基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶
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2010-11-8 苏州科技学院生物系 叶亚新
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
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叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
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四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列．并使每条链的一个磷酸二酯 键断开的内脱氧核糖核酸酶 一 . 限制性内切酶的发现 1. 细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的发现 H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。 3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。
2010-11-8苏州科技学院生物系叶源自新6、限制性内切酶的星号活性
引起星号活性的可能因素
甘油浓度过高 离子强度不合适 阳离子的变化 溶液中PH值的变化
在基因工程操作中， 在基因工程操作中，应避免星号反应的出 现
2010-11-8 苏州科技学院生物系 叶亚新
二、限制酶的使用方法
用限制酶消化DNA（酶切）是基因工程最 基本的实验技术 最常用的消化条件： 反应体积：20ul 10xBuffer：2ul DNA浓度：0.5—1.0ul
RNA或其他DNA的污染影响小 蛋白质污染并与DNA结合后，可能降低或终止 酶切反应
解决办法：用酚和氯仿抽提除去蛋白质
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影响限制酶消化DNA的若干因素
DNA的浓度的影响
DNA浓度过高
带进更多的杂酶和杂质 如限制酶量不足，可能引起部分酶切 底物浓度过高，可能引起底物抑制
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限制性核酸内切酶作用机制
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二、限制性核酸内切酶作用机制
The restriction enzyme EcoRI recognizes and binds to the palindromic nucleotide sequence GAATTC.
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五. 异源同序酶（isoschizomer， 异源同序酶（isoschizomer， 同裂酶） 同裂酶）
定义： 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两 种或多种限制 酶 特点： 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C GGTAC Asp718 G GTACC GTACC SstI CCGC SacI CCGC GG CCGC CCGC GG
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Structures and names of the nucleosides and nucleotides of RNA and DNA.
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Linkage of two nucleotides by the formation of a C-3—C-5’ (3'-5’) phosphodiester bond, producing a dinucleotide. (b) Shorthand notation for a polynucleotide chain.
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The top half of the figure shows computer-generated space-filling models of B-DNA, A-DNA, and Z-DNA.
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影响限制酶消化DNA的若干因素
酶浓度的影响 1 酶单位：是指在最适条件下完全消化1ug dsDNA所需要的酶量 用酶量过多，带进的杂质愈 多，有可能增加Dnase 1的危险
酶切设计时，甘油浓度不要超过5 酶切设计时，甘油浓度不要超过5％
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二、限制酶的使用方法
1、影响限制酶消化DNA的若干因素
DNA的纯度的影响 DNA浓度的影响 酶浓度的影响 酶反应条件的影响 双酶消化
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影响限制酶消化DNA的若干因素
DNA的纯度的影响
限制酶作用于纯度不高的DNA时，会进行不 完全酶解（部分酶切）
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四．限制酶的特点
３）对称性—双对称 对称性 双 5’C5 -G A A T T C-3’ G3’-C T T A A G-5’ 切点大多数在识别顺序之内， ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 限制酶切后产生两个末端，末端结构是５ ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ 2. 末端种类 端突起，个数为２ １）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAGG5 -CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ ACGTC3’-GACGTC-5’ -GACGTC3’-G ACGTC-5’ 端突起，个数为２ ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5 -GAATTC-3’ 5’-GAATTCPAATTC5’-GOH PAATTC-3’ HOG3’-CTTAAG-5’ -CTTAAG3’-CTTAAP HOG-5’
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三. 限制性内切酶的定义、命名 限制性内切酶的定义、
定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II II型限 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限 制酶。 制酶。 命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、 2. 命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、菌系编 分离顺序。 号、分离顺序。 例如： 例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H. 表示菌系为ｄ型血清型； influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离 表示分离 到的第三个限制酶。 到的第三个限制酶。 EcoRI Escherichia coli RI RI— HindⅢ Haemophilus influensae d Ⅲ dⅢ— SacI (II) Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) (II)—
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第二节 天然DNA的制备
天然DNA的来源
染色体DNA、病毒和噬菌体DNA、质粒DNA、 线粒体和叶绿体DNA
天然DNA的提取
准备生物材料 裂解细胞 分离和抽提DNA
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限制性核酸内切酶和DNA DNA片断化 第三节 限制性核酸内切酶和DNA片断化
叶亚新
影响限制酶消化DNA的若干因素
酶反应条件的影响
一般酶的反应条件： 一般酶的反应条件 37 PH 7.2 PH：7.2 温度：37℃ 完全消化 DNA酶切反应
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A demonstration of the multiple origins of replication along a eukaryotic chromosome
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Generalized model of semiconservative replication of DNA.
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二、限制修饰系统的种类
specificity pecificity） for DNA restriction modification and specificity）位于染 色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM 色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、 ATP 腺苷甲硫氨酸）。 （５—腺苷甲硫氨酸）。 腺苷甲硫氨酸 II型 限制与修饰基因产物独立起作用， 2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种 基因位于质粒上。 基因位于质粒上。 III型 修饰酶与Ｉ型酶相同， 3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成 一亚单位，限制酶是独立存在的。 一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核 苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。 苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。 由三个基因构成， 1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host
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第二章 基因克隆所需的工具酶
第一节 DNA的组成和结构 DNA的组成 DNA的空间结构 DNA复制起始点和复制子的结构 DNA转录启动子和转录区的结构
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Chemical structures of the pyrimidines and purines that serve as the nitrogenous bases in RNA and DNA (b)Chemical ring structures of ribose and 2-deoxyribose, which serve as the pentose sugars in RNA and DNA respectively.
EcoRI
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四．限制酶的特点
３） 平齐末端 SmaI 5’-CCCGGG5 -CCCGGG-3’ 5’-CCC 3’-GGGCCC-5’ -GGGCCC3’-GGG ４）非互补的粘性末端 ａ）切点在识别顺序之外的 切点在识别顺序之外的， ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5 -GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(Ｎ)95’-GGATG(N)9 3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ -CCTAC(Ｎ)133’-CCTAC(N)13 ｂ）能识别简并顺序的 能识别简并顺序的， ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5’-CPyCGPuG5 -CPyCGPuG-3’ CCCGGG; CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG GGGGGG-3’ CCCCCC-5’
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
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6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
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四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列．并使每条链的一个磷酸二酯 键断开的内脱氧核糖核酸酶 一 . 限制性内切酶的发现 1. 细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。 2. 限制酶HindII的发现 H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H. influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。 3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制 D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。
2010-11-8苏州科技学院生物系叶源自新6、限制性内切酶的星号活性
引起星号活性的可能因素
甘油浓度过高 离子强度不合适 阳离子的变化 溶液中PH值的变化
在基因工程操作中， 在基因工程操作中，应避免星号反应的出 现
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二、限制酶的使用方法
用限制酶消化DNA（酶切）是基因工程最 基本的实验技术 最常用的消化条件： 反应体积：20ul 10xBuffer：2ul DNA浓度：0.5—1.0ul
RNA或其他DNA的污染影响小 蛋白质污染并与DNA结合后，可能降低或终止 酶切反应
解决办法：用酚和氯仿抽提除去蛋白质
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影响限制酶消化DNA的若干因素
DNA的浓度的影响
DNA浓度过高
带进更多的杂酶和杂质 如限制酶量不足，可能引起部分酶切 底物浓度过高，可能引起底物抑制
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限制性核酸内切酶作用机制
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二、限制性核酸内切酶作用机制
The restriction enzyme EcoRI recognizes and binds to the palindromic nucleotide sequence GAATTC.
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五. 异源同序酶（isoschizomer， 异源同序酶（isoschizomer， 同裂酶） 同裂酶）
定义： 1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两 种或多种限制 酶 特点： 2. 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同 KpnI GGTAC C GGTAC Asp718 G GTACC GTACC SstI CCGC SacI CCGC GG CCGC CCGC GG
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Structures and names of the nucleosides and nucleotides of RNA and DNA.
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Linkage of two nucleotides by the formation of a C-3—C-5’ (3'-5’) phosphodiester bond, producing a dinucleotide. (b) Shorthand notation for a polynucleotide chain.
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The top half of the figure shows computer-generated space-filling models of B-DNA, A-DNA, and Z-DNA.
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影响限制酶消化DNA的若干因素
酶浓度的影响 1 酶单位：是指在最适条件下完全消化1ug dsDNA所需要的酶量 用酶量过多，带进的杂质愈 多，有可能增加Dnase 1的危险
酶切设计时，甘油浓度不要超过5 酶切设计时，甘油浓度不要超过5％
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二、限制酶的使用方法
1、影响限制酶消化DNA的若干因素
DNA的纯度的影响 DNA浓度的影响 酶浓度的影响 酶反应条件的影响 双酶消化
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影响限制酶消化DNA的若干因素
DNA的纯度的影响
限制酶作用于纯度不高的DNA时，会进行不 完全酶解（部分酶切）
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四．限制酶的特点
３）对称性—双对称 对称性 双 5’C5 -G A A T T C-3’ G3’-C T T A A G-5’ 切点大多数在识别顺序之内， ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 限制酶切后产生两个末端，末端结构是５ ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ 2. 末端种类 端突起，个数为２ １）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAGG5 -CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ ACGTC3’-GACGTC-5’ -GACGTC3’-G ACGTC-5’ 端突起，个数为２ ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5 -GAATTC-3’ 5’-GAATTCPAATTC5’-GOH PAATTC-3’ HOG3’-CTTAAG-5’ -CTTAAG3’-CTTAAP HOG-5’
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三. 限制性内切酶的定义、命名 限制性内切酶的定义、
定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II II型限 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限 制酶。 制酶。 命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、 2. 命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、菌系编 分离顺序。 号、分离顺序。 例如： 例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H. 表示菌系为ｄ型血清型； influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离 表示分离 到的第三个限制酶。 到的第三个限制酶。 EcoRI Escherichia coli RI RI— HindⅢ Haemophilus influensae d Ⅲ dⅢ— SacI (II) Streptomyces achromagenes I (Ⅱ) (II)—
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第二节 天然DNA的制备
天然DNA的来源
染色体DNA、病毒和噬菌体DNA、质粒DNA、 线粒体和叶绿体DNA
天然DNA的提取
准备生物材料 裂解细胞 分离和抽提DNA
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限制性核酸内切酶和DNA DNA片断化 第三节 限制性核酸内切酶和DNA片断化
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影响限制酶消化DNA的若干因素
酶反应条件的影响
一般酶的反应条件： 一般酶的反应条件 37 PH 7.2 PH：7.2 温度：37℃ 完全消化 DNA酶切反应
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A demonstration of the multiple origins of replication along a eukaryotic chromosome
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Generalized model of semiconservative replication of DNA.
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二、限制修饰系统的种类
specificity pecificity） for DNA restriction modification and specificity）位于染 色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM 色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、 ATP 腺苷甲硫氨酸）。 （５—腺苷甲硫氨酸）。 腺苷甲硫氨酸 II型 限制与修饰基因产物独立起作用， 2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种 基因位于质粒上。 基因位于质粒上。 III型 修饰酶与Ｉ型酶相同， 3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成 一亚单位，限制酶是独立存在的。 一亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核 苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。 苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。 由三个基因构成， 1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host
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第二章 基因克隆所需的工具酶
第一节 DNA的组成和结构 DNA的组成 DNA的空间结构 DNA复制起始点和复制子的结构 DNA转录启动子和转录区的结构
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Chemical structures of the pyrimidines and purines that serve as the nitrogenous bases in RNA and DNA (b)Chemical ring structures of ribose and 2-deoxyribose, which serve as the pentose sugars in RNA and DNA respectively.
EcoRI
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四．限制酶的特点
３） 平齐末端 SmaI 5’-CCCGGG5 -CCCGGG-3’ 5’-CCC 3’-GGGCCC-5’ -GGGCCC3’-GGG ４）非互补的粘性末端 ａ）切点在识别顺序之外的 切点在识别顺序之外的， ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI Fok I 5 -GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(Ｎ)95’-GGATG(N)9 3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ -CCTAC(Ｎ)133’-CCTAC(N)13 ｂ）能识别简并顺序的 能识别简并顺序的， ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI AvaI 5’-CPyCGPuG5 -CPyCGPuG-3’ CCCGGG; CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG GGGGGG-3’ CCCCCC-5’