实验十 过氧化物酶活性测定

实验十、过氧化物酶活性测定

【实验目的】

掌握测定过氧化物酶活性常用的比色法及其原理

【实验原理】

过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H 2O 2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，此产物在470nm 处有最大光吸收，因此可通过测量OD 470，以每分钟OD 变化值表示酶活性大小。

【实验试剂】

20mmol/L KH 2PO 4

反应混合液：100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0) 50ml 于烧杯中，加入愈创木酚28μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μl ，混合均匀，保存于冰箱中。

【实验步骤】

l ． 粗酶液的制备：取马铃薯块茎洗净去皮，称取2g ，切碎置入研钵中，加20mmol/L KH 2PO 4 10ml 研成匀浆转入离心管中，4000r/min 离心10min ，取上清液转入试管保存于冷处，残渣再用10mL KH 2PO 4提取1次，合并上清液并记录总体积（提取酶液的总体积），低温下保存备用。

2．酶活性测定：取4只试管编号，1号管加入反应混合液3ml+ KH 2PO 4 1ml 作为参比；2号管、3号管、4号管均加入反应混合液6ml+提取的酶液2ml ，立即测定2、3、4号管OD 470值，然后将2号管放入4℃冰箱，3号管放于室温，4号管沸水浴，10min 后再分别读数。

3．结果计算：

以每分钟内OD 470变化0.0l 为1个过氧化物酶活性单位(U)，分别计算2、3、4号管过氧化物酶的活性。 过氧化物酶活性＝min)]/([01.0470⋅⨯⨯⨯⨯∆g u t s

V W T V D 式中， △D 470——反应时间内吸光度的变化；

W ——马铃薯鲜重（g ）；

t ——反应时间（min ）；

V T ——提取酶液总体积（mL ）；

V S ——测定时取用酶液体积（mL ）。

【注意事项】

酶液要低温保存。

【思考题】

酶活性的影响因素有哪些？分析温度对酶活性的影响？