BD分析TH17细胞
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流式细胞术分析TH17细胞
1.肝素钠真空抗凝采血管取人外周血全血1-2ml，血液室温放置，8小时内进行检测，否则需弃用。
2.取5个流式管，分别标记空白管、CD4抗体单染管、IL-17A抗体单染管、IL-17A同型对照抗体管、待测管，每个流式管分别加入100µl全血，用RPMI1640(不含FBS)1:1等体积稀释。
3.刺激细胞活化：向稀释后的全血样本管加入2µl BD Leukocyte Activation Cocktail with BD GolgiPlug，货号550583(刺激剂和蛋白转运抑制剂)，混匀。37o C，5%CO2培养箱或37o C水浴孵育4-6小时(不超过6个小时)。
4.细胞表面标记染色：向CD4抗体单染管、IL-17A同型对照抗体管、待测管这三管分别加入1Test体积的CD4抗体，室温避光孵育15-30分钟。
5.制备红细胞裂解液：制备1X.红细胞裂解液(BD Lysing Buffer10X，货号555899)，取10X红细胞裂解液，按照体积.1(10X红细胞裂解液)：9(dH2O)，稀释。
6.每100µl全血加入2ml1X红细胞裂解液，室温裂解15-30min，至细胞悬液呈澄清透明状。
7.裂红后，500g，离心5分钟，洗涤细胞，离心后弃上清。
8.加入1ml FBS（货号554656），500g，离心5分钟，洗涤细胞，离心后弃上清。
9.破膜固定液制备(货号554714)，554714包括Fixation/Permeabilization solution和BD Perm/Wash™Buffer(10X)。Perm/Wash™Buffer(10X)需要稀释：1体积BD Perm/Wash™Buffer(10X)，9体积distilled H20，1：9混合，配制成1XPerm/Wash™Buffer
10.细胞固定：涡旋细胞3秒钟，每管加入250µL Fixation/Permeabilization solution，涡旋混匀，4°C孵育20分钟。
11.破膜：每管直接加入1ml1X Perm/Wash Working Solution到固定的细胞中，4°C，500g离心10分钟，弃上清。
12.每管加入1ml1X Perm/Wash Working Solution，4°C500g离心10分钟，弃上清。
13.胞内染色：每管加入50ul1X Perm/Wash Working Solution，同时IL-17A抗体单染管、待测管加入1Test体积的IL-17A抗体，IL-17A同型对照抗体管加入1Test体积的IL-17A同型对照抗体，涡旋混匀，4°C避光孵育40-50分钟。
14.涡旋细胞，每管加入1ml1X Perm/Wash Working Solution，4°C500g离心10分钟，弃上清。
15.重复第14步骤一次，每管加入350ul FBS（货号554656）洗液，上机检测即可。