基因工程菌培养
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤嗨，大家好！今天咱们要聊聊一个听起来可能有点高深的东西——基因工程菌的构建。
别担心，我会把这事儿说得简单明了，像在跟朋友闲聊一样。
如果你对基因工程一知半解，也不用急着担心，接下来的内容会把这事儿讲得像做菜一样简单易懂。
好了，咱们开始吧！1. 先来个热身：什么是基因工程菌？说白了，基因工程菌就是经过“动刀子”的细菌，咱们给它加了些新“配料”。
这就像是你喜欢的菜里突然多了点特别的调料，让它味道更好或者更特别。
这个“动刀子”其实是指把一些新的基因搞到细菌里去，这些新基因会让细菌做出一些你平时见不到的“特技”，比如说生产某种药物或者是分解污染物。
2. 基因工程菌的构建步骤好啦，进入正题。
咱们要一步步来，首先得搞明白整个过程都包括哪些步骤。
别担心，这个过程并不复杂，主要就是几个大步骤：2.1 设计基因首先，咱们得确定你想要的“特技”是什么。
比如你想让细菌制造某种药物，那么你就需要设计一个含有这个药物生产所需基因的“蓝图”。
这一步就像是做菜之前，你得先想好要做什么菜，准备好食谱。
设计的过程需要用到一些高科技的工具和软件，但大致上就是确定你要的基因序列。
2.2 制备载体有了基因的设计，接下来要做的就是把这些基因装进“载体”里。
载体就像是细菌的“旅行包”，它能帮助基因顺利进入细菌体内。
载体一般是一些小的环状DNA，这些DNA就像是装在“小盒子”里的基因，好比是给细菌送去的“外卖”。
这个载体要跟细菌的细胞膜亲密接触，才能顺利把基因送进去。
2.3 转化细菌接着，就是把装有基因的载体送到细菌里面，这个过程叫做“转化”。
把细菌和载体混在一起，再通过一些方法，比如热激、电击等，帮它们“融合”。
想象一下你在举办一场小派对，细菌就是客人，载体就是派对上的小礼物，我们要确保这两者能“相遇”。
2.4 筛选和验证好了，基因送进去了，接下来就得确认细菌是不是变得“乖乖”的了。
我们要做一些筛选工作，确保细菌里确实有咱们放进去的基因。
(附具体方法)基因工程菌质粒(遗传)稳定性--原创
质粒遗传稳定性目前没有明确的规定，但一般用斜面传代法，一定数量点接抗性和非抗性板，生长计数（主要证明分裂稳定性）；更严谨时，可进一步双酶切、测序等验证（证明结构稳定性--国家药品监督管理局的新生物制品审批）。
工业用菌确实存在很多问题，免不了质粒丢失严重，高突变等现象，但是一般工业用菌都是经过10代以上稳定筛选之后才用于小试、中试和工业生产的。
菌体不稳定造可能成的损失巨大，所以鲜有工业用菌使用在2-3代菌就没有产量或者产量低的菌株。
一般来说，一代菌用一点少一点，一代菌上罐太伤了，工业用菌一般会存储足够量的二代菌（多数是冷冻干燥安瓿管）用于生产，在生产中需要活化、制作摇瓶种子，如果菌体生长慢，还要进一步做种子罐，最后才能用于生产。
如果菌体稳定性差，几代传下来，发酵的不稳定造成损失是很难估计的，而且一般不稳定菌都是先做小试、中试，成功后才能用于生产。
质粒在宿主中的稳定性确实需要进行筛选，实验中遇到的质粒突变能避免尽量避免，做好的质粒也不一定一直存放，由于不断的被用于各种改进实验，期间经过的大量筛选，避免了一代菌用完之后就没有更好的使用。
使用高保真酶扩增、保证没有物理化学因素促变，使用合适的宿主，还是很容易得到没有突变的质粒的，后续连续传代培养也可以得到比较稳定的质粒的。
质粒不稳定是重组基因工程菌培养过程中的常见问题，也是影响外源基因高效表达的限制因素之一[77~78]。
Koch[79]最早对外源基因引入宿主而对细胞产生的代谢负荷进行考察，研究表明质粒的大小、拷贝数，质粒的维持，抗性基因的表达，培养环境的变化，都会对宿主细胞产生代谢负荷，当供氧不足或营养物质受限制时，代谢负荷对细胞生长的影响会更加明显。
基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式: 一种是重组DNA 质粒的丢失, 称为脱落性不稳定; 另一种是质粒中的基因结构发生突变, 称为结构性不稳定。
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤哎呀，这可是个大话题啊！基因工程菌构建的方法和步骤，听起来就让人觉得高深莫测。
不过别担心，我这个话痨会尽量用简单易懂的语言来解释清楚的。
咱们就从头开始吧，一步一步地往前走。
我们得知道什么是基因工程菌。
简单来说，就是把一种生物体的基因提取出来，然后放到另一种生物体里，让它变得更强大、更有用。
这样一来，我们就可以生产出更多的药物、食物和其他有用的东西了。
那么，怎么才能构建出一个好的基因工程菌呢？这可是个技术活儿，需要掌握一些基本的方法和步骤。
咱们先来看看第一步：提取基因。
提取基因可不是一件容易的事情。
我们需要从一种生物体中提取出它的DNA,然后把它转移到另一种生物体里。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件，让DNA能够成功地转移到目标生物体里。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因提取出来了。
接下来就是第二步：构建基因表达载体。
构建基因表达载体就是为了把基因放到目标生物体里去。
这个过程叫做克隆。
克隆的关键在于找到正确的方法和条件，让基因能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因表达载体构建好了。
接下来就是第三步：转化目标生物体。
转化目标生物体就是为了把基因表达载体放到目标生物体里去。
这个过程叫做转化。
转化的关键在于找到正确的方法和条件，让基因表达载体能够成功地转移到目标生物体里并且正确地表达出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地把基因表达载体转化到目标生物体里去了。
接下来就是第四步：筛选阳性细胞株。
筛选阳性细胞株就是为了选出那些能够成功表达出我们的基因表达载体的细胞株。
这个过程叫做筛选。
筛选的关键在于找到正确的方法和条件，让阳性细胞株能够被成功地筛选出来。
这可是个技术活儿，需要耐心和细心。
好了，现在我们已经成功地选出了阳性细胞株。
接下来就是第五步：扩大培养规模。
基因工程菌培养及其不稳定性
5. 搅拌器转速和通气应适当
6. 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料
7. 培养液要经化学处理或热处理后才可排放
8. 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。
9. 轴封可采用磁力搅拌或双端面密封
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中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并
可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密
度菌体。
膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成
循环流速，开始透析的时间、透析培养的持续时间段都对产物的产率
有影响。
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一、基因工程菌的培养方式
5. 固定化培养
基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。 有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别对分泌型菌 更为有利。 由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
提高发酵罐的供氧能力。
有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因
而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从
而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的
方法都可提高质粒的稳定性。
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
pH pH 影响重组菌的稳定性。
5. 控制培养条件
限制性基质
一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养， 微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。
限制性基质的种类对重组菌有不同的影响
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提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
溶解氧
在基因重组菌的高密度培养时，为了ห้องสมุดไป่ตู้持所需的溶氧水平，除
纤维素酶基因工程菌pHBM_End培养条件的研究[1]
![纤维素酶基因工程菌pHBM_End培养条件的研究[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/ae73998db9d528ea81c77944.png)
基金项目：四川省教育厅自然科学科研项目（２００５Ａ０３０）＊通讯作者纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖和葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶三大类（谢占玲和吴润，２００４），在协同作用下它们可以将纤维素物质彻底水解成葡萄糖，进而发酵产生乙醇，解决能源再生以及环境污染等问题。
目前，纤维素酶成本高及酶活力低严重制约其在生产中的广泛应用。
为解决这个问题，一方面需要筛选高产量和高酶活力的纤维素酶产生菌，另一方面就是通过现代的基因工程手段，构建高效表达的基因工程菌，或通过对已知的纤维素酶进行分子改造以提高其比活力。
由于筛选原始菌株工作量大，且产量一般情况下较基因工程菌低，所以构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。
目前，国内外鲜见在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道。
本试验以工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ为研究对象，对其产酶条件进行优化，通过优化培养条件以进一步提高表达量，为实现基因工程菌产业化奠定基础。
１材料与方法１．１菌种来源四川农业大学生命科学与理学院生物化学与分子生物学实验室自行构建保存的基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ。
１．２培养基ＬＢ培养基：１％胰蛋白胨，１％Ｎａ－Ｃｌ，０．５％酵母浸出粉，ｐＨ７．０～７．５；配制固体培养基时需加入１．５％～２．０％的琼脂粉；配制抗生素培养基时需加入四环素（终浓度为１０μｇ／ｍＬ）。
ＬＢ－ＣＭＣ培养基：在ＬＢ培养基中加入０．５％的羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）。
１．３生物量测定将培养液稀释２５倍，用７２１－型分光光度计在６００ｎｍ下测定光密度，以未接种的培养基等量稀释液作对照。
１．４酶活力测定参照郑淑霞等（２００４）方法。
以１ｍＬ１％（ｍ／Ｖ）羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）溶液为底物，加入０．１ｍＬ适当稀释的酶液并混匀，置水浴锅中５０℃静置保温３０ｍｉｎ，然后加入２．５ｍＬ二硝基水杨酸钠（ＤＮＳ）溶液，混匀后置１００℃煮沸５ｍｉｎ，取出后用流水冷却至室温，定容至５ｍＬ，最后在５３０ｎｍ波长处测得各管溶液的吸光值并计算酶活力。
基因工程菌发酵培养的流程
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1. 菌种复苏和激活，从菌种库中取出保藏的菌种，在无菌条件下培养，激活其生理活性。
简述基因工程菌的培养方式
简述基因工程菌的培养方式基因工程菌是指通过基因工程技术将目标基因导入到细菌中，使其表达目标蛋白或产生目标物质的菌株。
基因工程菌的培养是进行基因工程研究和应用的重要环节之一。
下面将从菌株的选择、培养基的配制、培养条件的控制等方面简述基因工程菌的培养方式。
一、菌株的选择菌株的选择是基因工程菌培养的第一步。
常用的基因工程菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)等。
选择菌株时需要考虑其生长速度、基因导入效率、表达目标蛋白的能力等因素。
一般情况下，大肠杆菌是最常用的基因工程菌株，因为其生长速度快、易于培养和转化。
二、培养基的配制培养基是基因工程菌培养的基础，其组成要能满足菌株生长和表达目标蛋白的需要。
一般的培养基包括基础培养基和选择性培养基。
基础培养基是提供菌株生长所需的营养物质，如碳源、氮源、矿物质等。
选择性培养基则是通过添加特定的抗生素或抗性基因使得只有带有目标基因的菌株能够生长和繁殖。
培养基的配制需要根据具体实验的需要和菌株的特性进行调整。
三、培养条件的控制培养条件的控制对于基因工程菌的培养至关重要。
其中包括温度、pH值、气体环境、培养时间等因素的控制。
一般情况下，基因工程菌株的适宜生长温度为37℃，pH值为6.5-7.5。
气体环境方面，大肠杆菌一般需要在含氧的条件下培养，而酵母菌则需要在缺氧条件下培养。
此外，培养时间也需要根据菌株的生长速度和目标蛋白的表达时间进行调整。
四、培养方式的选择基因工程菌的培养方式主要包括液体培养和固体培养两种。
液体培养适用于大规模培养和蛋白表达，可以通过摇瓶培养或发酵罐培养进行。
固体培养适用于筛选和分离菌株，常用的固体培养基有琼脂和琼脂糖。
同时，还可以根据实验需要选择特定的培养方式，如表达载体的选择、诱导剂的添加等。
五、培养监测和收获在培养过程中，需要定期监测菌株的生长情况和目标蛋白的表达情况。
常用的监测手段包括测定菌液的光密度(OD值)、蛋白含量的测定、酶活性的检测等。
生化工程-基因工程菌培养
基因工程菌在生产过程中可能产生变异或逃逸，对环境和人体健康造成潜在威胁。因此，需要加强安全 监管和风险评估。
生物农药
生物农药
基因工程菌可用于生产生物农药，如杀虫剂、杀菌剂等。通过基因工程技术改良微生物， 使其产生具有杀虫、杀菌作用的代谢产物，实现对病虫害的有效防治。
生物农药的优势
生物农药具有环保、安全、可持续等优点，能够减少化学农药的使用，降低对环境的污 染和对人体的危害。
生物农药的挑战
生物农药的作用机制和效果可能受到环境因素的影响，如温度、湿度等，因此在实际应 用中需要加强效果评估和监测。
生物肥料
生物肥料
基因工程菌可用于生产生物肥料，通过改良微生物的代谢 途径，使其产生具有营养价值的代谢产物，如氮、磷、钾 等矿物质元素，为植物提供养分。
生物肥料的优势
生物肥料具有环保、安全、高效等优点，能够提高土壤肥 力和植物生长效率，减少化肥的使用和环境污染。
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加强下游处理技术的研究
针对基因工程菌产生的难分离纯化的产物，未来 将加强下游处理技术的研究，提高产物的纯度和 收率。
感谢您的观看
THANKS
基因工程菌能够高效降解有毒有 害物质或重金属离子，降低对环 境的污染和对生态系统的破坏。
生物环保的挑战
基因工程菌在降解过程中可能产 生变异或逃逸，对环境和人体健 康造成潜在威胁。因此，需要加 强安全监管和风险评估。
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基因工程菌培养的挑战与前 景
基因工程菌培养的挑战
பைடு நூலகம்
基因工程菌种稳定性问题
培养基优化需求
基因表达技术
基因表达技术是指将重组后的目的基因导入宿主细胞中，并在宿主细胞中进行表达，产生相应的蛋白 质或代谢产物。
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程基因工程菌是指经过基因工程技术改造的微生物菌株，广泛应用于生物工程、医学和农业等领域。
本文将介绍一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程。
一、基因工程菌的制备方法基因工程菌的制备方法主要包括以下几个步骤：1. 选择宿主菌株：根据所需的功能和目标，选择合适的菌株作为宿主，常见的宿主菌株有大肠杆菌、酵母菌等。
2. 提取目标基因：从源菌株中提取所需的目标基因，可以通过PCR 扩增、限制性内切酶切割等方法获取目标基因片段。
3. 载体构建：将目标基因片段与合适的载体进行连接，构建重组载体。
常用的载体有质粒、噬菌体等。
4. 转化：将重组载体导入宿主菌株中，使目标基因能够稳定表达。
5. 筛选和鉴定：经过转化的菌株进行筛选和鉴定，常用的方法有抗性筛选和PCR鉴定等。
6. 培养和扩大：经过筛选和鉴定的基因工程菌株进行培养和扩大，得到足够的菌体。
二、基因工程菌的应用与流程基因工程菌在生物工程、医学和农业等领域有广泛的应用。
下面以生物工程领域为例，介绍基因工程菌的应用与流程。
1. 目标基因的克隆与表达从源菌株中提取目标基因，并通过PCR扩增获取目标基因片段。
然后将目标基因片段与适当的载体连接，构建重组载体。
接下来，将重组载体导入宿主菌株中，经过筛选和鉴定，获得含有目标基因的基因工程菌株。
最后，通过培养和表达优化等步骤，使目标基因在基因工程菌中稳定表达，并获得足够的目标蛋白产物。
2. 代谢工程与合成生物学基因工程菌在代谢工程和合成生物学中起到重要作用。
通过基因工程技术，可以改造菌株的代谢途径，使其具有特定的代谢功能。
例如，通过引入外源基因，可以使菌株具备合成特定化合物的能力，如生物染料、药物等。
通过调控代谢途径中的关键基因表达水平，还可以实现代谢产物的高效合成。
3. 蛋白质工程与酶工程基因工程菌在蛋白质工程和酶工程中也有广泛应用。
通过基因工程技术，可以改变蛋白质的结构和功能，实现蛋白质的改良和优化。
基因工程菌培养
2、pH值对工程菌生长和表达的影响 在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同 菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有 一定影响。由于工程菌培养采用两阶段培 养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋 白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白 的表达不利，因此，表达时要调节pH在 6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表 达。
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4、诱导时机对表达的影响
诱导时机指加入诱导剂的时间
以天冬酰氨酶表达为例，见表。在 A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌 体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶 活和表达水平都较高。而菌体进入对数期 后期，由于发酵液中营养的消耗，及代谢 产物的积累，使菌体的生长速度受到抑制。 在此状态下诱导，表达显然受到影响。
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3、诱导时间对外源蛋白表达的影响 诱导时间：加入诱导剂后的培养时间
随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加， 但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒 性，合成速率下降，甚至产物被分解。
诱导时间对酶表达水平和活力的影响 诱导时间 酶活力 酶表达水平 0 0.02 1 52.3 37% 2 118.8 57% 3 120.8 67% 4 165.0 68% 5 139.9 64% *L-天冬酰氨酶
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4、控制比生长速率的葡萄糖流加 菌体的比生长速率与代谢产物的表达 密切相关。比生长速率太大，超过某 一值，易产生乙酸，这一比生长速率 值称为菌体的乙酸产生临界比生长速 率。通过考察得出最优比生长速率， 控制溶氧、转速、补糖来控制比生长 速率。
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五、生长与表达的影响因素
不同发酵条件下工程菌发酵结果 通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量 1 1 150 1.8 7.0 0.7 4 1.9 13.8% 2 2 250 2.6 7.8 0.77 4 2.08 16.7% 3 3 500 3.8 7.5 0.74 6 2.10 18.2% 4 3 500 4.0 7.0 0.83 6 2.27 26.4% 5 3 500 3.6 7.0 2.44 6 5.185 8.9% *鲤鱼生长激素基因工程菌
【微生物工程】第八章_基因工程菌的培养
基因工程菌培养方式
连续培养 连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程
度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。 连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研
究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表达的影响等 创造了良好的条件。
但是由于基因工程菌的不稳定性，连续培养比较困难。为了解决这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进行两阶段连续培养。 在这样的系统中关键的控制参数是诱导水平、稀释率和细胞比生长速率。优 化这三个参数以保证在第一阶段培养时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高表达水平或最大产率。
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生 应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是元件促进重组分子的缺失重排
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的策略
施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份 培养基复杂，成本较高
r1质粒上的parb基因引入表达型载体中其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞基因工程菌的稳定性基因工程菌的稳定性提高基因工程菌稳定性的策略施加选择压力根据载体上的抗药性标记向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素加入大量的抗生素会使生产成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素只能维持一定时间添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力载体上的营养缺陷型标记向培养系统中添加相应的营养组份培养基复杂成本较高提高质粒稳定性的方法提高质粒稳定性的方法提高基因工程菌稳定性的策略分阶段控制培养因外源基因表达造成质粒不稳定时可以考虑将发酵过程分阶段控制在生长阶段使外源基因处于阻遏状态避免因表达造成不稳定性问题的发生
第十一章 基因工程菌与固定化细胞
二）影响质粒稳定的因素
工程菌的稳定与否，取决于重组质粒本身的分子 组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件3个方面
1、与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳
定性的影响
例如： 质粒pSC101的Hind II片段有复制功能，并证明该片段上 还含有与质粒稳定性有关的序列 （0～0.27kb间； 被称为 分配定子 par ）
缺失有3种情况：
A）缺失发生在质粒复制起始区及选择性标记以外 往往使工程菌仍带有选择性标记但不能正常表现目 的基因的表型 B）缺失发生在质粒的选择性标记区域
e.g. pVC102(amy+ NmR CmR ) → amy – NmR CmS
如果重组质粒只有单一的选择性标记，这种情况会 被误认为质粒丢失 C）缺失可能发生在质粒复制的起始区 这种情况会导致整个质粒丢失
Par座位的功能类似于真核细胞染色体上的着丝点，在细 胞分裂时促进质粒分配，从而使质粒能稳定地传给子代细胞。
质粒pAcyc18 4在无选择压力下培养100代时丢失质粒的细 胞占32%；而由pAcyc184构建的含par座位片段的质粒pPM31 在同样条件下未测得有丢失质粒的细胞 Par座位可使与其无关的par-质粒稳定传代。 如将par座位插入到pBR322-trp上可使其质粒稳定性提高3-30 倍。
2、常用的基因工程宿主
1）大肠杆菌
2）枯草芽孢杆菌
3）酿酒酵母
特点： 生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长， 遗传学及分子生物学背景十分清楚
三、工程菌构建过程简介
克隆 PCR 合成
etc.
启动子
选择性基因
目 的 基 因
复制子
重组质粒
受 体 菌 表达产物
1）目的基因的获得 2）载体的选择与准备
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17 【点击数：482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。
重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。
发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。
目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。
另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。
当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。
分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。
但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。
过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
基因工程菌发酵培养的流程
基因工程菌发酵培养的流程Genetic engineering of bacteria is a complex process that involves manipulating the genetic material of the bacteria to produce desired products. 基因工程细菌是一个复杂的过程，涉及操纵细菌的基因物质以产生所需的产品。
This process begins with the selection of a suitable bacterial strain that has the potential to produce the desired product. 这个过程始于选择合适的细菌菌株，这些菌株有潜力产生所需的产品。
Once the bacterial strain has been selected, the genetic material of the bacteria is manipulated using techniques such as gene cloning and gene editing. 一旦细菌菌株被选择出来，就会使用基因克隆和基因编辑等技术来操纵细菌的基因物质。
After the genetic material has been manipulated, the bacteria are then cultured in a suitable growth medium to allow them to proliferate and produce the desired product. 在操纵基因物质之后，细菌就会在适宜的生长培养基中培养，以便它们能够繁殖并产生所需的产品。
This fermentation process involves closely monitoring the growth of the bacteria and providing the necessary nutrients and conditions for optimal product yield. 这个发酵过程涉及密切监测细菌的生长，并提供所需的营养和条件，以获得最佳的产品收率。
基因工程菌培养
培养温度
高温提高生长速度 低温增加重组菌稳定性 对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长
和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。 但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重 组蛋白量。
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诱导剂及诱导时间控制
乳糖操纵子，IPTG 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都
会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时, 外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高 而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影 响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选 择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。 一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。
稳定
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选择合适拷贝数的菌株 在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内 质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方 法是在培养的不同阶段，采用不同培养温 度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采 用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较 低，而比生长速率升高，在主培养中途升 高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量 提高。
考虑将发酵过程分阶段控制 两阶段培养法： ⑴先使菌体生长至一定密度； ⑵再诱导外源基因的表达
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控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表
达程度 控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成：采用天然培养基培产时质粒稳定
件较用合成培养基为高 培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的
毒
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pH值的控制
在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸 和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。
常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ 和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有 补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓 度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+ 浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠 杆菌的生长。
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程
一种基因工程菌及其制备方法和应用与流程基因工程菌是一种被广泛应用于生物技术领域的微生物。
它们通过基因工程技术的手段，对其自身的基因进行改造和调控，以实现特定的生物合成功能。
本文将介绍基因工程菌的制备方法和应用，并展示其在生物技术流程中的重要作用。
一、基因工程菌的制备方法基因工程菌的制备方法主要包括基因克隆、质粒构建、转化和筛选等步骤。
1. 基因克隆：首先，从目标物种中提取所需基因的DNA序列。
然后，利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增目标基因。
接下来，将扩增得到的基因片段与载体DNA进行连接，形成重组质粒。
2. 质粒构建：将重组质粒导入到宿主菌中，通过细菌培养和质粒提取等步骤，得到含有目标基因的质粒。
3. 转化：将质粒导入到目标菌株中，使其拥有目标基因。
转化方法有多种，如电穿孔法、化学法和冷冻复苏法等。
4. 筛选：利用适当的筛选标记，如抗生素抗性基因，筛选出带有目标基因的转化菌株。
同时，可以利用聚合酶链式反应(PCR)技术对转化菌株进行检测和确认。
二、基因工程菌的应用与流程基因工程菌在生物技术领域有着广泛的应用，涉及到药物生产、生物燃料生产、环境修复等多个领域。
1. 药物生产：基因工程菌可以被用于合成药物原料。
通过引入相应的基因，使宿主菌株具备合成目标化合物的能力。
例如，利用基因工程菌可以合成抗生素、抗癌药物等。
2. 生物燃料生产：基因工程菌可以通过代谢途径的改造，使其能够高效地合成生物燃料。
例如，利用基因工程菌可以将废弃物转化为乙醇、丁醇等可燃烧的化合物。
3. 环境修复：基因工程菌可以被用于环境修复，以清除有毒或有害物质。
通过引入特定的基因，使基因工程菌具备降解有害物质的能力。
例如，利用基因工程菌可以降解石油污染物、农药等。
基因工程菌的应用流程一般包括以下几个步骤：1. 基因选择：根据目标产物的要求，选择合适的基因进行克隆。
2. 基因克隆：将目标基因克隆到适当的载体上，构建重组质粒。
3. 转化：将重组质粒导入到宿主菌中，使其拥有目标基因。
基因工程菌培养
2、G+细菌
枯草杆菌是可替代大肠杆菌的菌种，它是G+菌，它没有外膜， 并且能把蛋白分泌（excretion）到胞外。它的这一性质对生产 非常有吸引力。 主要问题: •枯草杆菌产生大量的蛋白酶，会很快降解产物。 •枯草杆菌基因构建比大肠杆菌困难，质粒稳定性也比较差，所 以在使用上有较大的限制，
3、低等真核细胞
大肠杆菌 G+细菌 低等真核细胞 哺乳动物细胞
1、大肠杆菌
如果产品翻译后不需要修饰，大肠杆菌是最普遍选用的 宿主。
优点：
人们对大肠杆菌的生理学和遗传学背景了解得比其他任 何生物深。有利于进行复杂的基因操作；
大肠杆菌有相当高的生长速率，并能长到高细胞浓度 （50g/l）； 大肠杆菌能生长在简单的便宜的培养基上。
EL-Mansi和Luli假设的乙酸抑制机理是：乙酸在中性pH环境 中以离子化（CH3COO－）和质子化（CH3COOH）两种形式 存在，质子化的乙酸具有弱的亲脂性可以穿过线粒体膜进入 胞内，在细胞内（pH7.5）解离成CH3COO-和H＋，这样就降 低了膜内的pH值，使膜内外的pH差减小，减弱了质子的推动 力，产生的能量就被大大减少，扰乱了细胞的正常代谢和生 理活性。
• 有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸化后才 有活性。
• 治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安全，降低成本 并不重要，由于这些产品大多用量很小，价格高，附加值高。
二、宿主-载体系统
构建基因工程菌，必须选择宿主和表达系统，一般希望翻译后 的处理要简单，如果用于食品要考虑宿主菌是否列入FDA表中， 列入的认为是安全的菌。
四、生长与表达的影响因素
1、溶氧浓度对工程菌发酵的影响
不同发酵条件下工程菌发酵结果
通气量 搅拌转速 DO pH OD600 诱导时间 菌体湿重 蛋白量
工程菌
发酵时，随DO浓度的下降，细 胞生长减慢。 外源基因的高效表达需要大量 的能量，促进细胞的呼吸作用，提 高对氧的需求。 维持较高的DO值，才能提高工 程菌的生长，利于外源蛋白产物的 形成。
采用调节搅拌转速的方法, 可改变培养过程中的氧供给，提高 活菌产量。
⒌ 热诱导时机的影响
一般在对数生长期或对数生长后期升温诱 导表达。 要求在2min内让罐升温达到42 。 升温时间太长，会降低外源蛋白表达量， 也给提取纯化增加困难。
微生物发酵目的是为了获得初级或次 级代谢产物，细胞生长并非主要目标 应用发酵罐大规模培养基因工程菌是 为了获得最大量的基因表达产物。
发酵罐的组成有：
发酵罐体
保证高传质作用的搅拌器 精细的温度控制和灭菌系统 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测量与控制系统 培养液配制和连续操作系统。
发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物， 不能干扰细菌代谢活动等。
表达产物不稳定：
人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的
延长，干扰素活性反而下降。
影响工程菌稳定性的因素： （1）质粒结构：质粒稳定区受到影响，重组质粒上
有重复序列等。
（2）宿主 ：宿主中重组基因的完整性、重组时有关
基因的变异等。
（3）环境因素 ：高温、去垢剂、某些药物(如利福
平)、染料及胸腺嘧啶饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的 丢失。
b 抗生素依赖变异法
诱变使宿主成为某抗生素的依赖性突变株，而重组 质粒上含有该抗生素的非依赖性基因。发酵生产时，不向
培养基中加抗生素就能起到消除重组质粒不稳定的影响。
c 、营养缺陷型法
诱变使宿主成为营养缺陷型，将相关基因插入到重
基因工程菌构建的方法和步骤
基因工程菌构建的方法和步骤1. 了解基因工程菌嘿，伙计们，今天我们要聊聊“基因工程菌”这个话题，别担心，我不会用什么高深的术语把你绕晕。
我们先来把概念捋一捋。
基因工程菌，简单来说，就是把外来的基因“送”进某种细菌的体内，让这些细菌变成小小的生物工厂，生产我们需要的物质。
就像你在厨房里加点调料，能把菜肴的味道改变一样。
基因工程菌的目的是通过这种“改造”，让细菌能够合成有用的蛋白质、酶或者其他的化学物质。
这样一来，它们就能帮助我们解决各种问题，比如生产药物、清理污染或者改良作物。
2. 构建基因工程菌的步骤要构建基因工程菌，我们得经过几个步骤，哎呀，这可不简单，但也不至于让人望而却步。
接下来，我就给你细细道来，千万别走神哦！2.1 选择目标基因首先，我们得决定要插入哪个基因。
这个基因可以来自其他生物，比如植物、动物，甚至是其他细菌。
想象一下，你要给你的微型生物工厂添加一项新技能，就像给它升级一个新功能。
这一步就像是挑选你最喜欢的配料，关键在于找出最适合你需求的那个基因。
2.2 构建载体接下来，我们要搞个“载体”，也就是用来运输目标基因的工具。
可以把它想象成快递公司，我们的目标基因就像包裹，载体就是快递员。
常见的载体有质粒（就是一种小小的DNA环）或病毒载体。
载体的选择，基本上是看你的目标基因是小巧玲珑还是“大块头”，当然也要看它的安全性和有效性。
2.3 转化细菌现在，咱们得把装载着目标基因的载体“送”进细菌里。
这一步就像把新员工介绍给公司的老员工，确保他们能顺利融入团队。
我们用的技术有几种，比如化学转化、热激转化和电转化。
每种方法都有自己的“拿手绝活”，这时就得看情况选择最合适的了。
2.4 筛选和鉴定好了，目标基因成功送到细菌体内后，我们得确认它是否真的“安家”了。
这个步骤就像是检查你的新配方在实际操作中是否真的有效。
我们会用一些方法来筛选出那些成功转化的细菌，比如抗生素筛选、荧光标记等。
搞定这些之后，我们还需要用一些高大上的技术，如PCR、测序，来确认基因的确切位置和表达情况。
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基因工程菌的不稳定性及对策
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组 质粒的不稳定性：
结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、 修饰，降解导致其表观生物学功能的丧失
分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中丢失。
质粒拷贝数的影响
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质粒的拷贝数的影响
外源蛋白的合成速率取决于质粒拷贝数， 在高拷贝数下，结构物质如氨基酸的供应 成为限制因素，导致细胞的代谢活力下降， 高生长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性 增加。
培养基复杂，成本较高
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分阶段控制培养 因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以
考虑将发酵过程分阶段控制 两阶段培养法：
⑴先使菌体生长至一定密度；
⑵再诱导外源基因的表达
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控制目的基因的过量表达
使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表 达程度
控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
优化基因工程菌的培养工艺
和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。 但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重 组蛋白量。
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诱导剂及诱导时间控制
乳糖操纵子，IPTG 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都
会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时, 外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高 而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影 响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选 择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。 一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。
培养基组成：采用天然培养基培产时质粒稳定 件较用合成培养基为高
培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的 稳定
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选择合适拷贝数的菌株
在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内 质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方 法是在培养的不同阶段，采用不同培养温 度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采 用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较 低，而比生长速率升高，在主培养中途升 高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量 提高。
接种量过高，使菌体生长过快，代谢物 积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。
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Байду номын сангаас
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发酵中溶解氧的控制
纯氧？富氧！ 添加提高传氧能力的VHb蛋白，添加H2O2，
血红蛋白，小球藻。 溶氧过高或局部过高，会使某些微生物氧中
毒
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pH值的控制
在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸 和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。
固定化技术与连续培养，透析培养相结合 是基因工程菌发酵的发展方向
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接种量的控制
接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生 长影响较明显。接种量小(0.5%～4%)时,比 生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量 大(>8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续 生长时间短,自溶也较快。
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接种量过小，延迟期太长 较接种量大，可缩短生长延迟期，菌体 迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表 达外源基因。
常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ 和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有 补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓 度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+ 浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠 杆菌的生长。
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培养温度
高温提高生长速度 低温增加重组菌稳定性 对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长
宿主对质粒稳定的影响 质粒拷贝数 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响 培养条件的影响（培养基，温度，pH等等）
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稳定基因工程菌的措施
改进重组质粒的结构 选择适当宿主 增加外界环境压力 调节培养条件
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施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中
添加相应的抗生素 药物和食品生产时禁止使用抗生素 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维 持一定时间 添加抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能 为力 载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中 添加相应的营养组份
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基因工程菌生长的特点： 外源基因与宿主的互相影响 产物，资源的争夺
基因工程菌与普通微生物发酵有什么区别？
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5
微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产 物，细胞生长并非主要目标。
基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物 。这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒 上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质。
基因工程菌培养
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什么是基因工程菌？
为什么要构建基因工程菌？ 遗传性状的改良 代谢途径的加工 生物反应器
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2
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基因工程菌的构建
宿主菌：大肠杆菌 作为外源基因表达 的宿主,遗传背景清 楚,技术操作简单,培 养条件简单,大规模 发酵经济, 是应用最 广泛,最成功的表达 体系
外源基因：质粒
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基因工程菌发酵的设备
气升式发酵罐的优点： 结构简单，不易污染，能耗低，操作简单， 低剪切力, 适合高浓度发酵。 基因工程菌往往对剪切力更为敏感（why？）
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基因工程菌的高密度发酵
在基因工程菌的发酵中，菌体的增殖和产 物的表达都是在对数期内完成的，因此， 发酵工艺的改进就集中在如何延长工程菌 的对数生长时间，缩短衰亡时间
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基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制
受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解
外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的 生长代谢
重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的
缺失重排
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影响质粒稳定的因素
与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对 其稳定性的影响
高密度发酵工艺是基因工程菌发酵的主要 生产工艺
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高密度发酵
培养基的要求 高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达 产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细 菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需 要。
成分的要求：使用甘油的原因？ 浓度的要求
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在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基 酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提 高。
比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(ＧＳ Ｈ)时,在发酵开始和进行12ｈ后,各添加2.0ｇ /Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前 体氨基酸,可以使细胞浓度和ＧＳＨ的产量 分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍
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培养方式
分批补料培养方式 补充营养 稀释代谢产物
分离与培养耦合 固定化培养技术