基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶

2010-11-8
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叶亚新
三. 限制性内切酶的定义、命名 限制性内切酶的定义、
定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II II型限 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限 制酶。 制酶。 命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、 2. 命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、菌系编 分离顺序。 号、分离顺序。 例如： 例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H. 表示菌系为ｄ型血清型； influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离 表示分离 到的第三个限制酶。 到的第三个限制酶。 EcoRI Escherichia coli RI RI— HindⅢ Haemophilus influensae d Ⅲ dⅢ— SacI (II) Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) (II)—
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四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ
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影响限制酶消化DNA的若干因素
酶反应条件的影响
一般酶的反应条件： 一般酶的反应条件 37 PH 7.2 PH：7.2 温度：37℃ 完全消化 DNA酶切反应
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第二节 天然DNA的制备
天然DNA的来源
染色体DNA、病毒和噬菌体DNA、质粒DNA、 线粒体和叶绿体DNA
天然DNA的提取
准备生物材料 裂解细胞 分离和抽提DNA
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限制性核酸内切酶和DNA DNA片断化 第三节 限制性核酸内切酶和DNA片断化
EcoRI
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四．限制酶的特点
３） 平齐末端 SmaI 5’-CCCGGG5 -CCCGGG-3’ 5’-CCC 3’-GGGCCC-5’ -GGGCCC3’-GGG ４）非互补的粘性末端 ａ）切点在识别顺序之外的 切点在识别顺序之外的， ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5 -GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(Ｎ)95’-GGATG(N)9 3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ -CCTAC(Ｎ)133’-CCTAC(N)13 ｂ）能识别简并顺序的 能识别简并顺序的， ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5’-CPyCGPuG5 -CPyCGPuG-3’ CCCGGG; CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG GGGGGG-3’ CCCCCC-5’
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The top half of the figure shows computer-generated space-filling models of B-DNA, A-DNA, and Z-DNA.
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第二章 基因克隆所需的工具酶
第一节 DNA的组成和结构 DNA的组成 DNA的空间结构 DNA复制起始点和复制子的结构 DNA转录启动子和转录区的结构
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Chemical structures of the pyrimidines and purines that serve as the nitrogenous bases in RNA and DNA (b)Chemical ring structures of ribose and 2-deoxyribose, which serve as the pentose sugars in RNA and DNA respectively.
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常用限 制性内 切酶种 类及特 性
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6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
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限制性核酸内切酶作用机制
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二、限制Baidu Nhomakorabea核酸内切酶作用机制
The restriction enzyme EcoRI recognizes and binds to the palindromic nucleotide sequence GAATTC.
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6、限制性内切酶的星号活性
引起星号活性的可能因素
甘油浓度过高 离子强度不合适 阳离子的变化 溶液中PH值的变化
在基因工程操作中， 在基因工程操作中，应避免星号反应的出 现
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二、限制酶的使用方法
用限制酶消化DNA（酶切）是基因工程最 基本的实验技术 最常用的消化条件： 反应体积：20ul 10xBuffer：2ul DNA浓度：0.5—1.0ul
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Structures and names of the nucleosides and nucleotides of RNA and DNA.
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Linkage of two nucleotides by the formation of a C-3—C-5’ (3'-5’) phosphodiester bond, producing a dinucleotide. (b) Shorthand notation for a polynucleotide chain.
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四．限制酶的特点
３）对称性—双对称 对称性 双 5’C5 -G A A T T C-3’ G3’-C T T A A G-5’ 切点大多数在识别顺序之内， ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 限制酶切后产生两个末端，末端结构是５ ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ 2. 末端种类 端突起，个数为２ １）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAGG5 -CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ ACGTC3’-GACGTC-5’ -GACGTC3’-G ACGTC-5’ 端突起，个数为２ ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5 -GAATTC-3’ 5’-GAATTCPAATTC5’-GOH PAATTC-3’ HOG3’-CTTAAG-5’ -CTTAAG3’-CTTAAP HOG-5’
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五. 异源同序酶（isoschizomer， 异源同序酶（isoschizomer， 同裂酶） 同裂酶）
定义： 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两 种或多种限制 酶 特点： 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C GGTAC Asp718 G GTACC GTACC SstI CCGC SacI CCGC GG CCGC CCGC GG
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A demonstration of the multiple origins of replication along a eukaryotic chromosome
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Generalized model of semiconservative replication of DNA.
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影响限制酶消化DNA的若干因素
酶浓度的影响 1 酶单位：是指在最适条件下完全消化1ug dsDNA所需要的酶量 用酶量过多，带进的杂质愈 多，有可能增加Dnase 1的危险
酶切设计时，甘油浓度不要超过5 酶切设计时，甘油浓度不要超过5％
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二、限制酶的使用方法
1、影响限制酶消化DNA的若干因素
DNA的纯度的影响 DNA浓度的影响 酶浓度的影响 酶反应条件的影响 双酶消化
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影响限制酶消化DNA的若干因素
DNA的纯度的影响
限制酶作用于纯度不高的DNA时，会进行不 完全酶解（部分酶切）
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列．并使每条链的一个磷酸二酯 键断开的内脱氧核糖核酸酶 一 . 限制性内切酶的发现 1. 细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的发现 H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。 3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
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二、限制修饰系统的种类
specificity pecificity） for DNA restriction modification and specificity）位于染 色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM 色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、 ATP 腺苷甲硫氨酸）。 （５—腺苷甲硫氨酸）。 腺苷甲硫氨酸 II型 限制与修饰基因产物独立起作用， 2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种 基因位于质粒上。 基因位于质粒上。 III型 修饰酶与Ｉ型酶相同， 3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成 一亚单位，限制酶是独立存在的。 一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核 苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。 苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。 由三个基因构成， 1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host
RNA或其他DNA的污染影响小 蛋白质污染并与DNA结合后，可能降低或终止 酶切反应
解决办法：用酚和氯仿抽提除去蛋白质
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影响限制酶消化DNA的若干因素
DNA的浓度的影响
DNA浓度过高
带进更多的杂酶和杂质 如限制酶量不足，可能引起部分酶切 底物浓度过高，可能引起底物抑制