生物监测技术技术

生物检测技术重点及习题

1、某家食品厂生产的肉馅饺子中怀疑有肠出血性大肠杆菌（EHEC,O157-H7）存在，请简述检验步骤，（在检测手段中应包含生化，分子生物学，免疫学，等检测方法）

1.取饺子馅制成溶液，并将此溶液涂布在山梨醇-麦康凯琼脂平板上，35摄氏度，孵育18-24h。

2.若出现红色，中等大小菌落，则可初步判定可能含有出血性大肠杆菌，将该菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨液体培养基中，35℃孵育48-96h，于5ml培养基中加入5-6滴甲基红，若出现红色，则可能为大肠埃希菌，

3.分离纯化菌液，然后用抗体-抗原-酶标抗体进一步检测其抗原特异性，根据其结果判定是否为出血性大肠杆菌，

4.将菌体，离心纯化，制备菌悬液，提取DNA并纯化，对DNA进行PCR扩增，然后测序，与EHEC,O157-H7进行比对，最终确定其菌种。

2、间接酶联免疫吸附试验原理与步骤：间接法主要用于检测抗体，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的待测抗体。首先用特异性抗原包被固相载体，加入含待测抗体的样品，使之与固相抗原结合，再加入酶标记的第2抗体，使之与待测抗体结合；反应后再加入底物显色，颜色的深浅与标本中待测抗体的量成正比。此方法的特点是只需一种酶标记的第2抗体就可以检测多种抗体，因而在临床中广泛用于检测各种感染性疾病的抗体；缺点是易受到标本中多种物质的干扰而产生假阳性反应。

3、补体结合试验的反应原理：补体结合试验有5种成分参与反应，分属于3个系统，1.反应系统，2.补体系统，3.指示系统。其中反应系统（抗体与抗原）与指示系统（绵羊红细胞与溶血素）争夺补体系统，如先加入反应系统和补体，给其以优先结合补体和机会，如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则，抗原抗体发生反应后可结合补体，再加入指示系统，由于反应中无游离的补体，而不出现溶血，为补体结合试验阳性，如待测系统中不存在待检测的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体，当加入指示剂时会出现溶血，为补体结合试验阴性。

4、介绍四种荧光定量PCR原理：

SYBR Green I 原理：SYBR Green I 是一种结合于小沟中的一种双链DNA结合燃料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强，在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I 荧光染料，SYBR染料特异性的接入DNA双链后，发射强荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子仅有微弱的荧光信号背景，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加同步。

Taq man法：杂交探针的5'端标记有报告基因，3'端标记有荧光淬灭基因，当探针完整，报告基因所发射能量被荧光淬灭基因吸收，无荧光，当TAQ 酶有5'到3'外切核酸酶活性，可水解探针，使报告基因与荧光淬灭基因分开，报告基因发出的荧光不能被荧光淬灭基因吸收，而能检测出荧光。

分子新标法：当无目标核酸序列时，荧光分子和淬灭分子距离近，荧光分子发出的能量，被淬灭分子吸收并以热能消耗，不发荧光，当有目标核酸序列时，中间的环序列与目标核酸序列结合，荧光分子和淬灭分子距离远，此刻，淬灭分子不能吸收荧光分子能量，可以检测到荧光。

5、IMViC试验及其应用：

I、吲哚试验：原理：有些细菌有色氨酸酶，能分解色氨酸产生吲哚，吲哚对对二氨基苯甲醛形成红色的玫瑰吲哚，应用于肠杆菌科的鉴别。

M、甲基红试验原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸，乙酸，和琥珀酸等，培养基PH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色，应用于肠杆菌科内某些种属的鉴别。

V、V.P.试验原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力，某些细菌，如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇，在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含有胍基的物质结合形成红色化合物，应用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。

C、柠檬酸盐试验：某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源而在此培养基上生长并分解柠檬酸盐为碳酸钠，使培养基变为碱性，若用溴麝香草酚蓝指示剂，斜面出现菌落或菌苔，培养基变蓝色为阳性，无菌落生长，培养基为绿色为阴性。

免疫学检测技术

抗原：能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物在体内外发生特异性反应的物质。这两种性质同时具备的抗原称为完全抗原，只有反应原性而没有免疫原性的称为半抗原。

抗体：是机体免疫系统受抗原刺激后产生的特异性球蛋白，称为免疫球蛋白，由遗传基因决定的所产生的抗体称为天然抗体，由抗原激发免疫细胞产生的抗体称为免疫抗体。人工制备的抗体有：单克隆抗体，多克隆抗体，基因工程抗体。

多克隆抗体：病原体或病原体相关抗原分子刺激机体产生的相关抗体分子是针对多种抗原决定簇的混合抗体，即多克隆抗体。

单克隆抗体：从一个克隆细胞系产生的抗体称为单克隆抗体。

多克隆抗体的制备：1、动物的选择：家兔，山羊，绵羊，豚鼠，马等。2、抗原种类的选择，3、抗原剂量的选择。4、佐剂的应用：福氏佐剂，脂质体佐剂，氢氧化铝佐剂，5、免疫途径：皮下，皮内，肌肉，静脉，淋巴结等不同途径注入抗原进行免疫。6、多克隆抗体的提取：心脏穿刺，颈静脉或颈动脉放血，待血液凝固后离心沉淀，分离出血清，加0.1%的叠氮钠作为防腐剂。7、抗血清鉴定。

8、抗血清保存。灭活补体后加入适量的防腐剂（叠氮钠0.1%，硫柳汞0.01%），冷冻干燥后保存。

单克隆抗体的制备：1、动物免疫。2、杂交瘤选择，3、细胞培养4、细胞融合5、筛选克隆培养。6、杂交瘤阳性克隆的克隆化，7、McAb的制备。8、McAb的鉴定。9、杂交瘤细胞株的冷冻保存和复苏。

直接凝集试验：颗粒型抗原与相应的特异性抗体混合，经过一定的反应时间后，出现凝集现象，称为凝集反应，试验中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。间接凝集试验：将可溶性抗原或抗体吸附在一种与免疫无关的惰性载体颗粒表面，然后与相应抗体或、抗原结合，在电解质存在的条件下，载体颗粒被动地发