴壁，2 h后约90 %的细胞贴壁，3-4d细胞汇合成单层。用免疫细胞化学S-P法检查Ⅷ因子相关抗原，镜下内皮细胞胞质呈棕黄色，即呈阳性反应，证明其为内皮细胞，非内皮细胞及空白对照组无此着色。

3 讨论

血管内皮细胞的原代分离与培养是研究其分子生物学特性及相关疾病的重要前提，但其对生长环境营养要求高，易老化[2]，冻存后复苏难，故建立简单、有效、可重复的培养方法非常必要。大鼠来源丰富，价格低廉，取材方便，探索大鼠主动脉内皮细胞的培养方法具有重要的意义。

目前较为常见的培养方法有酶消化法、机械刮取法、组织块贴壁法、瞬间热处理植环法等[3-5]。本研究中发现:常用酶消化法有两种:1.在动脉腔内注入消化酶；2.将动脉内膜外翻，放入消化液中消化。大鼠主动脉直径细，不易将内膜翻出，且分支多，不易结扎封闭管腔，酶难以在血管内有效保留进行消化。此方法主要用于大血管内皮细胞的培养，操作复杂、技术要求较高，消化时间长短不易掌握。

机械刮取法:即在内膜外翻后借助剪刀或刀片刮取细胞。常与酶消化法结合。但大鼠动脉细，外翻过程中对内皮细胞损伤已较大，机械刮取后严重影响细胞活性，故培养效果不佳。

组织块贴壁法与平滑肌细胞培养方法相似[6]，将血管剪成1-2mm2小块，内膜向下贴壁于培养皿中，但易混杂平滑肌细胞降低细胞纯度；且将血管剖开剪碎的过程中易损伤细胞，较大的组织块在加培养液及移动培养皿过程中易漂浮，不易贴壁，而较小的组织块需更多的机械分割，对细胞的损伤作用大。

本研究最终选用的植环法具有相对简单、经济、细胞损伤少的优点。操作所需时间少，所需步骤少，可减少内皮细胞受到的损伤；不仅可利用内皮细胞迁出比非内皮细胞快的特点[7]纯化细胞，瞬间热处理法能显著减少成纤维细胞及血管平滑肌细胞混入生长的几率，提高细胞纯度。Diglio[8]等在动脉环培养血管形成实验中曾用70%乙醇固定血管外膜来纯化细胞。本实验中发现，由于大鼠主动脉分支多，乙醇易与血管内膜面相接触，会影响到内皮细胞活性。而瞬间热处理法使外膜细胞受抑制，血管内腔面没有直接暴露于热水中，且短时间内不致使热传导至血管内膜面，因此内皮细胞活性不受影响，而杂细胞的迁出率明显减低。

结论

本研究通过将大鼠主动脉外膜做瞬间热处理后再进行环块植入法获取血管内皮细胞，结果发现血管内皮细胞呈现接触性抑制的“鹅卵石”样特征，其标志物vWF 表达阳性，细胞纯度较高。此方法的优势在于:1.提高了细胞纯度。对动脉外膜做瞬间热处理后大大抑制了其他细胞如成纤维细胞等的混入。2.减低对内皮细胞的损伤:本方法无需酶的消化，无需机械刮取，大大减低了原代取材中对内皮细胞的损伤。3.降