免疫沉淀技术

基本流程
三．酶免疫定位 1. 封闭： 2. 抗体的的选择：来源、标记、效价、二抗 3. 标记的选择：HRP、AP
技术优势
1. 2. 3. 4. 5. 灵敏度高 特异性高 方法简便 无需纯化 易于观察、保存
应用范围
1. 蛋白质相对含量检测 2. 蛋白质修饰水平分析 3. 蛋白质相互作用研究
80－110 ug/cm2
干的NC膜易脆 无 缓冲液润湿,避免气泡 常规染色，可用放射性和 非放射性检测
>400 ug/cm2
软而结实 无 缓冲液润湿
检测方式
不能用阴离子染料
适用范围 价格
0.45um 一般蛋白0.2um一 低浓度小分子蛋白、 分子量小于20kD蛋白 酸性蛋白、糖蛋白和 糖蛋白检测和蛋白质 测序 0.1um一分子量小于7kD蛋 蛋白多糖(主要用在核 白 酸检测中) 价格较便宜 便宜 较贵
转移膜的选择
灵敏度和分辨率 背景 结合能力
材料质地 溶剂耐受性 操作程序 NC膜 高 低 尼龙膜 高 较高 PVDF膜 高 低 125－200 ug/cm2 （适合于SDS存在下 与蛋白质的结合） 机械强度高 有 100%甲醇润湿 常规染色，比较于 NC膜，可用考马斯 亮蓝染色，可用于 ECL检测，快速免疫 检测
者用分子量大约6000，浓度3～4%聚乙二醇
（PEG6000），以其多聚物孔隙排阻脱水来
大大降低抗原抗体复合物的溶解度。
pH值
尽可能调节pH至复合物的等电点附近，
通常此pH值是介于IgG等电点（约pH=7）
和抗原等电点之间，也依赖于抗原不抗体的
比例。
温度
温度不抗原抗体反应有密切的关系 温度升高可促使分子运动加快，抗原不 抗体碰撞机会多，容易结合，但也容易再解 离; 温度低，分子运动慢，撞击机会少，但 一旦结合后则丌易再分开。
免疫共沉淀技术
结果分析
Nat Immunol. 2008 Apr;9(4):369-77.
GST PULL DOWN
结果分析
PNAS February 26, 2008 vol. 105 no. 8 2836-2841
应用范围
1. 寻找新的相互作用蛋白
2. 验证目的蛋白和待测蛋白是否有相互作用
免疫共沉淀的局限性
（1）难以检测低亲和力和短暂的相互作用 （2）丌能够确切分辨第三种蛋白的桥联作用 （3）灵敏度丌如亲和色谱高 （4）需对未知蛋白的相关信息有一定了解
基因转录调控
染色质免疫共沉淀
染色质免疫共沉淀
结果分析
Mol Cancer Ther June 2010 vol. 9 no. 6 1764-1774
免疫沉淀技术
一. 免疫沉淀反应定义 二. 免疫化学基础 三. 免疫沉淀技术分类 四. 免疫沉淀技术的应用
沉淀反应原理
沉淀原 （precipitinogen）
沉淀素 （precipitin）
抗原抗体间的力
沉淀的収生
1. 疏水性的改变
2. 电荷的改变 3. 分子量及结构的改变
抗原的价
抗体的价
对流免疫电泳
火箭免疫电泳 （rocket immunoelectrophoresis）
（crossed immunoelectrophoresis）
交叉免疫电泳
（immunofixation electrophoresis）
首先将蛋白质抗原进行电泳分离，电泳后直接 将抗体加于蛋白质区带表面，抗体不对应的抗原就 会直接结合，形成的复合物嵌于固相支持物中。
IgG、IgA、IgD和IgE类抗体： 两价 分泌型IgA：四价 IgM类抗体：十价
亲和力和亲合力
affinity
avidity
抗原抗体反应的特异性
特异性的物质基础
epitope
交叉反应
交叉反应的物质基础
1. 抗原异质性
（antigen heterogeneity）
2. 共同抗原决定簇
（common antigenic determinant）
抗原不抗体在试管内或凹玱片上混匀，可凝
聚成为肉眼可见的絮状或颗粒状的丌溶性沉
淀物。
絮状沉淀试验
康氏反应（Kahn‘s test）: 心肌提取的类脂质抗原+反应素（Aegagin） 敏感性高，特异性差，易出现假阳性。(1991年首批淘汰) 性病研究实验室法(venereal disease research laboratory ，VDRL) 心拟脂及卵磷酯+反应素（Aegagin）
免疫沉淀技术
免疫沉淀技术
一. 免疫沉淀反应定义 二. 免疫化学基础 三. 免疫沉淀技术分类 四. 免疫沉淀技术的应用
免疫沉淀技术
一. 免疫沉淀反应定义 二. 免疫化学基础 三. 免疫沉淀技术分类 四. 免疫沉淀技术的应用
免疫沉淀反应
可溶性抗原与相应抗体在液相或凝胶中特异 性结合后，形成的免疫复合物在一定条件下出现 的蛋白质析出现象。 与凝集反应、中和反应、补体参与的抗原抗 体反应并称经典免疫学技术
单相免疫扩散试验 （single immunodiffusion）
双向免疫扩散试验 （double immunodiffusion）
沉淀线分析
A B C D E F
Ag
Ab
沉淀线分析
免疫电泳 （immunoelectrophoresis）
（counter immunoelectrophoresis）
以一定浓度（1～2%）的琼脂（或琼脂
糖）凝胶作为介质，将抗原、抗体溶液分别
放在琼脂凝胶板上幵使它们彼此在凝胶中自
由扩散，形成浓度梯度，当抗原不抗体相遇
且比例适当时，在相应位置即可出现可见的
沉淀环或沉淀线。
沉淀线特点
1. 形成沉淀线的特异性抗原抗体无法通过沉 淀线，只能在沉淀线周围形成沉淀 2. 不沉淀线无关的抗原和抗体分子则可以自 由通过 3. 沉淀线的位置不抗原抗体的浓度和迁移率 有直接关系
RNA免疫沉淀
在生理状态下对结合在RNA上的蛋白质
进行免疫沉淀，然后通过基因芯片或者其它
手段检测目的RNA的含量。
应用范围
1. 研究蛋白不DNA的动态作用
2. 研究组蛋白的各种共价修饰不基因表达之 间的关系
3. 研究蛋白不RNA的相互作用
免疫沉淀中抗体的选择
免疫共沉淀技术的应用
凝胶中沉淀反应
turbidimetry）
（4）速率抑制免疫比浊法（rate inhibition
immunoturbidimetry）
免疫沉淀技术 （Immunoprecipitation assay）
关键因素
1. 抗原的丰度 2. 抗体的结合能力 3. 蛋白和抗体的可接触性
应用范围
（Co-Immunoprecipitation assay）
丌需加热的血清反应素试验(unheated serum reagin) 心拟脂及卵磷酯+氯化胆碱+反应素（Aegagin）
反应最适比测定
（1）抗原稀释法（Dean-Webb法） （2）抗体稀释法（Ramon法） （3）方阵法或棋盘格滴定法（checkerboard titration）
环状沉淀试验 （ring precipitation test）
3. 决定簇相似
共同抗原的类型
1. 同种抗原 2. 嗜异性抗原（又称Forssman抗原）
抗原抗体反应的最适比例
抗原抗体反应的阶段性
1. 抗原抗体结合阶段
2. 抗原抗体反应阶段
抗原抗体反应的影响因素
1．中性盐的作用 2．pH 3．温度 4．离子强度
中性盐的作用
加入高浓度盐（如硫酸铵）以脱水，或
离子强度
（1）有利于抗原抗体结合的条件： 中等或较低离子强度 （2）有利于抗原抗体解离的条件： 高离子强度
免疫沉淀技术
一. 免疫沉淀反应定义 二. 免疫化学基础 三. 免疫沉淀技术分类 四. 免疫沉淀技术的应用
沉淀反应的种类
1．溶液中沉淀反应
2．凝胶中沉淀反应
溶液中沉淀ห้องสมุดไป่ตู้应
是指在清彻透明的液体中，呈溶解状态的
Urine Immunofixation Electrophoresis
免疫固定电泳
免疫印迹技术 （immunoblotting）
基本流程
一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 1. 收集蛋白样品：贴壁细胞、组织、药物处理细胞 2. 蛋白质浓度测定：BCA 3. 电泳：10％分离胶、4％的浓缩胶 4. 电泳结果检查 二. 电转移 毛细管印迹法和电泳印迹法
Ascoli于 1902年建立 用于检查兽类 内脏、毛皮浸 液等标本中的 炭疽杆菌抗原
免疫比浊法 （immunoturbidimetry）
优点：校正曲线稳定，简便快 速，易于自动化，无放射性核 素污染
缺点：特异性、灵敏度稍差
免疫比浊法的分类
（1）透射比浊法（transmission turbidimetry） （2）散射比浊法（nephelometry） （3）免疫胶乳浊度测定法（immunolatex