黄嘌呤氧化酶法测定抗氧化能力

发酵过程产物形成的测定(SOD活性的测定)

一、实验目的

1、了解SOD活性测定的原理

2、学习黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性

二、实验原理

原理：黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性抑止作用，使可形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于空白管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中SOD 的活力。操作步骤：如表2-1。

三、实验试剂

硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶，醋酸等。

四、实验步骤

试剂测定管对照管75mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.8）0.55 0.55待测样品（ml）A(取样量) 0

0.1mol/L 盐酸羟胺溶液0.05 0.05

75mmol/L 黄嘌呤溶液0.05 0.05

0.037U/L 黄嘌呤氧化酶0.05 0.05

双蒸水0.2－A 0.2

用漩涡振荡器充分混匀，置37℃恒温水浴30min。

显色剂（ml） 1 1

总体积1.9ml，混匀，室温放置10min，蒸馏水调零，测A530

五、计算方法

计算公式：每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时对应的SOD 量为一个SOD 活力单位（U），待测样品中的SOD 活力由下式计算：

SOD抑制率（％）＝（A2-A1）/A2×100%

SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）/A2×100%÷50％×反应体系的稀释倍数×样本测试前的

稀释倍数

式中：A1:测定管的吸光值；A2:空白管的吸光值

六、注意事项：

1.试管要洗干净，在测定微量样品时尤为重要。

2.要做空白管，并且放在所有测试管的中间做，取平均值。

常用试剂

（1）诱导剂：分别配制IPTG 100μmol/mL； CuSO4·5H2O 250μm/mL； ZnSO4 100μm/mL。分别于0.22μm滤膜过滤除菌。

（2）稀释菌体所用0.02mol/L pH7.4 PBS缓冲液：8.5gNaCl，0.2gKCl，Na2HPO4·12H2O，3.628g，0.27gKH2PO4，定容至1000ml。

（3）SOD活性测定

①75mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.8）母液配制：A：0.15mol/L K2HPO4配置：准确称取

17.115g K2HPO4·3H2O溶于500mL 蒸馏水中。B：0.15mol/L KH2PO4配置：准确称取2.041g KH2PO4溶于100mL 蒸馏水中。取母液A 91.5mL与母液B8.5mL充分混合后，用水稀释至终体积200mL，用酸或碱调pH至7.8。

②0.1mol/L 盐酸羟胺溶液（要求新鲜配置）准确称取6.949g盐酸羟胺溶解于1ml 蒸馏水中。

③75mmol/L 黄嘌呤溶液（要求新鲜配置）准确称取11.41g 黄嘌呤溶于1mlNaOH 稀释液中。NaOH 备用液：称0.8gNaOH 溶于50ml 水中，使用时稀释3 倍为0.133mol/LNaOH 稀释液。

④0.037U/L 黄嘌呤氧化酶溶液（要求新鲜配置，避光）

⑤显色剂配制（避光保存）：

A: 量取冰醋酸172.5ml 于500ml 棕色瓶中，称取0.2g 甲萘胺加入冰醋酸中。

B：称取2g 对氨基苯磺酸溶于100ml 蒸馏水中(对氨基苯磺酸不易溶解，在棕色瓶里用超声波处理，水温60－70℃)。

C：待对氨基苯磺酸完全溶解后与冰醋酸混合，加蒸馏水至终体积500ml。