常用western blot 试剂配方
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
Western Blot试剂配方
1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr) 29.0g，亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1.0g，混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。
2. 4×分离胶缓冲液(1mol/L Tris-HCl PH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。
3. 4×浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8) ：Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。
4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。
5. 5×电泳缓冲液(PH 8.3)：Tris 15.2g 甘氨酸94g ddH2O 定容到1000ml SDS 5g 先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。
6. 10%过硫酸铵(AP)：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。
7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液，0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2ml，10%SDS 4 ml，β-巯基乙醇1ml，甘油2ml，1%溴芬蓝1ml，置4℃避光保存8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即1×SDS-Page10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：NaCl 8.5g，(12H2O)Na2HPO4 2.9011g，(2H2O)NH2PO4 0.24g，加ddH2O定容至1000ml11. 封闭液: 1×PBS中加入30ml，5%(V/V)脱脂奶粉1.5g，0.02%叠氮钠0.006g，0.05% Tween-20 0.015g12. 漂洗液(PBST)：含0.05% Tween-20的PBS溶液每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-2013. 水饱和正丁醇：正丁醇50 ml，ddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。
常用western blot 试剂配方
Western blot常用试剂配方1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml）丙烯酰胺29 g双丙烯酰胺1g加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。
2. 10% SDS：（10ml）电泳级SDS 1 g蒸馏水9 ml初始PH约为7.85，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至7.2，定容至10ml。
3.TEMED（四甲基乙二胺）（成品）4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH 8.8）：50mlTris-base 9.085 g蒸馏水45 ml加浓盐酸（约0.4ml）调PH至8.8后定容至50ml，4℃保存。
5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH6.8）：50mlTris-base 6.055 g蒸馏水44 ml加3.5ml浓盐酸调PH至6.8后定容至50ml，4℃保存。
6. 10%过硫酸铵（10% AP）：0.5ml 新鲜配制称取0.05g AP于1.5ml EP管中，储存于-20℃，用时溶于0.5ml蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50mlupper buffer 0.312 ml 15.6ml甘油（丙三醇）0.5 ml 25mlSDS 0.1 g 5gDTT 0.0385 g溴酚蓝0.005g 0.25g加蒸馏水溶解后定容至1ml。
取0.2ml加0.8ml蒸馏水配成工作液。
8. 5 × running buffer：（1000ml）Tris-base 15.1 g甘氨酸（Glycine）94 gSDS 5 g加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
用时加4000 ml蒸馏水。
9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用）甲醇30 ml冰乙酸10 ml蒸馏水60 ml考马斯亮-250 0.05 g10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配乙酸（10%）50ml甲醇（30%）150ml加蒸馏水定容至500ml。
Western blot 常用试剂配置
Western blot 常用试剂配置1.（1）10 X SDS 电泳缓冲液（储备）Tris-base（FW 121.1，0.25M）30.3gGlycine （FW 75.1,1.92M）144.0gSDS （1% ，w/v）10.0g （SDS有毒且分子量小，易飞，称量时动作要轻柔，并带口罩）加适量去离子水磁力搅拌下溶解（不调pH），定容至1000ml，棕色瓶室温储存可以用6个月。
（2） 1 X SDS 电泳缓冲液取10 x SDS 100ml，加蒸馏水定容至1000ml，混匀备用。
2.（1）10 x 转膜缓冲液（solarbio）不含SDS可自配，配方与10 x SDS 电泳缓冲液（储备）相似，不加SDS。
Tris-base（FW 121.1，0.25M）30.3gGlycine （FW 75.1,1.92M）144.0g加适量去离子水磁力搅拌下溶解（不调pH），定容至1000ml，棕色瓶4℃储存。
（2）1 x 转膜缓冲液：10 x 转膜缓冲液100ml ＋甲醇200ml 加DW （700ml）定容至1000ml。
（可重复使用1-2次，适当补充少量甲醇）3. 20 x TBS1 x TBS-T 配置：取20 x TBS 25ml，Tween-20 500ul，去离子水定容至500ml，混匀备用。
4℃储存。
4. 10% 过硫酸铵（Ammonium Persulfate，APS，FW228.2）配置APS 0.1g +DW 1ml，混匀，分装160ul 管，4℃保存一周。
（-20℃保存时间长）5.10%封闭液配置：脱脂奶粉2.5g，加1x TBS-T 25ml,磁力搅拌20-30分钟至完全溶解，4℃短期保存。
6. 5% BSA （贵）封闭液配置：BSA（淡黄色颗粒）4℃储存，2g，加TBS-T 40ml，磁力搅拌20-30min至完全溶解，4℃短期保存。
7.β-actin 配置，1:1500，分子量大约438. 叠氮钠，1:1000稀释一抗，延缓其腐败，稀释后4℃储存，一周内用完（一般用2-3次，膜最多用2次。
Westernblot所需溶液的配制
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer）5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15。
1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L,pH值为8.3。
使用前,将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液(Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置,因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310％SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50—68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存.4Tris.HCl的配置注：Tris的分子量是121。
4。
4度储存。
5 10% APS （Ammonium persulfate ；过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1。
5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用,短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完.6 10×TBS (Tris-buffered saline）的配置加HCl调pH到7.6，室温储存.7TBST （Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液(loading buffer)的配置SDS—PAGE加样缓冲液：pH6。
8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml,甘油6。
4ml,10%SDS 12。
8ml,巯基乙醇3。
2ml，0.05％溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用.按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20-25ul,总蛋白量100μg。
9 stacking gel buffer (4×）10 5×Sample buffer (10ml）11封闭液的配置Blocking solution 要用TBST配制牛奶5% （w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA0。
Western_blot_试剂配制及操作流程
Western-Blot操作流程试剂配制蛋白提取试剂1. RIPA裂解液：50mM Tris（MW121.14，PH7.5） 3.02g150mM NaCl 4.38g1%TritonX-100 5ml1%脱氧胆酸钠5g0.1%SDS 0.5g蒸馏水至500ml。
调pH值至7.5。
混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。
使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。
2. 蛋白酶抑制剂cooktail所需母液成分：（1）100mmol/L PMSFPMSF 17.4mg异丙醇1ml溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。
（2）10mM 亮肽素leupeptin: -20℃保存（3）2.1mg/ml 抑肽素Aprotinin: 4℃保存配制：成分终浓度每ml裂解液所加母液量PMSF 1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulLeupeptin 0.1mmol/L（储存浓度稀释100倍）10ulAprotinin 1ug/ml （储存浓度稀释2000倍）0.5ul各成分直接加入所用的RIPA裂解液中，之后按照60ul/孔（12孔板）提取蛋白。
蛋白定量试剂1. G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95％乙醇50ml85％磷酸100ml蒸馏水至1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存于棕色瓶中。
2．牛血清白蛋白BSA储存液（1mg/ml）：100mg BSA粉末溶于20 ml双蒸水，定容至100 ml，加少量防腐剂，4℃保存。
上样用试剂1．4X上样缓冲液1.0 mol/L Tris·HCl（pH6.8）2mlSDS 0.8g溴酚蓝0.04g甘油4ml去离子水定容至10ml。
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
使用时稀释成1X。
2．1.0 mol/L二硫苏糖醇（DTT）（10X）用20 ml 0.01 mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT,分装成1ml小份储存于-20?C。
Western Blot 试剂-自己总结
Western Blot 试剂1、水（ddH2O）2、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺：应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
（可以现买30%丙烯酰胺！）30％Acrylamide Acrylamide 58gBis 2g定容到200ml 0.45μm过滤避光保存3、分离胶缓冲液：1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4℃保存。
4、浓缩胶（积层胶）缓冲液：0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O 中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4℃保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、10%(w/v) 十二烷基硫酸钠SDS溶液：0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
6、10%(w/v)过硫酸胺溶液（10% APS）：1g AP溶于10mlddH2O中，4℃保存，最好现配现用，配好的溶液在4℃保存使用2周左右，或500ul EP管－20℃。
（提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基）7、 TEMED原溶液：N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
（现买！）以上七种试剂用于配置分离胶和积层胶8、电泳液缓冲液（1×）：3.03gTris，18.8g甘氨酸，1.0gSDS，用蒸馏水溶解至1L，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。
配制Westernblot试剂配方.doc
'配制Western-Blot 所用相关试剂1. 30%聚丙烯酰胺100ml （RT or 4 °C 避光保存）29g 丙烯酰胺1g bis- 亚甲双丙烯酰胺2. 10%SDS 100ml RT10g SD4100ml ddH z O 加热搅拌溶解3. Buffers RT or 4 ° C1.5M Tris (pH: 8.8) 500ml ( 加Tris 90.855g)1.0M Tris (pH: 6.8) 250ml ( 加Tris 30.285g)4.10% 过硫酸胺（APS）4 °C 避光保质期一周0.1g APS — 1ml ddH2O5. Tris-Glycine (Running Buffer) 1L RT or 4 °C5 X 10 X 1 XddH 2O 800ml 800ml 800mlTris 15g 30g 3gGlycine 94g 188g 18.8g10 ％SDS 50ml 100ml 10ml(1g)加ddH2O—1000ml6. 10X Tris-Glycine for Transferring 1L RT or 4 °CTris : 30.26gGlycine: 144.1gddH 2O: 1L1 X Transferring buffer10 X Tris-Glycine 100ml ( 或Tris:3.026g Glycine:14.41g) Methanol 200mlddH 2O 700ml7. TBS (washing buffer) RT or 4 °C ( pH 7.6)20 X 10 X 1 XTris 48.4g 24.2g 2.42gNaCl 160g 80g 8gddH2O 1000ml 1000ml 1000ml8. Buffer A:用超纯水配制250ml储存在4° C冰箱中终浓度母液所需用量20 mM Hepes (pH 7.4)13(25ml : 25*10- *FW g)5ml2 mM EDTA 0.5M 3(5ml: 2.5*10 - *FW g)1ml 50 mM 卩-glycerophosphate FW : 306.12 3.8265g1 mM dithiothreitol 1M ( 已分装，存于20冰相最低层铝盒)0.25ml1 mM Na s VQ 1M (2ml: 0.368g )0.25ml1% Triton, 20 %( 70ml)12.5ml10% glycerol 25ml备注：已经配制为1M并储存于一20° C冰箱Na 3VO4 (sodiium orthovanadate ),原装粉剂RT保存，在李志华最左边的抽屉里B —glycerophosphate 粉剂在4° C冰箱李志华层托盘中9. Protein in hibitors (fresh making)取1片溶解于2ml ddH2O,并分装为200ul 一支，—20° C保存。
westernblotting试剂配制
westernblotting试剂配制Western Blot试剂配制Lower buffer（PH8.8）Tris base 18.15g⽤1mol/LHCl 调PH⾄8.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100mlUpper buffer （PH6.8）Tris base 12.1g⽤1mol/LHCl 调PH⾄6.8加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%SDS SDS 粉末10g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml10%AP(4℃保存)过硫酸铵固体0.1g1ml ddH2O30%Acr/Bic: 丙烯酰胺29g甲叉双丙烯酰胺1g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml5%脱脂奶粉（封闭液）脱脂奶粉5g加TBST完全溶解后定容⾄100ml5×电泳缓冲液 Tris Base 15.1g⽢氨酸94gSDS 5g加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×电泳缓冲液5×电泳缓冲液100ml400ml ddH2O1×转移缓冲液Tris 5.8g（半⼲转）⽢氨酸2.9gSDS 0.37g---可以少加甲醇200ml(有毒，最后加)----可以200-250之间，⽤途是固定作⽤加ddH2O完全溶解后定容⾄1L1×TBS缓冲液 TBS缓冲液粉末⼀包加ddH2O完全溶解后定容⾄2LTBST缓冲液500ml 1×TBS缓冲液250ul Tween20显影液⼤包5.2g⼩包0.6g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml定影液⼤包6.6g⼩包1.9g加ddH2O完全溶解后定容⾄100ml脱⾊液甲醇30mlddH2O60ml冰⼄酸10ml六楼(湿转技术) 10X转移缓冲液：Tris 30.26克⽢氨酸151克1000ml双蒸⽔湿转技术; 1X转移缓冲液：10X转移缓冲液100ml⽆⽔甲醇200ml 1000ml双蒸⽔SDS-PAGE蛋⽩电泳胶配制Reagents Separating GEL(12%) Stacking GEL(4%) Distilled water 3.2 ml 2.4mlLower buffer 2.6ml(1.5m PH8.8) ----Upper buffer10% SDS Acrylamide/Bis(30%) 10%Ap(fresh)TEMED----100ul4.0ml100ul5ul1ml(PH6.8)40ul0.536ml20ul4ulTotal 10ml 4ml注意：Acrylamide/Bis(30%)是调节配制胶的浓度，据柳鹏讲10ml体系中1.5mol PH8.8的Lower buffer固定在2.5ml，⽽Distilled water 和Acrylamide/Bis(30%)之和等于7.3ml。
western blot试剂配方
Tris (MW121.14)
30.29g
蒸馏水
200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
Ph
Hcl
7.4
约17ml
7.5
约16ml
7.6
约15ml
8.0
约10ml
（5）10%SDS
SDS
10g
蒸馏水至
Western blotting所需要试剂配方
1、超纯水
2、30%Acr/Bic(29.1)、1.5mol/L Tris.Hcl(Ph=8.8)、0.5mol/L Tris.Hcl(Ph=6.8)、1.0mol/L Tris.Hcl、10%SDS
3、10%AP(使用前加1000ul超纯水)、转移缓冲液、TBS、TBST、TEMED、甲醇、吐温20
5.8g*10
SDS
0.37g*10
甲醇
200ml*10
蒸馏水至
1000ml
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（8）TBS缓冲液
1 mol/L Tris·HCl（pH7.5）
10ml
NaCl
8.8g
蒸馏水至
1000ml
可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用
（9）TBST缓冲液
20％Tween20
1.65ml
TBS
700ml
混匀后即可使用，最好现用现配
（10）电转缓冲液
Tris（MW121.14）
3.03g
甘氨酸（MW75.07）
Westernblot常用试剂配制
Westernblot常用试剂配制Western blot 常用试剂配制1.5 mol/L Tris (PH8.8)1．称量181.7g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．用浓盐酸调节pH值至8.8。
4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的p H 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
（参照kara公司Catalog-N1）1 mol/L Tris (PH6.8)1．称量121.1g Tris置于1L烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．按下表量加入浓盐酸调节所需的pH值。
pH值浓HCl 6.87.4 约70 ml7.6 约60 ml8.0 约42 ml4．定容至1L.5．高压灭菌后，室温保存。
注意：1.溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高1oC，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
2. 如1 mol/L溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris。
（参照kara公司Catalog-N1）30％丙稀酰胺（100ml）1．称量下列试剂置于烧杯中。
丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g双丙烯酰胺(BIS) 1 g2．加入约60 ml去离子水，充分搅拌溶解。
3．定容至100 ml, 用0.45 μm滤膜滤去杂质。
5．于棕色瓶中4 oC保存。
注意：1. 丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成分。
（参照kara公司Catalog-N1和《分子克隆》二版P924）30％SDS1．称量10 g 高纯度（电泳级）的SDS置于100~200 ml烧杯中。
2．加入约800 ml去离子水，68oC加热溶解。
westernblot相关Buffer配方
westernblot相关Buffer配方Western blot是一种常用的实验技术，用于检测和分析蛋白质的存在和表达水平。
Western blot包括蛋白质提取、电泳分离、转膜、免疫染色等步骤。
下面是一些常用的Western blot相关缓冲液（Buffer）配方。
1.RIPA缓冲液：RIPA缓冲液是一种用于蛋白质提取的常用缓冲液，可以有效地裂解细胞膜并释放蛋白质。
以下是一种常用的RIPA缓冲液配方：-氯化钠（NaCl）：150mM- 三羟甲基氧甲烷（Tris） pH 7.4: 50 mM-适量氢氧化钠（NaOH）调整pH值- 二硫化苯甲醇（β-mercaptoethanol）或 DTT：1%- 甘油（glycerol）：1%-磷酸盐缓冲液：10mM-磷酸二氢钾（KH2PO4）：1.5mM-多普酰转酶抑制剂（PMSF）：1mM-乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）：1mM-硫酸镁（MgSO4）：1mM2.SDS-凝胶电泳缓冲液：SDS-凝胶电泳是Western blot的重要步骤之一、以下是一种常用的SDS-凝胶电泳缓冲液配方：- Tris酸：25 mM- 甘氨酸（Glycine）：250 mM-SDS：0.1%-水：适量请注意，这只是一种基本配方，可能需要根据实验的具体要求进行调整。
3.转膜缓冲液：转膜缓冲液用于将电泳分离得到的蛋白质转移到膜上进行进一步的分析。
以下是一种常用的转膜缓冲液配方：-二甲基亚砜（DMSO）：20%-甘氨酸：192mM-氯酸钠（NaClO3）：20mM- Tris酸：25 mM-水：适量4.阻断缓冲液：阻断缓冲液用于在免疫染色之前预防非特异性结合。
以下是一种常用的阻断缓冲液配方：-牛血清蛋白（BSA）：3-5%-牛血清白蛋白（BSA）：0.1-0.3%-磷酸盐缓冲液：10mM- Triton X-100或Tween-20：0.1-0.5%-NaN3：0.01-0.02%5.抗体染色缓冲液：以下是一种常用的抗体染色缓冲液配方：-磷酸盐缓冲液：10mM-硼酸：1mM-EDTA：5mM- Tween-20：0.1-0.2%-低脂牛奶粉（非脂奶粉）：5-10%-NaN3：0.02%不同实验室和研究人员可能会根据实际需要进行配方上的调整。
WesternBlot配方和方法
Western Blot 配方和方法Western Blot配液：1.10% SDS 溶液(m/v)：SDS 0.1gDDH O 1ml2加热溶解，室温保存，用后马上拧紧瓶盖。
2.10% 过硫酸铵:APS 0.1gDDH O 1ml2由于过硫胺酸会缓慢分解，最好颖配制，或隔周配制〔也可每 200 微升 EP 分装，4℃保存 4W，-20℃保存 1 月〕3.1× 电泳缓冲液Tris base 3.028gGlycine 14.4gSDS 1.0g用蒸馏水溶解至 1000ml，调整PH 8.3。
冰箱内可保存数月。
4.10 ×转膜液〔储存液〕甘氨酸72.07gTris base 15.14gDDH O 400ml2加水至 500ml，储存液不加甲醇，4℃保存。
1 × 转膜液 1L 配制：10 × 转膜液储存液 100ml，150ml 甲醇，加 DDH O2 750ml，PH 8.5，定容至总量 1L5.1×转膜液〔现配现用〕：Tris base 3.03gGlycine 14.42g甲醇150ml加水定容至 1000ml6.10 × TBS：Tris base 12.1gNaCl 40g加水，用浓盐酸调整 PH 至 7.6 后定容至500ml 7.TBST：1 × TBS/吐温 = 1000/18.封闭液：脱脂奶粉2gTBST 40ml温度适当调整〕〔pH6.8〕配胶：先配分别胶，再配积层胶。
一般两者同时配制，只是最终分别胶先加TEMED 混合后马上灌胶，而积层胶放4℃，等分别胶凝固后再加TEMED 混匀后灌胶。
TEMED 量加大，一般加至原来的2-3倍，依据试验当时的2ml 3ml 5ml 5ml 10% 5ml 5% 5% 8% 10% 两 15% 积 积 分 分 块 分 层 胶 层 胶 离 胶 离 胶胶 离胶超纯水1.42.1 2.3 1.9 2.8 1.1530％Acr/Bic0.3 0.4 1.3 1.7 2.5 2.539551.5mol/L1.3 1.3 0.9 1.3Tris · HCl5 〔pH8.8〕1mol/L 0.2 0.3Tris · HCl 5 75〔为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和10％SDS 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0235575 5 10%APS〔过硫胺0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 酸〕235575 5TEMED 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.002 03 03 02 03 02 双丙烯酰胺：丙烯酰胺摩尔比1：29 配制时，SDS- 有效分别范围凝胶浓度〔％〕线性分离范围〔KD)15 12-4310 16-687.5 36-945.0 57-212按所需分别的蛋白质分子大小选择适宜的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5%的凝胶可用于 60～200kDa 的 SDS变性蛋白质分子的分别，10%用于 16～70kDa，15%用于12～45kDa。
western blot 独家配方(全套)
2×loading buffer（50ml） 1M Tris-HCl （pH6.8）：5ml SDS : 2g BPB : 0.1g 甘油：10ml 加水定容至50ml，分装500μl/份， 用前加10μl 2-mer
5%脱脂奶粉（封闭缓冲液） 脱脂奶粉 ：2.5g TBST buffer ：至50ml 充分混匀溶解er（1L） Tris : 72.5g Glycine : 36.25g SDS : 4.625g 溶于1L去离子水，混匀，室温保存 使用时，量取80ml，加720ml去离子 水，然后加200ml甲醇
10%SDS（100ml） SDS : 10g 去离子水至100ml 50℃水浴下溶解，室温保存 若出现沉淀，水浴溶化，仍可使用
10%APS<!> APS ：0.1g 溶于1ml去离子水 4℃，避光保存2-3周
5×running buffer（1L） Tris : 15.1g Glycine : 94g SDS : 5g 溶于1L去离子水，混匀，室温保存
4×Tris-Cl/SDS,pH6.8(500ml) 1M Tris-HCl，pH6.8 ：250ml 10%SDS ：20ml 去离子水 ：230ml
1M Tris-HCl pH6.8（1L) Tris ：121.1g 800ml去离子水充分溶解 浓HCl调节pH=6.8，约 ml 定容至1L，高压灭菌，室温保存
配置不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积 3ml 4ml 5ml 6ml 1.8ml 2.4ml 3ml 3.6ml 400μl 536μl 664μl 800μl 750μl 1ml 1.25ml 1.5ml 12μl 16μl 20μl 24μl 6μl 8μl 10μl 12μl
8ml 4.8ml 1ml 2ml 32μl 16μl
western blot 试剂配制
1 制胶材料（试剂配制）（1）浓缩胶缓冲液：称取 6 g Tris溶于40 mL双蒸水中，用l moL /L HCI调至pH 6.8，再加水稀释到100 mL的终体积，即成pH 6.8，0.5 moL/L tris-HCL缓冲液。
过滤后于4℃保存。
（2）分离胶缓冲液：称取36.6 g的Tris和48 mL l mol/L HCL混合，加水稀释至100 mL的终体积。
即成pH 8.8，3 moL/L tris-HCL缓冲液。
过滤后于4℃保存。
（3）5*SDS-PAGE缓冲液储液：称取15.1 g Tris（0.125M），94 g甘氨酸（1.25M），10 g SDS（0.5M），用蒸馏水溶解至800 mL，加水至1L，即成0.125 moL/L Tris-1.2 5 moL/L甘氨酸-0.5M SDS电泳缓冲储液，室温保存。
临用前稀释5倍。
（4）10% SDS溶液：称取l g SDS溶于10 mL双蒸水中，即成10% SDS溶液。
（5）10% 过硫酸胺：l mL双蒸水加入0.1 g过硫酸胺，宜当天配制，最多不超过一周。
（6）TEMED原溶液。
（7）(样品缓冲液)按下方配制：①pH 6.8，0.5 moL/L Tris-HCL缓冲液液8 mL；②甘油 6.4mL；③10% SDS溶液液12.8 mL；④二疏基乙醇3.2 mL；⑤0.05% 溴酚蓝1.6mL；⑥蒸馏水32 mL，混匀备用。
（8）转膜缓冲液：3 g Tris碱、1g SDS和14.48 g甘氨酸，再加200 mL甲醇，补充蒸馏水定容至1 L。
（9）封闭缓冲液：含5%脱脂奶粉、0.025% NaN3溶于TBS-T缓冲液。
（10）5×TBS缓冲液：12.1 g Tris碱，40 g NaCL溶于双蒸水中，用浓HCL调H 值至7.6后，用双蒸水定容至1 L。
（11）TBS-T漂洗液：含0.1% Tween-20的TBS。
（12）30%丙烯酞胺溶液：称取30g丙烯酞胺，溶解于100 mL双蒸水中, 即成30%丙烯酞胺溶液。
(完整word版)Westernblot试剂配制及操作步骤
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1) pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
Western-blot实验所需试剂配制方法
名称 Tris 去离子水 浓盐酸 去离子水
用量 12.1 80ml 8.8-9ml
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
4. 1.5M Tris-HCL, pH=8.8 (36%的浓盐酸) ：
名称 Tris 去离子水 浓盐酸 去离子水
用量 18.17 80ml 2.8-3ml
--
色瓶中 4℃保存，
（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，通过皮肤吸收并具有累积性，配制时应戴手套操作）
2. 10％（W/V）过硫酸铵：
名称
用量 备注
过硫酸铵
0.1g
去离子水
1ml
现配现用
（注意：10％过硫酸铵溶液在 4℃保存能使用两周左右，过期会失去催化效果）
3. 1M Tris-HCL, pH=6.8 (36%的浓盐酸) ：
名称 1MTris-HCL, pH=6.8 SDS 甘油 BPB（溴酚蓝） 超纯水
2ME
用量
1.25ml 0.5g 2.5ml 25mg 至 5ml 50℃充分溶解， 30min，离心取上 清，0.45uM 过滤 10ul/200ul
2.5ml 1g 5ml 50mg 10ml
备注
分装 200ul/管 使用前添加，添加后可室温 保存一个月
备注
预实验已确定 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
5. 10%SDS：
名称 SDS 去离子水
用量 10g 80ml
备注 加入去离子水定容至 100ml 后，室温保存
ห้องสมุดไป่ตู้--
--
缓冲液配置：
6. 5ⅹTris-Glycine Buffer(SDS-PAGE 电泳缓冲液)
Westernblot所需溶液的配制
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液（Sending buffer）（现用现配）必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
4Tris.HCl的配置注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。
4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置加HCl调pH到7.6，室温储存。
7TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液（loading buffer）的配置SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
9 stacking gel buffer (4×)10 5×Sample buffer (10ml)11封闭液的配置Blocking solution 要用TBST配制牛奶5% (w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide12丽春红溶液：100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。
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Western blot常用试剂配方
1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml）
丙烯酰胺 29 g
双丙烯酰胺 1g
加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。
2. 10% SDS：（10ml）
电泳级SDS 1 g
蒸馏水 9 ml
初始PH约为，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至，定容至10ml。
（四甲基乙二胺）（成品）
4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH ）：50ml
Tris-base 9.085 g
蒸馏水 45 ml
加浓盐酸（约）调PH至后定容至50ml，4℃保存。
5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH ）：50ml
Tris-base 6.055 g
蒸馏水 44 ml
加浓盐酸调PH至后定容至50ml，4℃保存。
6. 10%过硫酸铵（10% AP）：新鲜配制
称取0.05g AP于 EP管中，储存于-20℃，用时溶于蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml） 50ml
upper buffer ml
甘油（丙三醇） ml 25ml
SDS g 5g
DTT 0.0385 g
溴酚蓝
加蒸馏水溶解后定容至1ml。
取加蒸馏水配成工作液。
8. 5 × running buffer：（1000ml）
Tris-base 15.1 g
甘氨酸（Glycine） 94 g
SDS 5 g
加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
用时加4000 ml蒸馏水。
9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用）
甲醇 30 ml
冰乙酸 10 ml
蒸馏水 60 ml
考马斯亮-250 0.05 g
10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配
乙酸（10%） 50ml
甲醇（30%） 150ml
加蒸馏水定容至500ml。
11. Transbuffer（PH ）：100ml 现用现配
Tris-base 0.3028 g
甘氨酸 1.4872 g
甲醇 20 ml
加蒸馏水定容至100ml。
12. 10 x 丽春红染液（储存液）：（可重复利用）
（用时用蒸馏水稀释为1 X 的）染色后用纯水脱色
丽春红 2 g
三氯乙酸 30 g
磺基水杨酸 30 g
加H2O 定容至10 ml（储存液）。
4℃保存。
用1 × TBST洗脱
13. 10 ×TBS：500 ml
Tris-base 12.1 g
NaCl 40g
加浓盐酸5ml调PH至，加蒸馏水定容至500ml（储存液）。
4℃保存。
用时蒸馏水稀释为1 × TBS（1份10 ×储存液，9份水）.
14. 1 × TBST （加Tween-20的TBS）洗涤液：Tween-20含量%
15. 封闭液：含5%脱脂奶粉的TBST
脱脂奶粉 1g
1 × TBST 20 ml
16. ECL 发光底物：两种溶液1:1混合，均匀涂于膜上。
17. H
20
2
配制
取普通纯水按照每 10ml纯水加入40μl 30% H
2O
2
比例配成新鲜 H
2
O
2
溶液替代
ECL溶液B使用。