基因工程菌培养

培养基组成：采用天然培养基培产时质粒稳定 件较用合成培养基为高
培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的 稳定
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选择合适拷贝数的菌株
在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内 质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方 法是在培养的不同阶段，采用不同培养温 度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采 用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较 低，而比生长速率升高，在主培养中途升 高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量 提高。
基因工程菌培养
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什么是基因工程菌？
为什么要构建基因工程菌？ 遗传性状的改良 代谢途径的加工 生物反应器
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基因工程菌的构建
宿主菌：大肠杆菌 作为外源基因表达 的宿主,遗传背景清 楚,技术操作简单,培 养条件简单,大规模 发酵经济, 是应用最 广泛,最成功的表达 体系
外源基因：质粒
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基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解
外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的 生长代谢
重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的
缺失重排
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影响质粒稳定的因素
与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对 其稳定性的影响
宿主对质粒稳定的影响 质粒拷贝数 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响 培养条件的影响（培养基，温度，pH等等）
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稳定基因工程菌的措施
改进重组质粒的结构 选择适当宿主 增加外界环境压力 调节培养条件
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施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中
添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维 持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能 为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中 添加相应的营养组份
接种量过高，使菌体生长过快，代谢物 积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。
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发酵中溶解氧的控制
纯氧？富氧！ 添加提高传氧能力的VHb蛋白，添加H2O2，
血红蛋白，小球藻。 溶氧过高或局部过高，会使某些微生物氧中
毒
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pH值的控制
在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸 和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。
培养基复杂，成本较高
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分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以
考虑将发酵过程分阶段控制 两阶段培养法：
⑴先使菌体生长至一定密度；
⑵再诱导外源基因的表达
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控制目的基因的过量表达
使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表 达程度
控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺
固定化技术与连续培养，透析培养相结合 是基因工程菌发酵的发展方向
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接种量的控制
接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生 长影响较明显。接种量小(0.5%～4%)时,比 生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量 大(>8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续 生长时间短,自溶也较快。
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接种量过小，延迟期太长 较接种量大，可缩短生长延迟期，菌体 迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表 达外源基因。
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基因工程菌的不稳定性及对策
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组 质粒的不稳定性：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、 修饰，降解导致其表观生物学功能的丧失
分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中丢失。
质粒拷贝数的影响
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质粒的拷贝数的影响
外源蛋白的合成速率取决于质粒拷贝数， 在高拷贝数下，结构物质如氨基酸的供应 成为限制因素，导致细胞的代谢活力下降， 高生长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性 增加。
高密度发酵工艺是基因工程菌发酵的主要 生产工艺
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高密度发酵
培养基的要求 高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达 产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细 菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需 要。
成分的要求：使用甘油的原因？ 浓度的要求
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在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基 酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提 高。
常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ 和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有 补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓 度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+ 浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠 杆菌的生长。
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培养温度
高温提高生长速度 ห้องสมุดไป่ตู้温增加重组菌稳定性 对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长
比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(ＧＳ Ｈ)时,在发酵开始和进行12ｈ后,各添加2.0ｇ /Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前 体氨基酸,可以使细胞浓度和ＧＳＨ的产量 分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍
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培养方式
分批补料培养方式 补充营养 稀释代谢产物
分离与培养耦合 固定化培养技术
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基因工程菌发酵的设备
气升式发酵罐的优点： 结构简单，不易污染，能耗低，操作简单， 低剪切力, 适合高浓度发酵。 基因工程菌往往对剪切力更为敏感（why？）
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基因工程菌的高密度发酵
在基因工程菌的发酵中，菌体的增殖和产 物的表达都是在对数期内完成的，因此， 发酵工艺的改进就集中在如何延长工程菌 的对数生长时间，缩短衰亡时间
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基因工程菌生长的特点： 外源基因与宿主的互相影响 产物，资源的争夺
基因工程菌与普通微生物发酵有什么区别？
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微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产 物，细胞生长并非主要目标。
基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物 。这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒 上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质。
和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。 但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重 组蛋白量。
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诱导剂及诱导时间控制
乳糖操纵子，IPTG 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都
会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时, 外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高 而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影 响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选 择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。 一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。