抗体效价测定操作规程
ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤
ELISA法测定单克隆抗体的效价的操作步骤摘要：ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
找产品，上生物帮>> >>一、实验目的1、深入了解ELISA法测定抗体效价的原理。
2、掌握ELISA法测定单克隆抗体效价的方法。
间接ELISA效价图二、实验原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
免疫酶技术是将酶标记在抗体/抗原分子上，形成酶标抗体/酶标抗原，称为酶结合物。
该酶结合物的酶在免疫反应后，作用于底物使之呈色，根据颜色的有无和深浅，定位或定量抗原/抗体。
ELISA法是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都在其中进行。
在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也避免了末反应的游离抗体/抗原的分离步骤。
在ELISA法中。
酶促反应只进行一次，而抗原、抗体的免疫反应可进行一次或数次，即可用二抗(抗抗体)、三抗再次进行免疫反应。
目前常用的几种ELISA方法有：测定抗体的间接法，测定抗原的双抗体夹心法和测定抗原的竞争法等。
本实验采用间接法测定单克隆抗体效价。
其主要过程为：首先将已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂蛋白质，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱终止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。
三、仪器、原料和试剂仪器聚苯乙烯96孔酶标板、微量移液管、酶联免疫阅读仪、水浴锅。
原料单克隆抗体试剂1、抗原及酶标记抗体①抗原：兔抗人IgG(RabbitAanti-humanIgG，CodeNo.A0423);②酶标抗抗体：兔抗鼠IgG-HRP(RabbitAnti-mouseIgG-HRP，CodeNo.P0260);均为DAKO公司产品，使用时按照说明书要求稀释。
母体IgG抗体效价检测卡操作规程
孕妇血清IgG抗体效价检测操作规程[样本要求]：血样标本最好采用EDTA抗凝（也可以用枸橼酸钠等抗凝），用血清代替血浆进行检测时，用前离心，2000g×10min，防止纤维蛋白干扰反应结果。
[样品准备]：试剂配制：用985ulPH7.4的PBS(或者生理盐水)溶解15ul二巯基乙醇（2-Me）,即为0.2M(2-Me)应用液,密封，避光，置2---6℃保存.红细胞标本的制备：用生理盐水配置红细胞悬液，红细胞最终浓度为1%左右.血清标本的制备：将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中,10分钟后离心取上清;或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中,4℃放置12小时,或37℃放置2小时后离心,2000Rpm,10分钟,取上清.该上清不得有絮状物或沉淀；[配套试剂]：孕妇IgG抗体效价卡，标准A、B、O红细胞（取决于父亲血型），0.2M(2-Me)应用液[实验步骤]1、试剂卡室温平衡，离心一次，标记编号；2、配制中和血浆：先取待检者血浆200微升与生理盐水600微升做4倍稀释，然后取稀释后的标本和0.2M巯基乙醇(2-Me)应用液各200ul，混匀，37℃孵育30---60分钟，（充分破坏标本中IgM类抗体）既得到孕妇的中和血浆。
34、在所有孔中加入50ul健康人O型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统以外IgG血型抗体)或所有孔中加入50ul健康人A型或B型1%红细胞悬液(测定孕妇ABO血型系统IgG血型抗体)，然后加入上述表格中稀释的中和血浆各50ul5、把加有血浆和红细胞的微柱卡置37 ℃专用孵育器孵育15分钟；6、用专用离心机离心5分钟（900r/min2分钟1500r/min3分钟）。
判定结果。
[结果判定]效价值：产生3+凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。
[参考值]1、RH系统抗体效价16有临床意义2、ABO系统抗体效价64有临床意义[注意事项]1.据文献报道微柱凝胶法检测出的母体效价值比常规聚凝胺和抗人球蛋白试管法高出1-2个滴度（根据P.L.Mollison所著教材《临床医学中的输血（Blood Transfusion in Clinical Medicine）》）2. 红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应。
BIOVUE母亲IgG效价测定操作规程
母亲IgG抗体（抗A/抗B）效价检测操作规程一、项目名称、检验方法名称1．项目名称：母亲IgG抗体（抗A/抗B）效价检测2．检验方法名称：柱凝集二、临床意义当母亲血清中存在高效价的IgG型抗A/抗B抗体时，其ABO血型不合胎儿有可能发生新生儿溶血。
母亲血清IgG型抗A/抗B抗体效价测定，有助于预测NHD的发生，因而可以指导临床对NHD进行相应的防治。
三、方法学原理ABO新生儿溶血症常见于母亲为O型的非O型的新生儿，是由于母体含有对抗新生儿血型抗原的IgG型抗A/抗B抗体，该抗体可以通过胎盘进入胎儿体内，从而破坏胎儿的红细胞。
因为人血清中的抗A/抗B抗体通常是IgM型的，要单独测定IgG型抗A/抗B抗体，必需先去除IgM的干扰，所以待检血清先用2-巯基乙醇（2-Me）预先处理，灭活IgM抗体，剩下的IgG型抗体则可通过间接抗人球蛋白试验进行检测。
经过孵育，IgG抗体先致敏A型/B型红细胞，预置在试剂柱中的抗人球蛋白再与IgG抗体的Fc段结合，形成桥连，致敏红细胞因桥连作用而出现凝集反应，经过离心处理，凝集的红细胞被阻隔在分离柱的上方而被判为阳性。
将经过2-Me预处理的待检血清进行倍比稀释，将出现阳性反应的最大稀释度血清的稀释度倒数作为血清抗体效价。
该试剂卡是基于柱凝集的原理而设计。
正常具有抗原的人红细胞将与相应的抗体发生凝集反应，BioVue血型诊断试剂卡的微柱中含有玻璃珠介质和试剂。
加入红细胞并将试剂卡离心后，发生凝集的红细胞会被阻挡在玻璃珠的上面，而未凝集的游离红细胞则会在离心力的作用下通过玻璃珠之间的间隙到达微柱的底部。
四、试剂卡品牌、代号、包装规格、内含物1．试剂卡品牌：美国强生奥索2．代号：BioVue －poly Cassettes3．包装规格：400卡/箱试剂卡(707300);100卡/箱试剂卡(707350)4．试剂成分：抗人球蛋白(lgG,C3b/C3d)检测卡有6根微柱组成，每一柱中含有缓冲液，其成分为牛血清蛋白，大分子增强剂以及0.1％叠氮钠，0.01M的EDTA.成分描述第1～6柱：抗人球蛋白、抗-lgG、-C3d;多特异性抗－lgG(兔)抗－C3b(鼠单克隆)(克隆F7G3) 抗－C3d(鼠单克隆)(克隆C4C7) FD＆C1＃蓝色染料FD＆C5＃黄色染料5．试剂的储存与效期：储存条件：2～25℃环境保存。
血型抗体效价测定标准操作规程(sop)
血型抗体效价测定标准操作规程一、目的为规范红细胞血型抗体效价测定的技术操作，保证结果的准确性从而为临床疾病的诊断和治疗做出正确的评估。
二、适用范围输血科负责红细胞血型抗体效价测定的技术人员。
三、原理：将受检血清（如检测IgG类红细胞血型抗体效价须先用巯基试剂裂解其中的IgM型抗体）经连续倍比稀释后与表达目标抗体对应的抗原红细胞试剂反应，以受检血清凝集试剂红细胞的最高稀释倍数的倒数作为受检血清中检测目标抗体的效价，同时根据“红细胞凝集强度与评分标准”评分。
四、步骤和方法（1）盐水介质法测定IgM类红细胞血型抗体效价1、排试管12支，编号，以第1支试管为原倍进行生理盐水倍比稀释受检血清，第12支试管为2048倍，稀释后容积定为100微升。
2、分别往12支试管加入3%目标抗体对应的抗原红细胞试剂50微升，轻摇混匀。
3、用专用离心机120g离心1min，观察有无溶血和凝集情况。
4、结果判断：镜检呈“1+”凝集的最高稀释倍数的倒数为目标抗体的效价，再根据“红细胞凝集强度与评分标准”评分。
（2）IgG类红细胞血型抗体效价测定1、取200微升受检血清加入0.2mol/L二巯基乙醇（2—Me）应用液200微升混匀，将试管口密封，37℃孵育30min。
2、排11支试管，编号，进行生理盐水倍比稀释2—Me处理过的血清。
由于第1支已经进行了稀释，所以第11支试管为2048倍，稀释后容积定为100微升。
3、凝聚胺法检测时，往11支试管加入3%目标抗体对应的抗原红细胞试剂50微升，轻摇混匀，按照凝聚胺法操作步骤进行试验。
4、抗球蛋白法测定时，往11支试管加入3%目标抗体对应的抗原红细胞试剂50微升，轻摇混匀后置37℃孵育30min后，按照抗球蛋白法操作步骤进行试验。
5、结果判断：镜检呈“1+”凝集的最高稀释倍数的倒数为目标抗体的效价，再根据“红细胞凝集强度与评分标准”评分。
（1）评分标准根据稀释血清各管凝集强度进行评分，凝集强度与评分标准为：4+为12分，3+为10分，2+为8分，1+为5分，+/-或W+为2分，阴性为0分，稀释各管评分之和为积分。
孕妇母体IgG抗体效价检测操作规程
孕妇母体IgG抗体效价检测操作规程【原理】新生儿溶血病HDN发生的主要原因在于母子血型不合，血型系统最主要的类型为ABO血型系统，本实验采用微柱凝胶检测孕妇血清中的抗A（B）IgG抗体效价。
【试剂】6%牛血清白蛋白；生理盐水；凝胶卡【标本采集】孕妇静脉血3毫升，肝素钠抗凝，孕妇爱人静脉血3毫升，肝素钠抗凝。
将孕妇标本制作成血清标本，孕妇爱人标本制成0.5%红细胞标本（用生理盐水洗涤后配制）。
本文来源于中华检验医学网【操作步骤】1．取孕妇血清标本50微升加入等体积的牛血清白蛋白，37度水浴温育30～60分钟；2．将血清倍比稀释成9管，依次为1：4、8、16、32、64、128、512、1024、2048管；3．将卡作好标记，在所有孔中加入经处理好的孕妇血清标本50ul；4．然后在所有孔中加入50ul的孕妇爱人0.5%红细胞标本；5．37度孵育15分钟（专用孵育箱）；6．专用离心机离心5分钟；900rpm2分钟，1500rpm3分钟；7．取出判定结果；【结果判定】阳性结果：红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中；阴性结果：红细胞完全沉降到胶底部，在凝胶管底部形成红细胞扣。
【结果报告】产生1+阳性凝集的最高稀释度，其倒数即为效价。
【注意事项】1．红细胞标本一定不能被细菌污染，否则出现假阳性反应，尽可能应用当日采集的新鲜血做本实验。
如不得不用过夜血或陈旧血，则必须首先用该标本做阴性对照试验，以确定该标本是否可以做本试验。
2．血清标本：血清标本必须充分去除纤维蛋白，否则标本中纤维蛋白在微柱凝胶中析出，阻碍红细胞沉淀，呈假阳性反应。
3．如在微柱凝胶中出现溶血现象，强烈提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所臻溶血，故对此标本一定认真分析，并向上级主管技术人员报告并讨论。
4．本凝胶卡价格不菲，成本较高，请您节约使用。
【临床意义】有人观察1632例孕妇血清中IgG抗A（B）≥1：64者249例；ABO-HDN发生率随IgG抗A（B）效价升高而上升；HDN与妊娠史的频率有关，随着年龄上升，孕妇个体IgG抗A（B）抗体效价也随之上升。
抗体效价检测步骤
抗体效价检测步骤抗体效价检测是一种常用的方法，用于评估抗体样品的质量和活性。
该检测可以确定抗体样品中所含抗体的浓度以及其与靶标结合的能力。
以下是抗体效价检测的一般步骤：1. 制备样品和控制组：首先需要准备抗体样品和相应的阳性和阴性对照物。
阳性对照物是对于靶标已知有高亲和力的抗体样品，而阴性对照物则是不包含任何抗体的样品。
2. 稀释样品：将抗体样品进行连续稀释，通常从高浓度开始，以便确定抗体效价的范围。
每一次稀释应按照一定比例进行，如1:2或1:10等。
3. 设置试验板：将稀释好的抗体样品、阳性和阴性对照物，以及含有靶标的试验物添加到试验板中的孔中。
每个样品应设置多个孔，以获得平均效价。
4. 孵育：将试验板置于孵化器中，在适当的温度和时间下进行孵育。
这有助于抗体与靶标结合，并形成固定复合物。
5. 洗脱：将试验板的孔洗脱干净，以去除未结合的抗体。
这可以通过重复洗涤孔中添加和去除缓冲液来实现。
6. 反应：加入检测抗体，这是一种能与固定复合物中的抗原结合的二抗。
检测抗体通常被标记，以便进行可视化。
典型的标记物包括酶，如辣根过氧化物酶（HRP），或荧光染料，如荧光素等。
7. 反应孵育：将试验板放回孵化器中，在合适的温度下进行孵育。
这有助于检测抗体与固定复合物结合，并形成更大的复合物。
8. 洗脱：类似于步骤5，洗涤试验板的孔，以去除未结合的检测抗体。
9. 可视化：根据检测抗体的标记物，对于酶标记的检测抗体可以加入亮色底物，并观察色素的产生。
对于荧光标记的检测抗体，则可以在荧光显微镜下直接观察发光信号。
10. 数据分析：根据样品和对照组的可视化结果，测定抗体效价。
通常使用半最大抗体效价（EC50）来表示抗体效价，即抗体浓度在50%时与靶标结合。
抗体效价检测是一个常见的实验技术，它在抗体研究和生物医学领域有着广泛的应用。
通过正确执行上述步骤，可以准确地确定抗体样品的效价和活性，进一步支持科研和临床应用。
elisa检测抗体效价
实验目的：实验材料：1、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、浓硫酸、Tween-20 、BSA等。
2、酶标抗小鼠IgG3、TMB溶液配制：1、抗原包被液：PH9.6的碳酸盐缓冲液（0.05 M）批号：称取：Na2CO3（分子量105.99） 1.59 gNaHCO3（分子量84.01） 2.9 g加蒸馏水至1000ml，调PH值。
滤膜（0.45 μm）过滤，4℃保存。
2、洗涤缓冲液(PBS-T) 批号：PBS缓冲液1000 mlTween-20: 0.5 ml调PH值至7.39。
滤膜（0.45 μm）过滤，室温保存或4℃保存。
3、封闭液（1.0% BSA/PBS-T）批号：洗涤缓冲液1000 mlBSA: 10 g现用现配。
4、血清稀释液(pH7.4 PBS)：0.0067 M(PO4+)5、洗涤用PBS (pH7.4), 0.15 M(PO4+) 批号：称取：NaCl8.0 gNa2HPO4·12H2O 2.9 gKH2PO40.2 gKCl0.2 g加蒸馏水至1000 ml，调PH值至7.39。
滤膜（0.45 μm）过滤，室温或4℃保存。
6、二抗稀释液：同洗涤缓冲液7、终止液：2M H2SO4批号：水90ml浓硫酸10.64ml浓硫酸逐滴加入水中，不断搅拌，防止局部过热。
4℃保存。
实验器材：1、1 ml枪头；200 μl枪头；10 μl枪头，。
2、1.5 ml EP管。
3、移液器1 ml、200 μl、100 μl、20 μl、10 μl、2 μl。
4、96孔板（costor，美国）。
5、电子天枰。
6、酶标仪（Labsystems DragonMK3，芬兰）。
7、洗板机（BIORAD MODEL 1575，美国）。
8、电子pH计（SevenEasy S20）。
方法步骤：1 包被抗原：用μg/ml 的蛋白包被，每孔100μl。
密封，4℃过夜。
2 洗板：取出预先4℃包被过夜的96孔板，用PBS-T洗液300 μl/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。
效价测定(精)
三、操作步骤
1、吸取受检者血清0.4ml，加2-Me应用 液0.4ml，混合，将试管口塞紧，置 37℃水浴中2h（充分破坏IgM类抗体）。 2、排列小试管（10mm×60mm）两排， 每排10支，第一排每管各加生理盐水 0.4ml。
3、第1排第1管加2-Me处理血清0.4ml， 混合，吸出0.6ml，移0.2ml至第2排第 1管内，其余0.4ml移入第1排第2管内， 混合。以此类推，作倍量稀释至第10 管， 每管内留有 1∶4, … 1:2048等 不同稀释度的血清各0.2ml。
• 也可使用二硫苏糖醇 （dithiothreitol,DTT）灭活IgM抗体， 以测定IgG抗体。DTT无恶臭味，反应快 速，但对强抗体灭活效果较差。
五、临床应用
• O型孕妇孕期内抗体水平的动态监测，预测 是否会发生ABO新生儿溶血病。
4、第1排每管各加5%A型红细胞悬液0.2ml， 第2排每管各加5%B型红细胞悬液0.2ml，置 37℃水浴温育1h。 5、结果观察：如在前几管内发现有红细胞 凝集者，是由于高效价IgG抗A(B)或IgA抗 A(B)所引起，称为“盐水效价”。
6、其余红细胞未见凝集的试管，再以生 理盐水洗涤3次，除去洗涤液，留取压实 红细胞。 7、每管各加生理盐水 2滴，混合。 8、每管各取1滴，分别移至另一排小试 管中，再各加抗人球蛋白血清1滴，混合。
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试验原理 试 剂 操作步骤 注意事项 临床应用
一、试验原理
失去与相应 红细胞凝集 的作用
IgM抗体 分子裂解 待检 血清
2-me (巯基 乙醇)
IgG抗体分 子不被灭活
保持血清学 特性(致敏相 应红细胞)
IgA抗体 分子部分 灭活
二、试剂
红细胞血型抗体效价测定标准操作规程
红细胞血型抗体效价测定标准操作规程本文介绍了红细胞血型抗体效价测定标准操作规程，以规范输血科医务科护理部的技术操作，并适用于评估母婴血型不合的新生儿溶血病的风险程度及产前检查等其他临床需要。
在材料和设备方面，需要3%～5%的A、B型反定型试剂红细胞、0.2 mol/L二巯基乙醇(2-Me)应用液、抗球蛋白试剂、待检者血标本、微柱凝胶抗球蛋白卡等。
在检测环境方面，室温应控制在18-27℃，湿度应控制在30%-70%。
在检测原理方面，对于IgM类红细胞血型抗体，将受检血清经连续倍比稀释后与表达检测目标抗体对应抗原的试剂红细胞反应，以受检血清凝集试剂红细胞的最高稀释倍数的倒数作为受检血清中检测目标抗体的效价，并根据“红细胞凝集强度与评分标准”评分，完成对IgM类红细胞抗体效价的测定。
对于IgG类红细胞血型抗体，则先用巯基试剂2-Me裂解其中的IgM型抗体，经巯基试剂2-Me处理后再测定IgG类红细胞血型抗体。
在操作步骤方面，盐水介质法测定IgM类红细胞血型抗体效价。
具体操作为将受检血清加入一系列稀释盐水中，分别加入A、B型反定型试剂红细胞，静置30分钟后观察凝集情况，以受检血清凝集试剂红细胞的最高稀释倍数的倒数作为受检血清中检测目标抗体的效价，并根据“红细胞凝集强度与评分标准”评分，完成对IgM类红细胞抗体效价的测定。
7.1.1.对12支试管进行排列编号，第2至第12管每管加入0.1ml生理盐水，第1管及第2管分别加入受检者血清0.1ml，混匀后吸出0.1ml移至第3管内，以此类推，连续倍比稀释至第12管（2048倍）。
7.1.2.在12支试管中，分别加入3%检测目标抗体对应抗原的试剂红细胞50μl，轻摇试管架。
7.1.3.使用血型血清学专用离心机进行离心，离心速度为120g，离心时间为1min，观察并记录有无溶血及凝集情况。
7.1.4.结果判读：镜检呈“1+”凝集的最高稀释倍数的倒数即为检查目标抗体的效价，根据“红细胞凝集强度与评分标准”进行评分。
抗体效价的Elisa测定实验步骤
60年代初期，Averameas & Ram等 建立了免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 利用特殊的交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白 蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体，统称为酶标记物或酶结 合物，用于抗原或抗体的示踪、定位或定量测定
抗体效价的Elisa测定实验步骤
petitive elisa same epitope Coat with bait pr Incubate with primary antibody anti bait pr and various
concentration prey protein
抗体效价的Elisa测定实验步骤
抗体效价的Elisa测定实验步骤
免疫标记技术
抗体效价的Elisa测定实验步骤
标记抗体或抗原
荧光素、放射性同位素、酶、 铁蛋白、胶体金及化学(或生物) 发光剂
镜检观察或进行自 动化测定
荧光显微镜，射线测量仪，酶标 检测仪，电子显微镜和发光免疫 测定仪等
直接在细胞、亚细胞、 应用各种液相和固相免疫
超微结构及分子水平上, 分析方法，对体液中的半
按“METHOD”键选择测试的波长类型（Single或Dual）、波 长大小(340、405、450、490或630nm)、微孔板类型(96孔、 48孔或24孔)。
按 “ MAP” 键 选 择 阅 读 方 式 ( Auto 或 Manual) 、 阅 读 方 向 （Down或Across）、重复方向（Down或Across）、阅读起 始 位 置 （ 输 入 编 号 ） 、 空 白 Map （ Air 、 Full 、 Const 、 Column、P-Down、P-Across）。
ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程
ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程（编号：033）1、目的及适用范围该SOP用于规范利用ELISA方法检测制备抗体的标价的操作。
2、主要仪器及试剂离心机、冰箱、37℃恒温箱、酶标仪、洗板机、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液、0.2M Na2HPO4、0.1 M 柠檬酸、0.1 M EDTA、A、B底物反应液、终止液、HRP标记二抗（ELISA效价1:10000-100000）3、操作步骤3.1 目的蛋白的纯化；3.2 免疫兔子或小鼠；3.3 采集免疫动物的血清；3.4 抗原包被，每孔包被抗原50-200ng，4℃包被过夜或37℃包被5h；3.5 用封闭液37℃封闭3h或4℃封闭过夜，然后用PBST洗涤3次，每次2min；3.6 将抗体（免疫血清）和阴性血清分别按1:1000，1:2000，1:5000，1:10000和1:50000稀释后，每孔加入50μL，37℃温育45min，用PBST洗涤5次；3.7 加入相应的HRP标记二抗，37℃温育30min，用PBST洗涤5次；3.8 每孔分别加入50μL A液和B液，然后每孔加入50μL终止液；3.9 测定其A450nm，如果样品孔与阴性对照孔A450nm比值大于2.1最高稀释倍数为抗体效价。
3.10 抗体效价评定：一般来说，用重组蛋白作为抗原免疫动物所得到的免疫血清，其ELISA效价应不低于1:5,000。
为了能更充分验证制备抗体的效价及特异性，最好是联合Western-blot及IFA 等方法一起来检测制备抗体的效价及特异性。
4、注意事项4.1免疫抗原选择要点4.1.1尽量选择标签比较小的载体来纯化目的蛋白，而且在克隆目的基因时尽量去除载体序列。
如可以选择PET-30a载体(His标签)作为表达载体时，尽量选择Nde I/Xho I这两个酶切位点来克隆目的基因。
4.1.2重组蛋白纯度应不低于90％。
一般来说，纯度在90％以上的蛋白，取10μg电泳，在SDS-PAGE 胶上应基本看不到杂带。
抗体效价滴定操作规程
抗体效价滴定操作规程抗体效价是衡量抗体活性和浓度的重要指标，在医药研究和临床应用中有着广泛的应用。
抗体效价滴定操作规程是对进行抗体效价测定的步骤和方法进行规范和描述的文件，下面是一个关于抗体效价滴定操作规程的示例，包括前期准备、试验步骤和结果判定等内容。
一、前期准备1.阅读相关文献和实验说明书，了解抗体效价滴定的原理和方法。
2.了解实验所需物品清单，准备好所需的试剂、试管、移液器等实验器材。
3.检查实验设备，确认设备处于正常工作状态。
4.准备好质控抗体和待测抗体溶液，并按实验要求进行稀释。
二、试验步骤1.根据实验要求，将待测抗体和质控抗体分别加入试管中。
2.通过稀释系列将质控抗体稀释为一系列不同浓度的溶液。
3.充分混匀待测抗体和质控抗体溶液，保证溶液均匀。
4.将待测抗体和质控抗体溶液放置于室温，使其达到相同的温度。
5.取一组试管，依次加入相同体积的质控抗体溶液和待测抗体溶液，混匀后，在每个试管中加入适量的相同抗原。
6.将试管放置于恒温箱或洗涤器中，进行适当的培养时间，使抗原和抗体充分反应。
7.取出试管，加入适量的二抗或底物，并根据实验要求，进行适当的显色反应。
8.根据显色反应的颜色深浅和强度，判断抗体效价的高低。
9.计算抗体效价的对数，确定抗体效价。
三、结果判定1.根据检测结果，得出相应的抗体效价，记录在实验记录表中。
2.将实验结果进行统计和分析，确定最终的抗体效价。
3.根据实验结果，进行抗体效价滴定的质控和质量保证。
四、实验安全1.在操作过程中，注意安全操作，避免溶液的直接接触和飞溅。
2.使用刀片或针头等锐利物品时，要特别注意安全，防止划伤和刺伤。
3.遵守实验室的安全规定，佩戴实验室服装和防护设备，保证实验操作的安全性。
五、实验记录和数据处理1.记录实验过程中的各个步骤和操作细节，包括使用的抗体和试剂名称、溶液浓度和体积等。
2.记录显色反应的颜色深浅和强度，以及操作过程中的问题和异常情况。
3.对实验结果进行统计和分析，计算抗体效价的平均值和标准偏差，并进行结果的合理解释和讨论。
血清效价检测
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血清效价检测
一、技术说明
抗体效价测定是指测定抗体的物理状态及其在体内的滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。
本实验是采用间接ELISA检测血清效价。
二、技术原理
利用酶标记的抗体以检测已与固相结合的受检抗体。
三、技术流程：
（一）实验准备
（1）实验材料：免疫抗原
（2）试剂和耗材：1x PBS（pH7.2)：8gNaCl,0.2g KCl,3.62gNa2HPO4.12H2O, 0.24g KH2PO4定容至1L；BSA、PBST、HRP标记羊抗鼠二抗、TMB、1M HCl、酶标板。
（3）仪器和设备：恒温培养箱、酶标仪
（二）实验步骤
（1）抗原包被：抗原(PBS稀释，终浓度2μg/mL，100μL/孔)，4℃包被过夜。
（2）封闭：2%BSA(150Μl/孔)，37℃封闭2h。
（3）一抗孵育：血清首孔稀释1000倍后逐级稀释3倍梯度（PBS稀释，100μL/孔），37℃孵育1h，PBST洗5次，每次150μL。
（4）二抗孵育：加入对应二抗（Goat-anti-mouse-IgG-HRP，1%BSA稀释，100μL/孔）37℃孵育1h，PBST洗5次，每次150μL。
（5）显色：加入TMB100μL,室温避光显色10min。
（6）终止读数：加入100μl/孔1M HCl，终止反应，OD450读数。
14.血清效价滴定操作规程
血清效价滴定操作规程文件编号XN-XK-SXK-005第二版共3页生效日期年月日编写者：审批者：复审人：复审日期：医务科保管者：（签名）检验科主任：（签名）输血科：（签名）1.目的抗体效价测定主要用于鉴定标准血清效价、患者血清抗体检测、血清试剂的稀释及室内质量控制等。
2.原理将被检抗血清用生理盐水作倍比稀释，加入一定量的抗原红细胞，观察凝集强度。
以抗体稀释后能与抗原红细胞出现肉眼明显可见凝集的最高血清稀释倍数的倒数来表示抗体的效价。
3.操作步骤3.1.取清洁干燥小试管10支，每管各加生理盐水0.2 ml。
3.2.第1管加被检血清0.2ml，用吸管将第1管溶液吸放3次，使之混匀，吸0.2ml至第2管，依次连续稀释至第9管，混匀后弃去0.2ml。
第10管不加血清，作为盐水对照。
3.3.每管加入相应2％红细胞悬液0.2ml。
3.4.将试管架振摇使混和，置15ºC～20 ºC室温1h（或1000r/min离心1min），用肉眼观察结果，成弱凝集反应的最高稀释倍数的倒数即为该抗体的效价。
对照管应无凝集现象。
4.结果判断4.1.一般盐水凝集试验可立即观察，或置室温一小时观察结果。
4.2.冷凝集素效价要置4℃冰箱一小时观查结果。
4.3.若出现低稀释凝集强度比比高稀释强度要强，说明有前带现象发生。
4.4.对一份血清重复滴定，结果可能不一样，如果只有一个稀释度的差别，是正常误差范围。
5.注意事项5.1.稀释操作是要准确，避免稀释不匀出现跳管现象。
5.2.离心后试管内上清夜出现溶血外观表明不仅有抗原抗体反应，而且有补体激活，有重要临床意义。
5.3.稀释液的容量越小，可能产生的误差越大。
如果可能，可以增加稀释容量。
5.4.如果一中血清分别和几种红细胞作用，要将血清做稀释，然后分别取相同的量到几个试管中，以减少误差。
5.5.应以效价和积分评价血清抗体的质和量。
红细胞凝集强度与积分见表1-1；6.正常范围抗A效价应不低于128，抗B效价不低于64。
抗d效价操作方法
抗d效价操作方法
抗D效价是指人体血清中对D型众人血细胞溶血原性抗体的活性水平。
以下是抗D效价操作方法：
1. 标本采集：采集患者静脉血标本，并将其离心分离血清。
2. 制备D型众人血细胞：使用带有辅助试剂的普通红细胞试剂盒来制备D型众人血细胞。
3. 稀释血清：使用稀释试剂盒来稀释血清，以获得不同浓度的患者血清。
4. 制备荧光标记抗人球蛋白：制备荧光标记抗人球蛋白，并将其加入测试板。
5. 加入样品和细胞：将稀释后的血清样品和制备好的D型众人血细胞加入测试板中进行反应。
6. 分析结果：将测试板放入荧光显微镜中进行观察，并根据荧光值和血清浓度确定抗D效价。
注：以上操作应使用专业人员进行，并严格按照试剂盒说明操作。
抗体效价实验
加蒸馏水至1000mL，调节pH值。滤膜（0.45um）过滤，4℃保存。
2、洗涤缓冲液（PBS-T）
PBS缓冲液：1000mL
Tween-20：0.5mL
调节pH值至7.39。滤膜（0.45um）过滤，室温保存或4℃保存。
3、封闭剂（1.0%BSA/PBS-T）
洗涤缓冲液：1000mL
BSA：10
现配现用
4、抗体稀释液：（pH7.4PBS）：0.0067M PO4+
5、洗涤用PBS（pH 7.4）：0.15M PO4+
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
氯化钠：8.0g
十二水磷酸氢二钠：2.9g
磷酸二氢钾：0.2g
氯化钾：0.2g
加蒸馏水至1000mL，调节pH值至7.39。滤膜（0.45um）过滤，室温或4℃保存。
6、二抗稀释液：同5。
7、终止液：2M H2SO4
水：90ml
浓硫酸：10.64mL
浓硫酸逐滴加入水中，不断搅拌，防止局部过热。4℃保存。
实实验验步步骤骤 1、包被抗原： 用5ug/ml的抗原蛋白包被，每孔100uL。37℃包被1小时。 2、洗板： 取出包被好的96孔板，用PBS-T洗液300uL/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。 3、封闭： 每孔加入封闭液 300 uL/孔。封膜， 37℃放置 1 h。 4、洗板： 用PBS-T洗液300uL/孔洗板5次，每次轻轻振荡，拍干。 5、加一抗：抗体浓度：1ug/mL 96孔板上抗体稀释倍数为：1：10；1：20；1：40；1：80；1：160；1：320；1：640；1：1280，共8个稀释梯 度，具体操作如下：
底物显色液TMB直接使用，注意避光放置。100uL/孔，37℃避光放置，约10-20分钟。 10、终止反应： 终止液2M H2SO4，100uL/孔。 11、测OD值： 5分钟内在酶标仪上震荡后读数，检测波长450nm。
血小板血型抗体效价测定标准操作规程
血小板血型抗体效价测定标准操作规程
一、前言
本标准操作规程适用于血小板血型抗体效价测定，涉及试剂、设备和实验室环境，操作前请认真阅读本规程。
二、试剂和设备
2.1 试剂
- 血型抗体
- 洗涤缓冲液
- 血小板悬液
- 补体
2.2 设备
- 微孔板
- 分光光度计
- 震荡器
- 离心机
三、实验过程
3.1 血型抗体的制备
将所选血型抗体加入洗涤缓冲液中制备所需浓度的血型抗体液。
3.2 血小板的制备
- 将新鲜血样静置30分钟并分离血浆。
- 用等体积生理盐水和血浆混合，离心沉淀。
- 将沉淀洗涤后悬于与洗涤缓冲液等体积的悬液中。
3.3 试板的制备
- 将血小板悬液加入微孔板中。
- 加入血型抗体液，震荡孵育。
- 加入补体，震荡孵育。
3.4 分光光度测定
将微孔板中样品吸到分光光度计中，读取相应吸光度值。
四、质量控制
- 实验过程中需要进行质量控制，确保实验结果的可靠性和准
确性。
- 不同血型抗体的效价应随同测定，作为正质量控制。
- 反应前，正、负血小板悬液应与已知效价的血型抗体进行配对，作为负质量控制。
五、结果解释
- 样品吸光度值×换算系数 = 抗体效价换算系数 = 抗体效价
- 换算系数可以查看单位决策。
六、结论
按照本规程的操作方法进行，可得到可靠、准确、稳定的血小板血型抗体效价测定结果。
抗体效价测定操作规程
抗体效价测定操作规程 Hessen was revised in January 2021抗体效价测定操作规程操作步骤：一．IgG类1.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200μL加等体积2—Me溶液混合，封口，置37℃水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清600L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。
（如待检血清抗体为抗A，则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B，则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B，则倍量稀释两份血清，一份加入A型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1液3d，混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法，然后判读结果。
通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点，终点血清稀释度的倒数为效价（Titer），或称滴度。
二．IgM1.血清连续倍量稀释法先稀释血清：100L病人血清+700L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
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抗体效价测定操作规程
操作步骤：
一．IgG类
1.IgG类抗体效价滴定，须取适量血清200µL加等体积2—Me溶液混合，封口，置37℃水浴箱作用60分钟，先稀释血清：200L病人血清600L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，在第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。
（如待检血清抗体为抗A，则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B，则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B，则倍量稀释两份血清，一份加入A型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）
3.先直接观察离心结果，之后在每管分别加入凝聚胺试剂盒中的R1液3d，混合30S均匀后，在各加R2液2滴，操作方法同凝聚胺交叉配血法，然后判读结果。
通常以肉眼观察到的第一个“±”的凝集管作为判断的终点，终点血清稀释度的倒数为效价（Titer），或称滴度。
二．IgM
1.血清连续倍量稀释法先稀释血清：100L病人血清+700L生理盐水备用，排列6支试管按顺序编号。
第二管开始到第六管加样枪各加生理盐水200L，第一管和第二管中各加入稀释血清200L，第二管混匀后移出200L转至第三管，以同样操作第六管，从第六管吸出200L暂时保留在另一试管中（可做为第七管），以备必要时作进一步稀释。
这样从第一管到第六管的血清稀释度依次是1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256。
2.加红细胞悬液（自配红细胞悬液同反定型试剂）每管各加2％相应红细胞悬液200L，混匀。
（如待检血清抗体为抗A，则加入A型标准红细胞悬液；如待检血清抗体为抗B，则加入B型标准红细胞悬液；如待检血清中既有抗A又有抗B，则倍量稀释两份血清，一份加入A型标准红细胞悬液，另一份加入B型标准红细胞悬液；）
三．此类为IgM类盐水抗体可立即离心后观察。