玻璃化、褐化现象的防治技术
组织培养褐化原因以及防止措施
褐化原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。
在组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题。
而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。
因此，能否有效地控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。
(一)褐变的原因影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。
1.与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。
一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。
多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。
2.与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。
因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。
3.与外植体取材时间有关一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。
即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。
4.与培养基有关过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。
例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。
植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。
培养基的PH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。
植物组织培养中的褐变现象与防止方法
植物组织培养中的褐变现象及其防止措施摘要：细胞受损后，由于细胞区隔作用被破坏，毒性酚类或其氧化物醌类物质毒害细胞，导致组织褐变，植物组织培养过程中培养低效或失败。
目前认为组织培养中褐变程度主要受外植体材料的基因型、生理状态、种类、大小、预处理、培养条件、培养基及培养方式的影响。
在目前的研究中控制褐变的有效方法主要有低温培养、暗培养、勤转种、添加抗氧化剂、增效剂或吸附剂于培养基中等。
关键词:植物;组织培养;褐变;防治方法褐变是植物组织培养中一种普遍存在的现象，是由于组织中多酚氧化酶被激活，使细胞酚类物质被氧化而产生棕褐色醌类物质，这种褐变现象又被称为酚污染。
多酚类物质及其氧化物醌类物质会抑制其它酶的活性，从而毒害整个外植体，严重影响外植体的脱分化、再分化和生长。
褐变这种现象与菌类污染和过度含水化(即玻璃化)并称植物组织培养的3 大难题。
目前褐变已成为植物组织培养发展的一大障碍[1]。
1 褐变现象的原因1.1 非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。
诸多不利条件都可以造成细胞的程序化死亡，但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生。
1.2 酶促褐变多数认为，植物组织培养中的褐化现象主要是由酶促褐变引起的，即由多酚氧化酶( P PO ，Polyphenol Oxidase) 作用于天然底物酚类物质而引起的。
在正常条件下,细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡,醌类物质水平较低;而酚氧化酶及其底物分布在正常组织的不同部位，酚类物质分布在细胞的液泡内，酶则分布在各种质体或细胞质内，这种区域性分布致使底物与酶被质膜分隔开来；但当外植体或培养材料处于机械损伤等逆境，或细胞受伤或衰老时，细胞膜结构或细胞中物质区域化分布的破坏会导致酚氧化酶释放或合成，如果此时在合适的pH 和温度等条件下，酚氧化酶、酚类（底物）和氧发生酶促氧化反应，形成有毒的棕褐色醌类物质,从而使组织发生褐变。
组培中常见问题分析
组培苗在培养过程中常见问题分析一、植物褐化A、原因可能有：1、植物本身含有较多的酚类物质，在切割外植体时，从伤口渗透出来，直接渗入培养基中，或在继代培养时不断形成并渗出。
2、（1）外植体的取材部位及季节（2）培养基成分，浓度过高的无机盐和高浓度6-BA、KT 等容易加重褐化。
（3）培养条件不当，温度过高培养时间过长、光照过强，均可以提高多酚氧化酶的活性。
B、防止措施：1、选择合适的外植体：选取幼龄材料，选合适部位，时间一般在初冬或初春2、暗培养或勤转瓶3、弱光培养、低温培养4、添加活性炭或抗氧化剂等5、可以降低无机盐含量，由全量降为半量，减少铵态氮的含量。
二、玻璃化现象A、原因可能有：1、培养温度高2、生长素种类及其配制比例不合适。
铵态氮及碳源对某些植物培养不适宜。
B、防止措施：1、降低培养瓶内的湿度，增加琼脂量，每瓶接种量减少三分之一2、降低培养温度3、增加光照4、降低培养温度5、降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。
也可以降低或去除铵态氮。
6、在培养基中加入1.0~5.0g/L活性炭。
三、黄化现象A、原因可能有：1、培养基中铁元素含量不足，激素配比不当，糖用量不足。
2、培养瓶温度不适，光照不足。
3、pH值有问题。
（培养基配置不正确）B、防止措施：1、检查培养基配置过程，保证培养基成分正确添加2、调节培养基的成分和pH值3、控制培养室温度，增加光照，用透气盖改善瓶内通气情况四、污染现象A、原因可能有：1、原瓶苗有污染2、接种工具灭菌不彻底3、操作时认为带入菌4、接种环境不干净5、原瓶苗细菌性污染（浑浊水渍状、或泡沫发酵状）常由于灭菌锅未排尽冷空气、灭菌锅压力温度不够，计时不准确造成。
6、原瓶苗真菌性污染（出现各种颜色的孢子），可能是由于空气、瓶口及瓶盖真菌孢子引起。
B、防止措施：1、正确使用灭菌锅2、接种工具每次使用完后要消毒灭菌，接种时，手不要碰盘子的任何地方，用镊子夹盘子。
3、污染的原瓶苗要及时淘汰，如果原瓶苗数量少要进行灭菌4、接种时，要保证接种环境的干净卫生，台内工具不宜放太多。
1-5 植物组织培养中常见问题及解决办法
（二）减轻褐变现象发生的方法
（3）使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱
氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够有效地避免 或减轻很多外植体的褐变现象。
培养基中添加0.1%～0.5%的活性炭对防止 褐变也有较为明显的效果。
（二）减轻褐变现象发生的方法
（4）连续转移：对容易褐变的材料可间隔
的成败有着至关重要的影响。结
合你的实践经验，分析如何降低
组培过程中污染现象的发生？
1）植物品种
由于多酚氧化酶活性上的差异，有些品种 的外植体在接种后较易褐变，而有些品种 的外植体在接种后不易褐变。
2）生理状态：
一般来说，老熟的组织在接种后褐变程度较
幼嫩组织严重。
3）培养基成分：
浓度过高的无机盐会使褐化程度增加；
细胞分裂素水平过高也会刺激某些外植体的 多酚氧化酶的活性，从而使褐化现象加深。
（二）、继代培养阶段
• 1、苗分化数量少、速度慢、 分枝少、个别苗生长细高
• 可能原因：细胞分裂素用量
不足，温度偏高，光照不足。 • 改进措施：增加细胞分裂素 用量，降低温度，改善光照， 改单芽继代为丛芽继代。
2、苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，
苗丛密集，微型化
可能原因：细胞分裂素用
量过多，温度不适宜。
（一）、初始培养阶段
1、培养物变色、坏死、茎断面附近 干枯
可能原因：表面杀菌剂过量，消毒 时间过长，外植体选用不当 改进措施：调换其他杀菌剂或降低 浓度，缩短消毒时间，试用其他部
位，生长初期取材。
2、培养物长期培养几乎无反应
可能原因：基本培养基不适 宜，生长素不当或用量不足， 温度不适宜。 • 改进措施：更换基本培养基 或调整培养基成分，增加生 长素用量，试用2，4-D，调 整培养温度。
植物组培中玻璃化现象及其预防措施
低 的浓度 ， 如非 洲 菊 只有 在 Ｂ ～ ０ ／ 才能 诱 Ａ ２ １ｍｇ Ｌ时 导 幼 花托 脱 分化形 成 愈 伤组 织 ， 在愈 伤 组 织上 诱 并
导不 定芽 ；而在丛 生 芽增 殖过 程 中 ， Ａ １ ／ Ｂ ｍｇ Ｌ即可
１ 玻璃化苗 的特 点与发 生原 因
ＮＨ ＋ ４水平 的 Ｂ ５培 养基 。 （ ） 加 自然光 照 ， 照 强度 较 弱 时 ， ６增 光 可通 过 延 长 时 间进行 补偿 。
的 消毒 和清 洗后很 容 易水渍 状 ， 继而 产生 玻璃 化 。
２５ 光 照 时 间 ．
光 照影 响 光合 作 用 和碳 水 化 合 物 的合 成 ， 照 光
普遍 。
２ 影 响玻 璃 化 苗产 生 的 因素
２１ 生长调 节剂 ．
正常 的比例很 低 ， 继代 培养 中仍 然形成 玻璃 苗 ， 玻 且 璃苗 的分化 能 力低 下 ， 以增 殖 生 根成 苗 。由于 玻 难 璃苗 的生 理功 能异 常 ， 以移栽 成活 ， 难 因此 玻璃苗 的
试 管苗 玻璃 化研究 的重 点 。■
信 资 息 讯
鬻 ０
杭州 农业科学研霪陀 验． 获得食晶检验机构资质 １ ，
日前 ， 州 市农 科 院 实验 中心通 过 省 级计 量 认 证 复评 审 和 扩项 评 审 ， 杭 同时获 得 食 品
检验 机构 资 质认 定证 书 ，获 准 的检测 项 目由原 来 的 １５项 扩 展 到 ２０项 ，覆 盖 土壤 、 ６ ７ 水 质、 空气 、 品 、 食 植物 性食 品 、 物源 性食 品 、 产 品 、 叶 、 料等领 域 。 动 水 茶 饲 至此 ， 州市 农 科 院 实验 中心 已有 中 国合 格 评 定 国家 认 可 委实 验 室认 可 、 江 省计 杭 浙 量认 证 、 业 部农 产 品质 量安 全检 测机 构 、 品检 验机 构 等 四项 资质 。为 更好 的服 务 “ 农 食 三 农 ”提高杭 州 市农产 品质量安 全水 平作 贡献 。 、
植物组织培养的三大难题及解决方法
植物组织培养的三大难题及解决方法摘要：植物组织培养是以细胞全能性为理论基础建立的一种离体培养技术，阐述了植物组织培养快繁中褐变、玻璃化、污染和移栽成活率低等问题出现的原因，提出预防和控制措施。
关键词：植物组织培养；污染；玻璃化；褐化中图分类号：q813.1+2 文献标识码：a 文章编号：1674-0432（2012）-11-0142-2植物组织培养是利用植物体的一部分进行无性繁殖，而产生大量同源母本基因幼苗的生物技术。
植物的组织培养到如今以和农业、园艺、林业、医药等多个方面有了密不可分的关系，为其提供了理论基础和研究方法。
利用自然条件在获得珍稀植物和经济价值较高的植物时，由于受地域及季节的限制，很难达到高效、快速的目的。
通过组织培养这一技术手段则能满足这一要求。
组织培养在挽救珍稀植物、创造新物种等方面做出了重要的贡献[1]。
但是在植物的组培技术上面临的三个难题却经常困扰大家。
它们分别是污染，植物玻璃化和植物褐化。
1 污染污染是在组培过程中所面临的首要难题，该问题经常遇到并且难以解决。
不能把污染率降低到可行的范围内植物组培就很难进行下去，这是该问题所要面对的第一个难题。
在进行植物的组织培养时，通常存在两种污染方式：一种是外植体消毒不彻底以及无菌操作过程中引起的污染；另一种是引起内源菌污染的主要原因的真菌和细菌[2]。
大多数的研究结果表明引起污染的主要原因为外植体的生长状况、环境条件和操作过程[3]。
外植体污染是最难解决的污染之一。
污染来源主要为外植体处理不当或培养基的灭菌不彻底，或对接种工具的消毒不够，或操作人员的操作不慎，或环境不洁等所致。
选取外植体的原则是污染少易启动[4-5]。
选择有最大分化潜能的外植体是确保组织培养成功的关键[6]。
常规试验一般选用0.1%hgcl2溶液浸泡，再用无菌水对外植体进行反复冲洗，灭菌效果最好且污染率低。
胡重怡等在烟草无菌苗培养前种子消毒技术的研究中使用先用70%c2h5oh溶液进行消毒，再用30%h2o2的浸泡，再用无菌水反复冲洗外植体，所得烟草种子污染率底[7]，h2o2分解后生成有杀菌作用的氧气而成为无毒害的化合物[8-9]对外植体的损害小。
蓝莓组织培养中污染褐变玻璃化的防止措施
蓝莓组织培养中污染褐变玻璃化的防止措施作者：于永梅王冰余海英来源：《现代农业科技》2018年第10期摘要在蓝莓组培过程中很容易产生污染、褐变、玻璃化等现象，这些都直接限制了蓝莓规模化生产。
本文总结了蓝莓组织培养过程中污染、褐变、玻璃化现象的主要防止措施，以期为蓝莓组织培养提供参考。
关键词蓝莓；组织培养；污染；褐变；玻璃化；防止措施中图分类号 S633.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）10-0105-02蓝莓为多年生小灌木树种，春季早花，夏季果熟，入秋叶呈红色，观赏效果极佳，可作为观光果园栽培树种，也可制作盆景；其果实中含有花青素、黄酮等多种多酚类生理活性成分，具有明目、防止脑神经衰老、抗癌、抗氧化等多种生理活性功能，越来越受到消费者的青睐，经济价值较高，市场潜力巨大，开发前景广阔。
蓝莓组培育苗技术的研究，采用蓝莓组培快繁技术，短期内获得大量的无病毒苗木。
探讨蓝莓苗木的工厂化技术育苗体系，有助于我国蓝莓产业化发展，满足社会需求[1-2]。
但在蓝莓组培过程中，很容易产生污染、褐变、玻璃化等现象，限制了蓝莓的组培快繁和大规模生产，是目前急需解决的关键问题。
笔者总结了蓝莓组织培养繁育中常出现的污染、褐变、玻璃化的防止措施，对蓝莓苗木的快速繁殖和推广具有重要意义。
1 污染1.1 操作人员注意卫生首先要注意工作人员卫生，工作人员进入无菌室不能吃东西、吸烟等，应常剪指甲。
工作服要每周清洗消毒1次，夏季要每3 d清洗消毒1次，工作服灭菌后在缓冲室更换；一次性用品要及时更换，口罩、帽子要经常清洗。
进入无菌室前要用肥皂洗手，进入培养室后再用75%酒精对双手进行消毒[3]。
1.2 改善接种室环境条件接种室应保持密闭、洁净；培养室应控制空气相对湿度在70%左右，湿度太高时可用抽湿机除湿。
每次接种前均应清洁接种室的地面，并喷75%酒精沉降灰尘，然后打开紫外灯灭菌20～30 min，紫外灯灭菌结束后，用75%酒精擦洗工作台面。
草莓茎尖组织培养防褐化及玻璃化研究
草莓茎尖组织培养防褐化及玻璃化研究付崇毅;姜伟;王建国;杜金伟【摘要】以草莓茎尖和分化形成的不定芽为试验材料，研究了不同防褐化措施对草莓茎尖愈伤诱导及抗褐化效果的影响，继代培养中逐代降低6-BA浓度对不定芽增殖及玻璃化的影响。
结果表明：草莓茎尖诱导培养基6-BA最适宜浓度为1．5mg／L，在诱导培养基中添加50mg／L Vc可显著降低茎尖褐化率，黑暗预处理对防止草莓茎尖褐化效果不显著。
在草莓组培苗继代培养基质中逐代降低6-BA浓度，可抑制草莓组培苗玻璃化。
【期刊名称】《北方农业学报》【年(卷),期】2016(044)001【总页数】6页(P46-51)【关键词】草莓;组织培养;褐化;玻璃化【作者】付崇毅;姜伟;王建国;杜金伟【作者单位】内蒙古农牧业科学院,内蒙古呼和浩特010031;;;;【正文语种】中文【中图分类】S668.4草莓属于蔷薇科草莓属多年生常绿草本植物，其生长周期短、果实成熟早,经济效益好，是我国栽培最早、面积最大的设施果品种类之一。
目前，内蒙古自治区日光温室草莓种植面积已超过667 hm2，并呈迅速发展态势。
近年来随着草莓组培脱毒苗的推广普及，草莓组培脱毒苗需求量增加。
但因内蒙古自治区当地缺少专业的草莓育苗企业，加之内蒙古自治区科研单位对草莓组培脱毒苗繁育技术缺乏系统、连续性的研究，生产上所需草莓苗大部分由自治区外调入，草莓组培脱毒苗供应不足的问题日益严重。
目前，草莓茎尖组织培养是生产上获得脱毒苗的主要途径之一。
有关草莓组培脱毒的研究报道很多，主要集中在脱毒方法及检测[1~3]，组培环境、营养及激素条件[4-5]，组培过程中细胞发育及生理[6]等方面的研究。
本试验在国内现有研究基础上，对草莓茎尖组培快繁的生长条件进行了研究，尤其针对草莓组培过程中出现的褐化、玻璃化等问题，开展了大量研究，以期建立草莓组培脱毒苗的快繁体系，为内蒙古自治区草莓组培脱毒苗规模化快速培育种苗提供技术支持。
褐化、白化、玻璃化、黄化的现象的解释
植物组织培养中的常见问题与对策摘要: 探讨了影响植物组织培养的主要因素, 分析了污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等产生的原因, 并提出了解决措施。
认为: 污染主要是由灭菌不彻底和环境不洁造成的, 加强外植体和培养基的灭菌, 对培养环境及用具彻底消毒, 可大大降低污染率。
培养时间和培养基的组成影响畸形胚的发生, 缩短培养时间, 调整培养基中激素含量, 可使畸形胚转化为正常苗。
培养基的种类、温度、通气状况等会影响玻璃苗的发生, 选择适当培养基, 降低温度, 增强光照, 改善通风等可使玻璃化率降低。
植物品种、取材部位及环境条件与褐变的发生密切相关, 选择适宜的外植体, 进行暗处理, 添加抗氧化剂和吸附剂等可有效控制褐变。
培养基中铁含量不足, 激素配比不当等会导致黄化,正确添加培养基的各种成分, 增强光照, 及时转接可减少黄化。
关键词: 组织培养; 污染; 褐化; 畸形胚; 玻璃苗中图分类号: Q945. 4文献标识码: A文章编号: 1673- 2006( 2010) 11- 0054- 04 收稿日期: 2010- 04- 10作者简介: 王桂荣( 1972- ), 女, 安徽宿州人, 实验师, 主要从事植物及植物生理实践教学与实验室管理。
植物组织培养技术广泛应用于植物脱毒快繁、育种、种质保存、获得次生代谢产物、突变诱发、细胞工程和基因工程等方面, 而且在医药、食品工业、能源工业、环境保护各个领域显示出极大的生产潜力,产生了巨大的经济效益和社会效益, 已成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。
但在植物初代培养和继代培养过程中经常会遇到一些问题, 如污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等, 影响实验结果, 甚至导致实验失败, 给科研和生产造成损失。
本文根据近年的研究文献及本人的工作实践, 对这几个问题产生的原因及解决措施进行了论述, 以供参考。
1. 1污染产生的原因污染是在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌, 导致培养失败。
任务四植物组培过程中异常现象诊断与防治
任务四植物组培过程中异常现象诊断与防治（4学时）【任务提出】：植物组织快繁过程（初代、继代、生根及驯化）中，观察可能出现的异常情况，请详细记录并研究解决方案。
【任务解析】：植物组织培养过程中，难免会出现一些异常情况，常见的现象主要是污染、褐化和玻璃化，如污染主要以细菌与真菌污染为主，在培养基的表面滋生大量菌斑，造成培养材料不能生长和发育的现象；褐变是指外植体在接种后，其表面开始变褐，有时甚至会使整个培养基变褐；玻璃化是指当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明状，呈水迹状，这些现象一直困扰工作人员。
【相关知识】：一、污染（一）污染的含义污染是组织培养最常见和首要解决的问题。
所谓污染是指在组织培养过程中，由于细菌、真菌等微生物的侵染，在培养基的表面滋生大量菌斑，造成培养材料不能生长和发育的现象。
（二）污染的类型与症状引起污染的微生物主要有芽胞杆菌、大肠杆菌等细菌和毛霉、根霉、青霉等真菌，与此相对应的污染类型就分为细菌性污染和真菌性污染。
细菌性污染的症状是菌落呈黏液状，颜色多为白色，与培养基表面界限清楚，一般接种后1～2d就能发现；而真菌性污染的症状是菌落多为黑色、绿色、白色的绒毛状、棉絮状，与培养基和培养物的界限不清，一般接种后3～10d后才能发现。
实际培养中要明确辨认出是哪种污染，以便有针对性地采取防治措施，从而提高组培成功率。
（三）组织培养过程中的污染源（1）户外风大菌类进屋机会多（2）屋内太潮菌类繁衍多（3）物品带菌多（4）屋内不干净（5）屋内清理带菌组培苗（6）接种不正确（四）预防措施（1）通风：经常开窗，保持室内空气流通可以使室内真菌数量减少。
通风方法简便易行，应多使用。
（2）去湿：保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长繁殖。
（3）光照：紫外线能杀灭或抑制真菌生长，对减少室内真菌污染大有好处。
（4）防霉：污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。
褐变与玻璃化
玻璃化产生原因
• 玻璃苗产生原因可能是培养基中可利用的 水含量过高，试管苗课吸收的水分太多， 植物内基友过多的游离水引起的。因为水 势不当导致乙烯产生，乙烯过饱和引起解 氨酶活性降低，阻碍木质化进程，从而降 低课细胞壁的压力使水分大量进入，导致 玻璃苗。
• 改变供氮形态。适当减少铵态氮而提高硝态氮。降低培养基 中的铵态氮含量并及时转移。
• 可适当延长光照培养的时间会增加自然光照，提高光强。 • 适当提高培养基中的无机盐的含量。
• Thanks
• 温度和光照：外植体接种后，培养基的温度和光照条件也常 对外植体的褐变程度有一定的影响。在15℃—25℃培养比在 25℃以上培养褐变程度变轻。光照能促进植物组织中酚的氧 化，因为黑暗有利于克服褐变。
• 外植体大小：一般材料太小易产生褐变。
• 外植体组织的受伤程度：受伤程度越大褐变可能越大。
• 材料转移时间：在培养过程中，如果推迟继代时间，会导致 材料褐变，最终死亡。
• 外植体取样时间：一般在春季采取生长旺盛部位的 外植体所产生的褐变较轻，已经木栓化或者木质化 的枝条和处于休眠状态的休眠芽作为外植体时较严 重。
• 培养基：固体培养基或者液体培养基等其中的无机盐、激素 等的种类和浓度都对于褐变有巨大的影响。液体培养基能有 效降低褐变，加上滤纸的效果会更好。降低无机盐浓度，尤 其是锰离子和铜离子的浓度，可减少酚类物质外溢，外植体 的褐变程度减轻。培养基中的细胞分裂素不仅促进酚类化合 物的合成，而且还刺激多酚氧化酶的活性，较高浓度的BA或 激动素加重外植体的褐变，相反，生长素类物则会延缓多酚 合成，减轻褐变。PH较低时也会减轻褐变。
褐变与玻璃苗产生原因与预防
褐化、白化、玻璃化、黄化的现象的解释
do:i 10. 3969 / j. issn. 1673- 2006. 2010. 11. 019植物组织培养中的常见问题与对策王桂荣(宿州职业技术学院, 安徽宿州市234000)摘要: 探讨了影响植物组织培养的主要因素, 分析了污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等产生的原因, 并提出了解决措施。
认为: 污染主要是由灭菌不彻底和环境不洁造成的,加强外植体和培养基的灭菌, 对培养环境及用具彻底消毒, 可大大降低污染率。
培养时间和培养基的组成影响畸形胚的发生, 缩短培养时间, 调整培养基中激素含量, 可使畸形胚转化为正常苗。
培养基的种类、温度、通气状况等会影响玻璃苗的发生, 选择适当培养基, 降低温度, 增强光照, 改善通风等可使玻璃化率降低。
植物品种、取材部位及环境条件与褐变的发生密切相关, 选择适宜的外植体, 进行暗处理, 添加抗氧化剂和吸附剂等可有效控制褐变。
培养基中铁含量不足, 激素配比不当等会导致黄化,正确添加培养基的各种成分, 增强光照, 及时转接可减少黄化。
关键词: 组织培养; 污染; 褐化; 畸形胚; 玻璃苗中图分类号: Q945. 4文献标识码: A文章编号: 1673- 2006( 2010) 11- 0054- 04收稿日期: 2010- 04- 10作者简介: 王桂荣( 1972- ), 女, 安徽宿州人, 实验师, 主要从事植物及植物生理实践教学与实验室管理。
植物组织培养技术广泛应用于植物脱毒快繁、育种、种质保存、获得次生代谢产物、突变诱发、细胞工程和基因工程等方面, 而且在医药、食品工业、能源工业、环境保护各个领域显示出极大的生产潜力,产生了巨大的经济效益和社会效益, 已成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。
但在植物初代培养和继代培养过程中经常会遇到一些问题, 如污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等, 影响实验结果, 甚至导致实验失败, 给科研和生产造成损失。
本文根据近年的研究文献及本人的工作实践, 对这几个问题产生的原因及解决措施进行了论述, 以供参考。
植物组培过程中玻璃化现象的发生与解决措施
植物组培过程中玻璃化现象的发生与解决措施植物组培中，玻璃化是植物根系发生破坏性变化，玻璃化现象普遍出现的一种不良情况。
它是指根系细胞因严重脱水而变脆，其内部构造发生破坏，呈现玻璃样的变性的状态。
玻璃化的发生主要有以下几个原因：一是土壤水分含量过低、温度过高，过轻的培养基组分。
通常土壤的水分含量低于25％左右，温度过高，养分的含量也较低，根系就容易干涸，玻璃化的发生概率就较大。
二是植物营养不均衡。
营养元素不均衡，尤其是氮磷钾含量偏低，有利于细菌病害的发生，也难以满足植物生长和发育的需要，从而容易造成玻璃化现象。
三是移栽后适应不良。
植物移栽后，由于环境、温度、水分等条件的变化，植株比较难以适应，容易出现衰亡现象，如果不得到及时的治疗，就会出现玻璃化的状况。
针对玻璃化的发生，种植者可根据具体情况采取以下措施：1、保证良好的土壤水分含量。
水是植物根系发育和活动的重要基础，因此，改善水分质量是防止玻璃化现象的有效措施之一。
2、分解肥料，保持植物良好的营养状态。
根据植物的特点，选择适合的肥料，经过多次分解施入土壤，以保证植物的健康发育。
3、严格移栽植物的保护措施。
移栽植物时，应注意把植株保护好，移栽后的植物的补水及时、恰当，切忌过量浇水，以减少植物衰亡。
4、及时治疗已发生玻璃化现象的种植品。
采用有效的抗病菌、补水调理等措施，尽早挽救受害植物。
综上所述，植物组培中玻璃化的发生主要由土壤水分含量低、植物营养不均衡、适应不良等因素造成，可采取的措施包括保证良好的土壤水分含量、分解肥料、严格移栽保护以及及时治疗受损种植品等。
期望以上解决措施能够有效减少植物组培玻璃化现象的发生，并保证植物的健康发育！。
植物组培中褐变的原因及其预防措施
植物组培中褐变的原因及其预防措施录入时间:2010-10-21 9:07:57 来源：植物组培网褐变是指在组织培养过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也慢慢变褐而死亡的现象。
1、褐变的原因很多植物尤其是木本植物体内含有较多的酚类化合物。
在完整植物体的细胞中，酚类化合物和多酚氧化酶分隔存在，因此比较稳定。
当外植体切割后，切口附近细胞的分割效应被打破，酚类化合物被多酚氧化酶氧化形成褐色的醌类化合物，醌类化合物又会在酪氨酸酶的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，导致组织代谢紊乱，生长受阻，最终逐渐死亡。
2、影响褐变的因素（1）植物基因型在不同植物或同种植物不同基因型的组培过程中，褐变发生的频率和严重程度存在很大的差异，这是由于各种植物所含的单宁及其他酚类化合物的数量不同。
一般木本植物的酚类化合物含量比草本植物高，更易发生褐变现象。
核桃的单宁含量很高，不仅在接种初期发生褐变，在形成愈伤组织后还会因为褐变而死亡；苹果进行茎尖培养时，不同品种之间褐变的程度也不一样。
对葡萄的研究也发现类似情况。
（2）外植体的生理状态外植体的生理状态不同，接种后褐变程度不同。
一般外植体的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也就越容易褐变，成龄材料一般均比幼龄材料褐变严重。
另外切口越大，酚类物质的被氧化面也越大，褐变程度就会更严重。
因此外植体的受伤程度对褐变的产生具有明显的影响，伤口加剧褐变的发生。
仙客来小叶诱导时，整片叶接种较分成多块褐变要轻。
除机械损伤外，各种消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变，对于不易褐变的种类，用升汞消毒后，一般不会引起褐变，若用次氯酸钠进行消毒，则很容易引起褐变的发生。
（3）取材时间和部位在不同的生长季节，植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶的活性不同。
实验表明在苹果和核桃上，冬、春季取材褐变死亡率最低，夏季取材很容易褐变。
在取材部位上幼嫩茎尖比其他部位褐变程度低，木质化程度高的节段在进行药剂消毒处理后褐变现象更为严重。
组培过程中的玻璃化问题及防治
组培过程中的玻璃化问题及防治在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透时，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。
这种试管苗生长异常现象就是P.Debergh（1981）首先命名的“玻璃化”（V itrification）。
是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。
玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和森质素含量低、角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材；生根困难，移栽后也很难成活。
植物微体快速繁殖时玻璃苗的出现已成为一种很普遍的现象，该苗有时多达50%以上，严重影响繁殖率的提高，已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费，所以试管苗下班化现象对植物组织培养的危害是相当严重的，也是亟待解决的问题。
（一）玻璃苗发生的因素琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。
Daniel G. W. Brown认为玻璃化可能是培养基渗透势不当所致。
碳源不仅为芽的形成提供能量，而且也起渗透调节作用，主要影响培养基的渗势（Salisbury等）。
随琼脂浓度及纯度的增加，培养基硬度增加，从而影响其衬质势和水分状况。
Debergh等研究表明，液体培养基的水势影响玻璃苗的形成，Ziv等认为只要降低培养容器中的相对湿度，就可以降低玻璃苗的比例。
刘思颖等（1988）测得丝石竹玻璃苗叶片的水势约为正常苗的 1.9倍，含水量为正常苗的2.09倍—2.21倍。
自由水和高湿度可能与肉质嫩梢的形成有关。
Davis等研究表明，液体培养是导致玻璃化的主要原因。
可以断定，试管苗玻璃化可能是培养基内水分状态不适应的一种生理变态。
许多学者证明培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化成正相关，BA浓度越高或培养温度越高，玻璃苗比率越大。
植物组织培养中的褐化现象和解决途径
褐化发生的形式及褐化发生机理 影响褐化的因素 防止褐化的途径 展望
பைடு நூலகம்
褐化发生的形式及褐化发生机理
褐化分为酶促褐化和非酶促褐化 1.非酶促褐化是由于细胞受胁迫条件或其它不利条件影响所造成的细胞死亡或自然发生的细胞死亡而造成的褐化其中不涉及到酚类物质的产生 2.酶促褐化是因为酚类物质的参与而引起的褐化现象
防止褐化的途径
一.选择适当的外植体 外植体组织的受伤害程度直接影响褐变的发生 Bonga认为外植体越小切面与体积的比率越大伤害及褐化的程度越大这在巨桉和卡德兰的组织培养中得到验证 Pruveni和Kipnis用椰子的完整胚、叶片作外植体进行培养也很少发生褐变 因此在切取外植体时应尽可能减少其伤口面积伤口剪切尽可能平整些切取外植体时还应考虑其粗度细的可切短些粗的可切长些
影响褐化的因素
1.外植体自身：包括外植体的生理状态、生长状态、外植体的遗传特性等 2.外植体所处的培养环境：包括培养基的成分及培养条件的影响
一.植物种类及基因型 1.不同物种之间褐化程度差异很大 2.同种植物的不同品种间也存在一定差异 橡胶树的花药培养中发现海垦2号花药的褐变较少因而愈伤组织化容易而有些品系花药容易褐化诱导困难； 银杏的众多品系中佛手品系比梅核品系诱导愈伤织困难 这些可能是由于外植体的基因型差异引起的
酶促褐化必须具备酶、底物和氧三个条件 1.酶 ：多酚氧化酶PPO、过氧化物酶POD、苯丙氨酸解氨酶PLA等 2.底物 ：酚类化合物 3.氧气
酚类物质的共同结构特点是都含有带羟基的苯环结构. 按其组成结构可分为: 1.苯基羧酸类包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等、 2.苯丙烷衍生物包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等、 3.黄烷衍生物包括花青素、黄酮、芸香苷等三大类
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1％～0.5％的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显 。在许多热带树木的组织培养中均曾观察到活性炭防 止外植体褐变的明显效果。
4.培养条件
如温度过高、光照过强、培养时间过长等，均可使多酚氧 化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。
白玉兰组织培养过程中的褐化控制
何为玻璃化
在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异 常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透时， 水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷 曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性 气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。这种试管 苗生长异常现象就是P.Debergh（1981）首先命名 的“玻璃化”（Vitrification）。是植物组织培养过 程中所特有的一种生理失调或生理病变。
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③ 培养基水势，培养基中离子种类,比例不适。
适当提高培养基中蔗糖含量或加入 渗透剂，降低培养基中的渗透势，减 少培养基中植物材料可获得的水分， 造成水分胁迫。
花楸组织培养中玻璃化现象的发生与防治
④ 环境温度、光照强度和通气性。温度过低或过高,光照时 间强度不足及培养容器中空气湿度过高，透气性较差所造成 的通气不良,易造成组培苗含水量高,从而发生玻璃化现象。
3.培养条件不适宜 如温度过高、光照过强、培养时间过长等，均可使多酚氧 化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。在咖啡组织培 养中曾观察到这一现象。
褐化的防治
1.选择适宜的外植体及最佳培养基
成年植株比实生幼苗褐变的程度严重，夏季材料比冬季及早春和秋 季的材料褐变的程度强。而冬季的芽进入深休眠状态，不太容易生 长，所以最好选用早春和秋天的材料作为外植体。取材时还应注意 外植体的基因型及部位，选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。
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防治褐化的途径
4.选择适宜的培养基和培养条件 合适的温度、pH 碳源
5.多次转移 在兰花、无花果、核桃的组织培养中效果尤为明显。
玻璃化
玻璃？透明？
在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长 异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透 时，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成 纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没 有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。
玻璃化、褐化现象的防治技术
PPT讲解：金平 PPT制作：林易容 文献资料查找：张丹桂、李卓娅 创新实验131班
一、褐化
二、玻璃化
什么是褐化？
褐变现象是由于建立外植体无菌系时， 切口附近的细胞受伤害，破坏了酚类 化合物和多酚氧化酶的分隔状态，使 得酚类化合物和多酚氧化酶相遇，酚 类化合物氧化形成醌类物质，并进一 步与蛋白质聚合，从而引起组织代谢 活动紊乱，导致组织生长停滞，最终 衰老死亡。
（6）增加自然光照，光照强度较弱时，可通过延长时间进行补偿。
（7）控制继代次数。
谢谢
控制和克服玻璃化苗的措施
（1）降低培养基中细胞分裂素和赤霉素浓度，添加低浓度多效唑、矮壮 素等生长抑制物质。 （2）控制适宜的培养温度，避免温度过高，变温培养时注意温差不宜过 大。 （3）使用透气性好封口材料，改善培养容器的痛风换气条件，降低容器 内湿度。 （4）适当增加培养基琼脂浓度，降低培养基的水势。 （5）减少培养基中含氮化合物的用量，选用低NH4+水平的B5培养基。
易褐化的培养环境
光照时间、光照强度
பைடு நூலகம்pH
温度
防治褐化的途径
1.选择适宜的外植体 幼龄外植体
外植体越小，切面与体积的比率越大，伤害及褐化的程度越大（Bonga）
2.对外植体进行预处理 预处理包括：流水冲洗、低温消毒、预培养。 3.添加褐变抑制剂和吸附剂 褐变抑制剂：抗氧化剂、PPO 的抑制剂等。 吸附剂：可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、活性炭等。
东南景天在组培过程中的玻璃化现象
玻璃化发生原因
玻璃化苗是在芽分化启动后的生长过程，碳、氮代谢和水分发生生 理性异常所引起。其实质是植物细胞分裂与体积增大的速度超过了 干物质生产和积累的速度，植物只好用水分来充涨体积，从而表现 玻璃化。不同作物种类或品种，玻璃化的发生频率各不相同，在情 人草中较少见，香石竹中则较普遍。
东南景天在组培过程中的褐化现象
影响褐化的因素：
1、外植体自身的原因 （1）植物种类及基因型 褐变程度由重到轻：粉菠萝、水塔花、红星凤梨、七彩凤梨。 （2）外植体部位、生理状态、取材时期、外植体的大小及受伤程度 幼龄树比老龄树褐化轻、褐化率低； 富士苹果和金华桃在9 月到2 月取材褐变轻，5 月到8 月取材 褐变重。 2、外植体所处的培养环境 无机盐浓度