共表达木聚糖酶和木糖还原酶生产木糖醇的研究
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以 P1 、P2 为引物 ,以 p MD2x y nA 为模板 , PCR 扩增的循环参数为 : 94 ℃ 4 min ,94 ℃ 60s - 53 ℃ 60s - 72 ℃2 min (30 cycles) ,72 ℃10 min 。 11 21 2 重组质粒 p E T222x y nA 的构建
木糖醇广泛存在于各种水果 、蔬菜 、人和其他动 物的代谢物质中[1] ,它可作为糖尿病人的营养剂 、治 疗剂及儿童防龋齿食品的添加剂 。此外 ,还具备类似 甘油和其他多元醇的许多优异特性 ,因而广泛用于国 防 、医药 、化工 、皮革 、涂料 、化妆品及食品等行业[2 ,3] 。 目前商品化木糖醇一般采用化学法生产 ,但成本过 高 ,而生物法生产的主要途径是利用微生物还原酸水 解半纤维素产生的木糖生产木糖醇 。但是由于自然 界中可以直接将半纤维素代谢为木糖醇的微生物很 少 ,且会产生乙醇等副产物 ,降低转化率 ,因此利用重 组微生物直接将生物质转化为木糖醇将成为研究热 点。
食品与发酵工业 FOOD AND FERMEN TA Βιβλιοθήκη BaiduION INDUSTRIES
鉴定时应出现 2 条带 ,分别约为 5350 bp 和 1000 bp 。 酶切鉴定结果表明连接正确 (图 5) 。
M - DNA Marker ;1 - EcoR Ⅰ单酶切 p ET282 x y l1 ; 2 - EcoR Ⅰ和 Hi nd Ⅲ双酶切 p ET282 x y l1
木聚糖酶活力测定采用 DN S 法[8 ,9 ] ,木糖还原酶 活性采用 NAD H 还原法测定[10 ] 。 11 21 7 利用木聚糖生产木糖醇的研究
将共表达 E1 coli 在双抗性 LB (含木聚糖浓度为 10 g/ L ) 培养基中培养至 A600 约 01 4 ～ 01 6 时 , 加入 IP T G 诱导 ,发酵 48 h 后 ,利用 H PL C 检测木糖醇含 量 。层析柱为 Aminex H PX287 H ,流动相为 5 mmol/ L H2 SO4 ,流速 01 4 mL/ min ,柱温 45 ℃。用折光检测 仪 RID 检测 。
研究报告
M - DNA Marker ;1 - x y nA 扩增片断 图 1 x y nA 基因的 PCR 扩增
图 2 重组质粒 p ET222 x y nA 的构建
M - DNA Marker ;1 : B am HI 单酶切 p ET222x y nA ; 2 - N coI 和 B am HI 双酶切 p E T222x y nA
将 PCR 产物用 N coI 和 B am H I 双酶切 ,所得产 物与经同样酶切的 p E T222b 用 T4DNA 连接酶连接 得到分泌型重组质粒 p E T222x y nA ,将其转化到 E1
26 2007 V ol1 33 N o1 4 (Tot a l 232)
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
M - Protein Marker ( ku ) ; 1 , 3 , 5 分 别 为 E1 coli ( p ET222 x y nA) 、共表达 E1 coli 及 E1 coli (p ET282 x y l1) 的未诱导对 照 ;2 ,4 ,6 分别为 E1 coli (p ET222 x y nA) 、共表达 E1 coli 及 E1
载体 p E T222b 、p E T228a ( + ) 、E1 coli D H5α 和 E1 coli BL21 (D E3) plysS (以下简写为 E1 coli) 均为本 实验室保存 。 11 11 2 酶及生化试剂
T4DNA 连接酶 、限制性内切酶 、r Taq 酶购自大 连 Ta KaRa 公司 。NAD H 、燕麦木聚糖 、胶回收及质 粒提取试剂盒均购自厦门泰京生物技术有限公司 。 其余试剂均为国产分析纯 。 11 11 3 培养基及培养条件
2 实验结果
21 1 xynA 基因的 PCR 扩增 PCR 扩增的 x y nA 基因大小约为 700 bp , PCR
产物经 1 %琼脂糖凝胶电泳检测在 700 bp (图 1) 的位 置出现一特异性条带 ,与理论值大小相符 。 21 2 分泌型重组质粒 pET222 xynA 的构建与鉴定
coli D H5α中 ,提取质粒 ,经酶切鉴定正确后 ,转化至 E1 coli 诱导表达 。 11 21 3 重组质粒 p E T282 x y l1 的构建
将 p MD2 x y l1 用 EcoR Ⅰ和 H i nd Ⅲ 双酶切 ,电 泳纯化回收 x y l1 ,所得产物与经同样酶切的 p E T228a ( + ) 用 T4DNA 连接酶连接即得到重组质粒 p E T282 x y l1 ,将其转化到 E1 coli D H5α中 ,提取质粒 ,经酶 切鉴定正确后 ,转化至 E1 coli 诱导表达 。 11 21 4 两种重组质粒共转化 E1 coli 及其诱导表达
木聚糖酶 ( xynA) 和木糖还原酶 ( XR) 是生产木 糖醇的关键酶 。XynA 能够随机水解木聚糖的β21 ,42 糖苷键释放出低聚木糖和少量木糖[4] 。XR 能够依赖 NAD ( P) H 将木糖还原为木糖醇 。XynA 和 XR 共表 达将使木聚糖转化为木糖醇具有可行性 。
双质粒系统包括相容性双质粒和不相容性双质 粒 。传统理论认为 ,在 E1 coli 中 ,2 种不相容质粒在 复制及子细胞分配过程中彼此竞争 ,导致质粒缺失 , 因而无法用于重组蛋白的共表达[5] 。研究一方面构 建了 含 木 聚 糖 酶 基 因 x y nA 的 重 组 质 粒 p E T222 x y nA 和含木糖还原酶基因 x y l1 的重组质粒 p E T282 x y l1 ;另一方面利用双抗生素抗性[6 ,7] ,通过不相容质 粒在 E1 coli BL21 (D E3) plysS 中 共 表 达 x y nA 和 XR ,分别鉴定了它们的活性 ,并对其利用木聚糖生产 木糖醇做了初步研究 。
图 4 表达载体 p ET282 x y l1 的构建
2007 年第 33 卷第 4 期 (总第 232 期) 27
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
P1 : 5’2A T GCCCA T GGT GAA T T T GA GAAAA2 T TAA G23’ (含 N coI 酶切位点) 。
P2 : 5’2AAAC GGA TCC T T GCCAA TAAACA G2 C T GA T T G23’ (含 B am H I 酶切位点) 。 11 2 实验方法 11 21 1 PCR 扩增 x y nA 基因
LB 培养 基 , 培 养 温 度 37 ℃, 摇 床 转 速 250 r/ min ,氨苄青霉素 ( A mp ) 浓度为 100 mg/ L ,卡那霉素 ( Kan) 浓度为 50 mg/ L ,IP T G 浓度 1 mmol/ L 。 11 11 4 引 物
由上海申能博彩生物科技有限公司合成 。 根据 N CB I 中查到的 B aci l l us p um i l us 的 x y nA 基因全序列 ( X00660) 设计 。PCR 扩增 x y nA 所需的 引物
采用 10 %分离胶的不连续垂直平板电泳 ,考马 斯亮蓝 R2250 染色 。以 E1 coli (p E T222x y nA) 、E1 coli (p E T282 x y l1) 及共表达 E1 coli 未经 IP T G 诱 导的作为对照 。 11 21 6 木聚糖酶及木糖还原酶的活力测定
1 材料与方法
11 1 材 料
第一作者 :硕士研究生 (方柏山教授为通讯作者) 。 3 福建省自然科学重点基金资助项目 (C96068)
收稿日期 :2006 - 10 - 23 ,改回日期 :2006 - 12 - 22
11 11 1 质粒载体及菌株 p MD2x y nA 、p MD2x y l1 为本实验室构建 。表达
构建好的分泌型重组质粒 p E T222x y nA 如图 2 所示 ,在插入的 x y nA 序列的 N2端含有 pelB 信号 肽 ,可将表达蛋白分泌到细胞周质或培养基上清液 中 。p E T222x y nA 用 B am H I 单 酶 切 鉴 定 时 应 在 6 200 bp大小处有 1 条带 ;用 N coI 和 B am H I 双酶切 鉴定时应出现 2 条带 ,分别为 5 500 bp 和 700 bp ,酶 切鉴定结果表明连接正确 (图 3) 。
图 3 p ET222 x y nA 单双酶切电泳图谱
21 3 pET282 xyl1 表达载体的构建与酶切鉴定 构建好的表达载体 p E T282 x y l1 如图 4 所示 ,
p E T282 x y l1 用 EcoR Ⅰ单 酶 切 鉴 定 时 应 出 现 约 6350bp 大小的 1 条带 ;用 Eco R Ⅰ和 H i nd Ⅲ双酶切
食品与发酵工业 FOOD AND FERMEN TA TION INDUSTRIES
共表达木聚糖酶和木糖还原酶生产木糖醇的研究 3
王晓霞 ,郑晨娜 ,王飞飞 ,方柏山
(华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验室 ,福建泉州 ,362021)
摘 要 运用 PCR 技术扩增出短小芽孢杆菌木聚糖酶 A 基因 ,构建分泌型重组质粒 p ET222x y nA ,并构建木糖 还原酶重组质粒 p ET282x y l1 。利用双抗生素抗性将 p ET222x y nA 和 p ET282x y l1 在 E1 coli BL21 (D E3) plysS 中共表达 ,鉴定了木聚糖酶和木糖还原酶的活性 。此外 ,还对其利用木聚糖生产木糖醇做了初步研究 ,为将来直 接应用玉米芯等农副产品生产木糖醇奠定了基础 。 关键词 木聚糖酶 ,木糖还原酶 ,共表达 ,不相容质粒
图 5 重组表达载体 p ET282 x y l1 双酶切电泳图谱
21 4 共转化 E1 coli 的质粒提取与酶切鉴定 将双抗性 LB 平板上的单菌落接种于双抗性液
体 LB 中培养 , 提取质粒酶切鉴定 如图 6 所示 , p E T222x y nA 和 p E T282 x y l1 用 B am H I 单酶切时 应出现 2 条带 ,大小约为 6200 bp 和 6350 bp ,由于 2 条带 大 小 相 差 不 多 , 所 以 几 乎 重 叠 。用 B am H I、 H i n d Ⅲ和 N coI 三酶切时 ,应出现 6 条带 ,5 500bp 、 5 360bp , 950bp , 580bp 、120bp 和 40 bp 。由 于 5 500bp 和 5 360bp 相 差 不 多 , 所 以 重 叠 在 一 起 , 而 120bp 和 40 bp 较小 ,且量太少所以无法看到 ,因此 只能看到 3 条带 ,所以图谱所示正确 ,表明 p E T222 x y nA 和 p E T282 x y l1 确实能在宿主菌中共存 。
将等量 p E T222x y nA 和 p E T282 x y l1 共转化 E1 coli ,在含有 Amp 和 Kan 的双抗性 LB 平板上筛选单 菌落 。挑取单菌落于双抗性 LB 液体培养基中 ,37 ℃ 培养至 A600 约 01 4～01 6 时 ,加入 IP T G 诱导 ,28 ℃继 续培养 6 h 后离心收集菌体 。 11 21 5 SDS2PA GE
木糖醇广泛存在于各种水果 、蔬菜 、人和其他动 物的代谢物质中[1] ,它可作为糖尿病人的营养剂 、治 疗剂及儿童防龋齿食品的添加剂 。此外 ,还具备类似 甘油和其他多元醇的许多优异特性 ,因而广泛用于国 防 、医药 、化工 、皮革 、涂料 、化妆品及食品等行业[2 ,3] 。 目前商品化木糖醇一般采用化学法生产 ,但成本过 高 ,而生物法生产的主要途径是利用微生物还原酸水 解半纤维素产生的木糖生产木糖醇 。但是由于自然 界中可以直接将半纤维素代谢为木糖醇的微生物很 少 ,且会产生乙醇等副产物 ,降低转化率 ,因此利用重 组微生物直接将生物质转化为木糖醇将成为研究热 点。
食品与发酵工业 FOOD AND FERMEN TA Βιβλιοθήκη BaiduION INDUSTRIES
鉴定时应出现 2 条带 ,分别约为 5350 bp 和 1000 bp 。 酶切鉴定结果表明连接正确 (图 5) 。
M - DNA Marker ;1 - EcoR Ⅰ单酶切 p ET282 x y l1 ; 2 - EcoR Ⅰ和 Hi nd Ⅲ双酶切 p ET282 x y l1
木聚糖酶活力测定采用 DN S 法[8 ,9 ] ,木糖还原酶 活性采用 NAD H 还原法测定[10 ] 。 11 21 7 利用木聚糖生产木糖醇的研究
将共表达 E1 coli 在双抗性 LB (含木聚糖浓度为 10 g/ L ) 培养基中培养至 A600 约 01 4 ～ 01 6 时 , 加入 IP T G 诱导 ,发酵 48 h 后 ,利用 H PL C 检测木糖醇含 量 。层析柱为 Aminex H PX287 H ,流动相为 5 mmol/ L H2 SO4 ,流速 01 4 mL/ min ,柱温 45 ℃。用折光检测 仪 RID 检测 。
研究报告
M - DNA Marker ;1 - x y nA 扩增片断 图 1 x y nA 基因的 PCR 扩增
图 2 重组质粒 p ET222 x y nA 的构建
M - DNA Marker ;1 : B am HI 单酶切 p ET222x y nA ; 2 - N coI 和 B am HI 双酶切 p E T222x y nA
将 PCR 产物用 N coI 和 B am H I 双酶切 ,所得产 物与经同样酶切的 p E T222b 用 T4DNA 连接酶连接 得到分泌型重组质粒 p E T222x y nA ,将其转化到 E1
26 2007 V ol1 33 N o1 4 (Tot a l 232)
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
M - Protein Marker ( ku ) ; 1 , 3 , 5 分 别 为 E1 coli ( p ET222 x y nA) 、共表达 E1 coli 及 E1 coli (p ET282 x y l1) 的未诱导对 照 ;2 ,4 ,6 分别为 E1 coli (p ET222 x y nA) 、共表达 E1 coli 及 E1
载体 p E T222b 、p E T228a ( + ) 、E1 coli D H5α 和 E1 coli BL21 (D E3) plysS (以下简写为 E1 coli) 均为本 实验室保存 。 11 11 2 酶及生化试剂
T4DNA 连接酶 、限制性内切酶 、r Taq 酶购自大 连 Ta KaRa 公司 。NAD H 、燕麦木聚糖 、胶回收及质 粒提取试剂盒均购自厦门泰京生物技术有限公司 。 其余试剂均为国产分析纯 。 11 11 3 培养基及培养条件
2 实验结果
21 1 xynA 基因的 PCR 扩增 PCR 扩增的 x y nA 基因大小约为 700 bp , PCR
产物经 1 %琼脂糖凝胶电泳检测在 700 bp (图 1) 的位 置出现一特异性条带 ,与理论值大小相符 。 21 2 分泌型重组质粒 pET222 xynA 的构建与鉴定
coli D H5α中 ,提取质粒 ,经酶切鉴定正确后 ,转化至 E1 coli 诱导表达 。 11 21 3 重组质粒 p E T282 x y l1 的构建
将 p MD2 x y l1 用 EcoR Ⅰ和 H i nd Ⅲ 双酶切 ,电 泳纯化回收 x y l1 ,所得产物与经同样酶切的 p E T228a ( + ) 用 T4DNA 连接酶连接即得到重组质粒 p E T282 x y l1 ,将其转化到 E1 coli D H5α中 ,提取质粒 ,经酶 切鉴定正确后 ,转化至 E1 coli 诱导表达 。 11 21 4 两种重组质粒共转化 E1 coli 及其诱导表达
木聚糖酶 ( xynA) 和木糖还原酶 ( XR) 是生产木 糖醇的关键酶 。XynA 能够随机水解木聚糖的β21 ,42 糖苷键释放出低聚木糖和少量木糖[4] 。XR 能够依赖 NAD ( P) H 将木糖还原为木糖醇 。XynA 和 XR 共表 达将使木聚糖转化为木糖醇具有可行性 。
双质粒系统包括相容性双质粒和不相容性双质 粒 。传统理论认为 ,在 E1 coli 中 ,2 种不相容质粒在 复制及子细胞分配过程中彼此竞争 ,导致质粒缺失 , 因而无法用于重组蛋白的共表达[5] 。研究一方面构 建了 含 木 聚 糖 酶 基 因 x y nA 的 重 组 质 粒 p E T222 x y nA 和含木糖还原酶基因 x y l1 的重组质粒 p E T282 x y l1 ;另一方面利用双抗生素抗性[6 ,7] ,通过不相容质 粒在 E1 coli BL21 (D E3) plysS 中 共 表 达 x y nA 和 XR ,分别鉴定了它们的活性 ,并对其利用木聚糖生产 木糖醇做了初步研究 。
图 4 表达载体 p ET282 x y l1 的构建
2007 年第 33 卷第 4 期 (总第 232 期) 27
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
P1 : 5’2A T GCCCA T GGT GAA T T T GA GAAAA2 T TAA G23’ (含 N coI 酶切位点) 。
P2 : 5’2AAAC GGA TCC T T GCCAA TAAACA G2 C T GA T T G23’ (含 B am H I 酶切位点) 。 11 2 实验方法 11 21 1 PCR 扩增 x y nA 基因
LB 培养 基 , 培 养 温 度 37 ℃, 摇 床 转 速 250 r/ min ,氨苄青霉素 ( A mp ) 浓度为 100 mg/ L ,卡那霉素 ( Kan) 浓度为 50 mg/ L ,IP T G 浓度 1 mmol/ L 。 11 11 4 引 物
由上海申能博彩生物科技有限公司合成 。 根据 N CB I 中查到的 B aci l l us p um i l us 的 x y nA 基因全序列 ( X00660) 设计 。PCR 扩增 x y nA 所需的 引物
采用 10 %分离胶的不连续垂直平板电泳 ,考马 斯亮蓝 R2250 染色 。以 E1 coli (p E T222x y nA) 、E1 coli (p E T282 x y l1) 及共表达 E1 coli 未经 IP T G 诱 导的作为对照 。 11 21 6 木聚糖酶及木糖还原酶的活力测定
1 材料与方法
11 1 材 料
第一作者 :硕士研究生 (方柏山教授为通讯作者) 。 3 福建省自然科学重点基金资助项目 (C96068)
收稿日期 :2006 - 10 - 23 ,改回日期 :2006 - 12 - 22
11 11 1 质粒载体及菌株 p MD2x y nA 、p MD2x y l1 为本实验室构建 。表达
构建好的分泌型重组质粒 p E T222x y nA 如图 2 所示 ,在插入的 x y nA 序列的 N2端含有 pelB 信号 肽 ,可将表达蛋白分泌到细胞周质或培养基上清液 中 。p E T222x y nA 用 B am H I 单 酶 切 鉴 定 时 应 在 6 200 bp大小处有 1 条带 ;用 N coI 和 B am H I 双酶切 鉴定时应出现 2 条带 ,分别为 5 500 bp 和 700 bp ,酶 切鉴定结果表明连接正确 (图 3) 。
图 3 p ET222 x y nA 单双酶切电泳图谱
21 3 pET282 xyl1 表达载体的构建与酶切鉴定 构建好的表达载体 p E T282 x y l1 如图 4 所示 ,
p E T282 x y l1 用 EcoR Ⅰ单 酶 切 鉴 定 时 应 出 现 约 6350bp 大小的 1 条带 ;用 Eco R Ⅰ和 H i nd Ⅲ双酶切
食品与发酵工业 FOOD AND FERMEN TA TION INDUSTRIES
共表达木聚糖酶和木糖还原酶生产木糖醇的研究 3
王晓霞 ,郑晨娜 ,王飞飞 ,方柏山
(华侨大学工业生物技术福建省高等学校重点实验室 ,福建泉州 ,362021)
摘 要 运用 PCR 技术扩增出短小芽孢杆菌木聚糖酶 A 基因 ,构建分泌型重组质粒 p ET222x y nA ,并构建木糖 还原酶重组质粒 p ET282x y l1 。利用双抗生素抗性将 p ET222x y nA 和 p ET282x y l1 在 E1 coli BL21 (D E3) plysS 中共表达 ,鉴定了木聚糖酶和木糖还原酶的活性 。此外 ,还对其利用木聚糖生产木糖醇做了初步研究 ,为将来直 接应用玉米芯等农副产品生产木糖醇奠定了基础 。 关键词 木聚糖酶 ,木糖还原酶 ,共表达 ,不相容质粒
图 5 重组表达载体 p ET282 x y l1 双酶切电泳图谱
21 4 共转化 E1 coli 的质粒提取与酶切鉴定 将双抗性 LB 平板上的单菌落接种于双抗性液
体 LB 中培养 , 提取质粒酶切鉴定 如图 6 所示 , p E T222x y nA 和 p E T282 x y l1 用 B am H I 单酶切时 应出现 2 条带 ,大小约为 6200 bp 和 6350 bp ,由于 2 条带 大 小 相 差 不 多 , 所 以 几 乎 重 叠 。用 B am H I、 H i n d Ⅲ和 N coI 三酶切时 ,应出现 6 条带 ,5 500bp 、 5 360bp , 950bp , 580bp 、120bp 和 40 bp 。由 于 5 500bp 和 5 360bp 相 差 不 多 , 所 以 重 叠 在 一 起 , 而 120bp 和 40 bp 较小 ,且量太少所以无法看到 ,因此 只能看到 3 条带 ,所以图谱所示正确 ,表明 p E T222 x y nA 和 p E T282 x y l1 确实能在宿主菌中共存 。
将等量 p E T222x y nA 和 p E T282 x y l1 共转化 E1 coli ,在含有 Amp 和 Kan 的双抗性 LB 平板上筛选单 菌落 。挑取单菌落于双抗性 LB 液体培养基中 ,37 ℃ 培养至 A600 约 01 4～01 6 时 ,加入 IP T G 诱导 ,28 ℃继 续培养 6 h 后离心收集菌体 。 11 21 5 SDS2PA GE