细胞增殖实验(MTT assay)
细胞增殖实验(MTT assay)
MTT实验一．实验原理检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。
三．实验步骤1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清，正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。
2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。
（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。
）3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结晶的生成。
细胞增殖检测方法
细胞增殖检测方法
细胞增殖是细胞数量的增加和分裂的过程，对于检测细胞增殖的方法有很多种。
以下是一些常见的细胞增殖检测方法：
1. 细胞计数：通过显微镜观察和手工计数细胞数量，或使用自动化细胞计数仪进行细胞计数。
2. 细胞增殖染料：使用细胞增殖染料，如溴化乙锭（BrdU）或五溴乙酰胺（EdU），将其添加到培养基中，然后检测细胞摄取或转化这些染料的程度，以评估细胞增殖。
3. MTT试验：MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基-2H-四唑酮）试验通过测量细胞的代谢活力来评估细胞增殖。
MTT试剂会被活细胞还原为紫色的甲基噻唑咪唑离子，可以使用分光光度计测量产生的紫色产物的吸光度来确定细胞的增殖能力。
4. 细胞周期分析：通过流式细胞术检测细胞的DNA含量，可以确定细胞处于哪个细胞周期阶段，并评估细胞的增殖能力。
5. 细胞增殖标记：通过使用荧光标记物或融合蛋白来标记增殖细胞。
例如，使用荧光标记的抗体来检测细胞核内的增殖相关标记物，如Ki-67。
6. 实时细胞分析：使用实时细胞分析系统，如X-Celligence系统，可以通过记录电极传感器阻抗的变化来监测细胞的生长和扩张情况，从而评估细胞增殖。
这些方法可以单独或结合使用，以获得更全面和准确的细胞增殖信息。
细胞增殖实验(MTT法)的步骤及方法
细胞增殖实验（MTT法）的步骤及方法一、技术简介细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。
单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。
多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞；同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。
必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个子细胞中去。
可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。
真核细胞的分裂方式有三种，即有丝分裂、无丝分裂和减数分裂。
MTT是3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide的简称。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
然后采用二甲基亚砜（DMSO）溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值，反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
二、实验流程（以贴壁细胞为例）1. 收集对数期细胞，调整浓度。
2. 将细胞种植于96孔板中，待细胞贴壁后（约4-12 h）加药。
3. 5% CO2，37 o C孵育一定时间。
4. 每孔中加入200 μL MTT溶液（配制成5 mg/ml），培养4 h。
5. 吸去孔内的培养液，加入150 μL DMSO，可继续孵育4 h，使结晶物充分溶解。
6. 取出96孔板，将其置于酶联免疫检测仪上，震荡15 s，然后在570 nm下测量吸光值。
7. 结果统计分析。
mtt法检测细胞增殖
MTT法检测细胞增殖前言细胞增殖是生物体生长和发育的基本过程之一，也是许多疾病的病理基础。
因此，准确测定细胞增殖的能力对于生物医学研究具有重要意义。
MTT(Methylthiazolyl tetrazolium)法是目前常用的细胞增殖分析方法之一，能够可靠地简单测定细胞增殖的活性。
本文将介绍MTT法的原理和操作步骤，并对其优缺点进行分析。
MTT法原理MTT法是一种基于细胞代谢活动的间接检测方法。
其基本原理是利用细胞对MTT的还原作用，通过测定产生的紫色产物的吸光度来间接反映细胞增殖的活性。
MTT是一种黄色的可溶性化合物，能够通过细胞内氧化还原酶系统还原为紫色的结晶体—formazan。
被还原的formazan会在细胞内积累，并且随着细胞数量的增加而增加。
在MTT法中，细胞被处理后，MTT溶液被加入到培养基中，经过一段时间的孵育后，细胞会将MTT还原为formazan，形成紫色的晶体。
随后，使用溶解剂溶解晶体，使其可溶于溶液中，最后通过光谱仪测定溶液的吸光度。
在MTT法中，吸光度的值与细胞数量成正比，因此可以通过比较不同处理组细胞的吸光度值来评估细胞增殖能力的差异。
操作步骤以下是使用MTT法检测细胞增殖的基本操作步骤：1.准备细胞培养物：将需要进行细胞增殖检测的细胞培养在含有适当培养基的培养皿中。
确保培养皿的表面充分涂覆了细胞，并且培养皿中的细胞密度适中。
2.处理组织/药物/生物活性物质：根据实验设计的需求，将细胞培养在含有需要测试的药物或生物活性物质的培养基中。
如果是对不同处理组进行比较，需要设置对照组。
3.孵育细胞：将培养皿放入恒温培养箱或细胞培养箱中，以维持适当的温度、湿度和气体环境，使细胞进行增殖。
孵育时间根据实验需要而定，通常为24-72小时。
4.添加MTT溶液：取出培养皿，将预先配好的MTT 溶液均匀地加入到培养基中，确保与细胞充分接触。
MTT 溶液的浓度和加入量可以根据实验要求进行调整。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告肿瘤细胞增殖实验是当前癌症研究中的重要内容之一。
通过体外检测肿瘤细胞的增殖情况，可以评估肿瘤的生长速度、细胞增殖能力以及对药物治疗的敏感性等，为研究肿瘤的发生机制和药物疗效提供重要依据。
本综述报告将对目前常见的体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法进行总结和评述。
一、MTT试验MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）试验是一种常用的体外细胞增殖检测方法。
MTT试验基于细胞对某种化合物还原能力的检测，该化合物在活细胞中通过线粒体膜将其还原为具有蓝色沉淀的可溶性紫色盐类。
通过溶解形成的盐类，可以由酒精等溶剂溶解并用分光光度计测定其吸光度，从而反映细胞的活力和增殖情况。
二、CCK-8试验CCK-8试验是一种测量细胞代谢活性的方法。
CCK-8试剂在细胞内通过线粒体酶的作用可被还原为橙黄色溶液，其吸光度与细胞数量成正比。
在CCK-8试验中，将该试剂加入细胞培养液中，经过一定时间后，通过酶促反应的作用反映细胞代谢活性和增殖程度。
三、细胞计数法细胞计数法是一种直接检测细胞数量的方法。
在该实验中，通过显微镜观察和人工计数的方式，统计细胞的数量，从而得出增殖情况。
该方法简单直观，但在大规模实验中耗时且易发生误差。
四、Clonogenic Assay试验Clonogenic Assay试验是一种经典的体外细胞增殖检测方法。
该方法通过将单个细胞在富含营养的培养基中培养，并观察和计数其形成的克隆，从而评价细胞的增殖能力。
Clonogenic Assay试验对于评估细胞的增殖潜能和肿瘤干细胞的存在及活性具有重要意义。
五、APTT试验APTT（activated partial thromboplastin time）试验是一种常用的血液凝血功能检测方法，在某些肿瘤细胞增殖实验中也被应用。
肿瘤细胞的增殖状态与凝血功能存在一定关系，通过APTT试验可以间接反映肿瘤细胞的增殖情况。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告肿瘤是一类以异常细胞增殖为主要特征的疾病。
准确评估肿瘤细胞增殖对于肿瘤治疗的效果以及疾病的预后具有重要意义。
体外检测肿瘤细胞增殖是一种常用的方法，本文主要对体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法和研究进展进行综述。
一、MTT法MTT法是一种常用的体外检测肿瘤细胞增殖的方法。
该方法是根据细胞线粒体活性的改变来评估细胞增殖的程度。
实验流程主要包括：将细胞悬浮液均匀涂布在培养皿中，待细胞贴附后加入MTT试剂，培养一段时间后将形成的晶体溶解并用酶标仪读取吸光度值。
吸光度值越高，细胞增殖越旺盛。
该方法简单、灵敏度较高，被广泛应用于肿瘤细胞增殖实验中。
二、Clonogenic assayClonogenic assay是一种评估肿瘤细胞增殖潜能的经典方法。
该方法通过培养肿瘤细胞单个细胞或一小群细胞，观察并统计形成的克隆数目来评估细胞增殖的能力。
实验流程主要包括：将肿瘤细胞以适当密度接种在培养皿中，培养一段时间后用甲醛固定，染色后用显微镜观察并计数克隆数量。
克隆数量越多，细胞增殖能力越强。
该方法简便、直观，是评估肿瘤细胞增殖的重要手段之一。
三、Cell proliferation assayCell proliferation assay是一类常用的体外检测肿瘤细胞增殖的方法。
这些方法主要通过检测细胞增殖相关指标来评估细胞增殖的程度，包括细胞数量、细胞代谢活性、DNA合成等。
常用的方法有细胞计数法、脱氧核糖核酸(DNA)含量测定法、流式细胞术等。
这些方法具有高通量、高灵敏度等特点，被广泛应用于肿瘤细胞增殖实验中。
四、组织培养方法组织培养方法是一种用于体外检测肿瘤细胞增殖的重要手段。
该方法直接使用体外培养的肿瘤组织，观察并统计肿瘤细胞的增殖情况。
常见的组织培养方法包括原代细胞培养、血管瘤体外培养等。
这些方法可以更真实地反映肿瘤细胞的增殖状态，但操作复杂、时间长，限制了其在实验中的应用。
体外检测肿瘤细胞增殖是评估肿瘤治疗效果和预后的重要手段之一。
MTT细胞增殖检测方法
MTT细胞增殖检测方法MTT（3-[4,5-二甲基-2-噻唑硫基]-2,5-二苯基-2H-四唑）细胞增殖检测法是一种常用于评估细胞增殖能力的方法，被广泛应用于细胞生物学和药物筛选研究。
该方法基于细胞内的还原能力来检测细胞数量的变化，通过转化MTT为可溶性甲基蓝并测量其吸光度来反映细胞增殖的程度。
以下是对MTT细胞增殖检测方法的详细介绍。
MTT法的原理:MTT法的原理基于细胞内还原能力的变化。
MTT为一种黄色噻唑化合物，可以通过代谢作用被细胞内的还原型NADH和NADPH还原为紫色的可溶性产物，甲基蓝（formazan）。
甲基蓝比MTT更加容易溶解于溶剂中，可以通过吸光度测量来定量分析细胞的增殖情况。
MTT的实验步骤:1.接种细胞:从培养物中取出细胞，进行细胞计数，将细胞以适当浓度接种进所需的培养基中，培养到适当的阶段。
2.处理细胞:根据实验设计的需要，给予细胞不同的处理，如给予药物、生长因子或是改变其它培养条件。
3.制备MTT反应液: 将MTT溶解在适当的培养基中，使其浓度为5mg/mL。
过滤消毒。
4.处理细胞:从培养基中将培养物移至适当的96孔板中，每孔加入200μL的培养基和细胞，使其稀释到适当的浓度。
5.加入MTT反应液: 将MTT溶液加入到每孔中，使其最终浓度为0.5mg/mL。
6.孵育细胞:放回培养箱中孵育一段时间，一般为2-4小时，以保证足够的反应时间。
7.溶解产物:小心将培养基和反应产物去除，加入为其提供溶解产物的溶剂，如酒精或DMSO。
8.测定吸光度: 将溶液转移至96孔板中，使用光谱仪或酶标仪测量甲基蓝的吸光度，波长通常为570nm。
MTT法的优点:1.高灵敏度：MTT法对细胞的增殖状态非常敏感，可以准确地测量细胞数量的变化。
2.快速：MTT法的操作相对简单，可以快速获得结果。
3.廉价：MTT试剂相对便宜，可以在大规模实验中使用。
MTT法的局限性:1.只适用于已附着生长的细胞：MTT法只适用于附着生长的细胞，无法应用于悬浮细胞。
MTT assay
MTT assay [预习用]用途：1.MTT assay is laboratory test and standard colorimetric assay.2.for measuring the activity of enzymes that reduce MTT to formazan(甲臜).3.can also be used to determine cytotoxicity of potential medicinal agents.原理：1.Yellow MTT（黄色染料）is reduced to Purple formazan in living cells.(活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
)2.甲瓒不溶于水，但能溶于一些增容溶剂(solubilization solution)，如DMSO。
3.DMSO is added to dissolve the formazan into a colored solution4.the absorbance of the colored solution can be quantified.5.the wavelength of the absorbance is usually between 500 and 600 nm. (570nm/490nm in酶标仪)6.通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。
MTT溶液配制方法：1.通常MTT的浓度为5mg/ml。
可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的PBS(or无酚红的培养基)中2.用0.22μm滤膜过滤以除菌3.4℃避光保存即可。
NOTE：1.在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
往96孔板加时可以不避光，也可以把操作台上的照明灯关掉。
2.MTT最好现用现配.过滤后4℃避光保存两周内有效;或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存3.避免反复冻融，最好小剂量分装4.当MTT变为灰绿色时绝对不能再用5.MTT有致癌性6.MTT对细菌敏感PBS配方：Nacl 8g/Kcl 0.2g/Na2HPO4 1.44g/KH2PO4 0.24g调pH 7.4、定容1L（可定容后测pH约7即可）实验方法：（用于贴壁细胞）1.对数期细胞，调整细胞浓度，（每孔加入100ul,使待测细胞调密度至1000-10000孔），边缘孔用无菌PBS填充。
细胞存活率分析(MTT Assay)
細胞存活率分析(MTT Assay)培養24小時培養24小時 培養4小時培養24小時 Time用570nm 的ELISA 讀OD 加入細胞至96well 中 吸去100μl 液體，加入MTT吸去100μl GM，加入100μl 新GM 及藥物 吸去全部液體，加入100μl DMSO實驗步驟：1. 將細胞消化後，以Growth Medium(10%FBS)稀釋到適當體積，再均勻接種到96 well plates 中，每well 接種200μl。
接種完畢後，在盤面最外圍的well(X well)處加入100μl 的無菌二次水(DDW)。
Note：A375細胞→75T flask 可接種4盤 96well plates2. 將細胞移入37℃培養箱，培養16~24小時。
3. 將Medium 換成0.1%FBS 的Medium 100μl 靜置24hr4. 加藥：一次處理同一稀釋濃度的3個well，先以tip 吸去100μl 在well中的GM，再加入100μl 新的DMEM(不含FBS)，之後再加入藥物至well 中。
5. 將細胞移入37℃培養箱，培養24小時。
6. 移除well 中100μl 液體，並加入1/10 volume(10μl)的MTT(5mg/ml)到每個well 中。
Note：MTT 在GM 中的最終濃度為0.5mg/ml。
7. 將細胞移入37℃培養箱，作用4小時。
8. 吸除well 中的GM 與藥物的混合液體，並加入100μl SDS-HCl 到每well中。
9. 將細胞移入37℃培養箱，培養24小時。
10. 用570 nm filter 的ELISA reader 來測定OD 值。
計算：OD TC0 ─OD TC100 =TC 50之OD, 再以內插法求得drug 的TC 502盤面設計： X X X X X X X X X XX X XX XX XX XX XX X X X X X X X X X X X XX X z X 的部分，加入200μl 無菌DDW z 灰色的部分為藥物處理組藥物：z MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]為可溶於水的黃色染劑，會被細胞中NADPH 還原為不溶於水的深藍色結晶(MTT-formazan)，此結晶必須先用DMSO 溶解後，才能用ELISA reader 讀取吸光值，若細胞活性越強，藍色越深，若細胞死亡，則呈現黃色。
细胞增殖实验实验报告单
一、实验目的1. 掌握细胞增殖实验的基本原理和方法。
2. 学习使用MTT法和克隆形成实验法检测细胞增殖。
3. 了解细胞增殖在不同条件下的变化。
二、实验原理细胞增殖是生物体生长发育的基础，也是细胞生物学研究的重要内容。
细胞增殖实验主要包括MTT法和克隆形成实验法。
MTT法通过检测细胞线粒体中的脱氢酶活性，间接反映细胞增殖活力；克隆形成实验法则通过观察单个细胞分裂形成的克隆数量，评估细胞的增殖能力。
三、实验材料1. 细胞：HeLa细胞（人子宫颈癌上皮细胞）2. 试剂：MTT工作液、DMSO、胎牛血清、RPMI1640/DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液、96孔培养板、酶联免疫检测仪、CO2培养箱、低速离心机3. 仪器：显微镜、细胞计数器、电子天平、移液器、超净工作台四、实验方法1. 细胞培养：将HeLa细胞接种于96孔培养板，每孔1000个细胞，加入200μl RPMI1640/DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
2. MTT法：（1）培养细胞2-3天后，每孔加入20μl MTT工作液，继续培养4小时。
（2）小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
（3）在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
3. 克隆形成实验法：（1）将细胞接种于6孔板，每孔2000个细胞，加入200μl RPMI1640/DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
（2）培养细胞至一定时间后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化细胞，制成细胞悬液。
（3）将细胞悬液稀释至适当浓度，接种于6孔板，每孔100μl。
（4）培养细胞至克隆形成，用显微镜观察并计数。
（5）计算克隆形成率。
五、实验结果1. MTT法：细胞生长曲线呈S形，细胞增殖活力随时间延长而增加。
2. 克隆形成实验法：克隆形成率随时间延长而增加，表明细胞增殖能力较强。
Mtt说明说和使用方法
产品简介：1. MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(MTT Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的实验方法。
由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此常常用来检测细胞的增殖情况。
MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。
在特定溶剂存在的情况下，可以被完全溶解。
然后通过酶标仪可以测定570nm波长附近的吸光度。
细胞增殖越多越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则吸光度越低。
2. 本试剂盒采用了独特的Formazan溶解液配方，无需去除原有的培养液，可以直接加入Formazan溶解液溶解formazan。
从而避免了由于去除培养液时formazan被部分去除而引起的误差。
3. 本试剂盒背景低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便提高了可靠性。
4. 本产品为500 次（5个96孔细胞培养板）操作。
产品内容：MTT染色液5ml Formazan溶解液55ml 说明书1份保存条件：MTT染色液需-20℃避光保存；Formazan溶解液可以室温保存。
注意事项：1. 由于使用96孔板进行检测，如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要吝啬96-孔板的四周边孔，这32 个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。
因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了2. MTT溶剂在低温情况下会凝固，使用前请室温放置或20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
3. MTT一般最好4ºC避光保存两周内有效，保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
4. Formazan溶解液结冻或产生沉淀时可以37℃水浴孵育以促进溶解，并且必须在全部溶解并混匀后使用。
5. 孵育时，须避光6. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感。
MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书
Hotline ：400-6111-883 E -上HB210525本产品仅作科研用途！MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒Cat NO.40206产品说明书网址： 第1页，共2页MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒产品信息MTT Cell Proliferation Assay Kit MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒40206ES76 500 T 40206ES80 1000 T 40206ES905000 T产品描述噻唑兰（Methylthiazolyldiphenyl -tetrazolium bromide , MTT ），也称作溴化噻唑蓝四氮唑，是一种黄色染料，已经普遍替代传统的台盼蓝染色法或者放射性同位素插入法，用来检测细胞的活力，细胞增殖以及细胞毒性分析。
检测原理在于：MTT 是一种可接受氢离子的化合物染料，带正电荷，具有细胞膜渗透性。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT 还原成为水不溶性的深蓝色MTT -甲臜结晶，而死细胞不具有此功能。
甲臜结晶是不能穿透细胞膜，因此沉积在处于增殖且未受损伤的细胞内。
甲臜结晶可用DMSO 或者酸化的异丙醇溶解出来，酶标仪下测定570 nm 的吸光度反映甲臜的生成量。
而甲臜的生成量与活细胞数目成正比，用以评估细胞存活状况。
本试剂盒以MTT （高纯度）作为指示剂，在经典操作步骤的基础上，采用独特的甲臜溶解液配方，可以直接溶解甲臜沉淀，无需去除原有的培养液。
从而避免因去除培养液时甲臜被部分去除而引起的操作误差。
具有本底低，灵敏度高，线性范围宽，操作简单等特点。
另外，本试剂盒还提供配套的一次性针头过滤器和注射器，为实验带来更多的便利。
产品组分编号 组分 产品编号/规格40206ES76（500T ） 40206ES80（1000T ） 40206ES90（5000T ） 40206-A MTT 粉末 25 mg 50 mg 250 mg 40206-B MTT 溶剂 5 mL 10 mL 50 mL 40206-C 甲臜溶解液 50 mL 100 mL 100 mL×5 40206-D除菌套装1包1包1包运输和保存方法冰袋运输。
mtt细胞实验步骤
mtt细胞实验步骤
MTT细胞实验是一种常用的细胞生存率和细胞增殖能力测定方法，以下是MTT细胞实验的基本步骤：
1. 显微镜下观察细胞形态与结合情况：将需要进行实验的细胞取出，通过显微镜观察细胞形态与结合情况以确保细胞质量正常。
2. 细胞的处理：将细胞以适当的密度悬浮在含有培养基的培养皿中，并放入恒温培养箱中培养一段时间，使细胞黏附于培养皿底。
3. 处理试剂：根据实验设计的需要，如调节药物浓度、添加化合物等，处理培养皿中的细胞。
4. MTT溶液的制备：取适量的MTT混合粉末，加入生理盐水或者PBS缓冲液中，溶解后过滤灭菌。
5. MTT染色：将处理后的细胞培养皿加入预先准备好的MTT 溶液中，使其充分与细胞接触，然后将培养皿放回恒温培养箱中孵育适当的时间。
6. 细胞摄取MTT：将MTT孵育后的培养皿从恒温培养箱中取出，轻轻吸去残留的MTT溶液，并加入适量的溶解剂（如二甲基亚砜）使细胞摄入的MTT完全溶解。
7. 光度计测定：将溶解后的MTT液吸取到96孔板中，通过
光度计测定吸光度值，即MTT代谢产物形成的紫色产物的吸光度。
8. 数据分析：根据光度计测定的数据，计算细胞生存率或增殖能力并进行统计分析。
注意事项：
- 实验过程中需要严格执行无菌操作，以确保实验结果的准确性。
- 实验前需准备好试剂和培养皿等相关材料，保证实验顺利进行。
- 实验设计时应考虑到对照组设置、重复次数等因素，以增加实验的可靠性。
MTT法测细胞增殖
MTT法细胞增殖2015.05.13 热娜1.方法步骤（from 吴荃论文）a. 接种细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。
b. 培养细胞：同一般培养条件，培养3-4天（可根据实验目的和要求确定培养时间）。
c. 呈色：培养3-4天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml，用PBS；ph=7.4；配）20ul，继续孵育4小时，种植培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO，震荡10min，使结晶物充分融解。
d. 比色：选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
2.MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide ，是一种接受氢离子黄颜色的染料。
MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide ，MTT噻唑蓝为基础。
活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan）, 甲臜的多少可以用酶标仪测定570nm处的光密度OD值推测出活细胞的数目。
由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT不会有反应。
3.MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5g，溶于100ml 的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22um 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4度避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
（实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，就得这样比较好。
）需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能检测细胞绝对数。
细胞增殖试验方法
细胞增殖试验方法细胞增殖试验就像是窥探细胞世界里的“人口增长”秘密呢。
一、直接计数法。
这是最直白的一种啦。
就像数星星一样，不过是在显微镜下数细胞。
把细胞放在特制的计数板上，然后瞪大眼睛，一个一个数。
这个方法简单直接，但是也有点费眼睛哦。
而且呢，它只能反映某个特定时间点的细胞数量。
要是细胞们正处于活跃的增殖状态，可能刚数完，下一秒就又变多啦。
二、MTT法。
MTT法就像是给细胞们做一个小测验。
MTT这种物质可以被活细胞里面的一些酶变成有颜色的东西。
把细胞放在有MTT的培养液里，活细胞就会让MTT发生变化，然后我们通过测量颜色的深浅来判断细胞增殖的情况。
颜色越深，就说明活细胞越多，也就意味着细胞增殖得越好。
不过呢，这个方法也有小缺点，MTT本身有点毒性，可能会对细胞有点小影响，就像给细胞一点小压力啦。
三、CCK - 8法。
这个方法和MTT法有点像亲戚呢。
CCK - 8也是一种可以被细胞里面的东西改变颜色的试剂。
它比MTT法更友好一点，毒性更小。
细胞在增殖的时候，会让CCK - 8变色，然后我们用仪器测量颜色变化对应的数值，就知道细胞增殖得怎么样啦。
操作起来也不是很难，就像做一个简单的小实验，看着颜色一点点变化，就像看着细胞在悄悄长大呢。
四、BrdU掺入法。
这个方法就有点像给细胞做个小标记。
BrdU是一种可以像细胞自己的原料一样被细胞吸收的东西。
正在增殖的细胞会把BrdU掺入到新合成的DNA里面。
然后我们可以用特殊的方法检测到BrdU的存在，这样就知道哪些细胞在增殖啦。
就像是给增殖的细胞发了一个独特的小徽章，然后我们把戴徽章的细胞找出来数一数。
细胞增殖检测-MTT
细胞增殖检测—MTT（一）MTT检测1、试剂及仪器磷酸盐缓冲液，胎牛血清，EDTA-胰酶，DMEM培养基，RPMI1640培养基，DMEM/F-12，α-MEM培养基，青霉素-链霉素（双抗），15ml离心管，1000ml移液枪，200ul移液，10ul 移液枪，200ul排枪，MTT，酶标仪，倒置显微镜，低速离心机，T25瓶，96孔板，计数仪，计数板等。
2、原理MTT是一种接受H+染料，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在特定波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
3、实验步骤：（1）接种细胞：用10%FBS的培养基配成单细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔200ul。
（2）培养细胞（悬浮细胞可直接加MTT，贴壁细胞等贴壁可加）（3）MTT配置：a.称取MTT 粉末，MTT 一般以粉末形式保存，需精密称取适量的MTT 粉末。
b.溶解MTT：将称取的MTT 粉末溶解于PBS（磷酸盐缓冲液）或无血清培养基中，搅拌使其充分溶解。
通常MTT 的终浓度为5mg/ml。
c.过滤除菌：使用0.22μm 的微孔滤膜过滤溶液，以去除可能存在的细菌和杂质。
d.分装保存：将过滤后的MTT 溶液分装至无菌的小瓶或离心管中，避光保存在-20℃冰箱中。
（4）呈色：每孔加（5mg/ml，用PBS配置）20ul，孵育4h，小心吸弃上清，每孔加150ulDMSO，摇床上振荡10min。
（5）比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，以时间为X轴，吸光值为Y轴绘制细胞生长曲线。
MTT法( MTT Assay)检测细胞活力与细胞密度的关系
MTT法（MTT Assay）检测细胞活力与细胞密度的关系一、实验目的学习用MTT的方法检测细胞活力的原理。
二、实验原理活细胞的线粒体脱氢酶可以还原黄色的MTT溶液为紫色甲臜（formazan）颗粒，沉积在细胞中；用DMSO等试剂溶解甲臜后的溶液在一定波长下比色测定的吸光值与活细胞数量及代谢活性成正比。
三、实验试剂及仪器a)材料：小鼠腹水瘤小鼠b)试剂：i.D-Hanks液。
ii.0.4％台盼蓝生理盐水染液。
iii.含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液。
iv.5mg/ml 的MTT：用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液配制，溶解后（0.22 μm滤膜）过滤消毒，4℃避光保存。
v.盐酸-异丙醇裂解液：量取盐酸14mL、Triton X-100溶液50mL，加异丙醇至500mL。
c)用品：酶标仪、CO2培养箱、10mL低速离心机、血球计数板、96孔培养板、小剪刀、镊子、10mL带盖刻度离心管、100μL枪及枪头等四、实验步骤（常规操作流程：计数细胞调浓度→将细胞悬液加样于96孔细胞培养板→（加药刺激）→加MTT反应（4h）→溶解甲臜→测定溶液吸光值。
权宜操作流程：MTT与细胞作用→计数细胞调浓度→将细胞悬液加样于96孔细胞培养板→溶解甲臜→测定溶液吸光值。
）a)加MTT，37℃温育（上课前2h，助教完成）b)计数细胞调浓度（血球计数板、含0.5mg/mL MTT的培养液）。
106个/mL系列8×、4×、2×、1×、0.5×105 个/mL系列8×、4×、2×、1×、0.5×104个/mL系列8×、4×、2×、1×、0.5×c)加样：空白对照（培养液+MTT+裂解液）和实验，每孔100μL ，2个重复孔。
d)加裂解液：MTT作用4h后，加裂解液，混匀。
mtt法检测细胞增殖
MTT法检测细胞增殖引言细胞增殖是生物学研究中的重要过程，对于理解细胞生长、组织再生、疾病发展等方面具有重要意义。
因此，准确、快速、可靠地检测细胞增殖的方法至关重要。
其中，MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法被广泛应用于细胞增殖的研究。
MTT法原理MTT法基于细胞代谢的活性形成的彩色产物的检测。
MTT是一种黄色草酰胺化合物，在细胞内受到还原酶酶水解后转化为具有紫色的产物。
细胞的代谢活性越高，产生的紫色产物也就越多。
因此，通过检测紫色产物的形成情况可以间接估计细胞的增殖活性。
MTT法步骤1.培养细胞在实验开始之前，首先需要培养细胞到适当的生长状态。
根据具体实验要求，选择适当的培养基和培养条件。
2.接种细胞将培养好的细胞接种到96孔板或其他合适的细胞培养器皿中。
为了得到准确的结果，每个孔或容器应有足够数量的细胞。
3.处理样品根据实验的需要，处理待测样品。
可以是对照组、实验组或不同浓度/处理时间的样品。
4.加入MTT试剂将MTT试剂溶液加入孔中或培养器皿中。
MTT试剂的浓度和用量应根据实验要求进行优化。
5.生化反应将细胞和MTT试剂一起在恒温振荡器中培养一段时间，以促进MTT的还原反应。
6.溶解产物将产生的紫色产物溶解。
可以使用有机溶剂，如二甲基亚硫酸钠溶液。
7.测量吸光度用酶标仪或分光光度计测量溶液的吸光度。
对照组和实验组应分别测量，并根据测量结果进行数据处理和分析。
MTT法优缺点优点•相对简单易行，不需要复杂的设备和技术。
•操作方便，批量处理大量样品。
•结果可靠，可以定量分析细胞增殖活性。
缺点•MTT法只能反映细胞的代谢活性，不能直接反应细胞数量的变化。
•在某些情况下，MTT法对于检测细胞增殖存在一定的局限性。
结论MTT法是一种常用的测定细胞增殖活性的方法。
它通过测量细胞代谢活性所产生的彩色产物来推断细胞增殖的程度。
mtt细胞毒性的原理
mtt细胞毒性的原理
MTT细胞毒性实验（MTT assay）是一种常用的评估细胞毒性
的方法。
其原理基于细胞还原MTT（3-(4,5-二甲基硬氮基)-2-
5-二苯基五唑溴化物）至紫色的甲醛溴分解物的能力。
在MTT细胞毒性实验中，细胞首先被培养在含有待测物的培
养基中。
待测物可以是化合物、药物、细菌等。
细胞培养一定时间后，将MTT溶液加入培养基中。
MTT溶液会被细胞摄取
进入细胞内。
在细胞内，MTT被还原成紫色的甲醛溴分解物，由于该物质与细胞的代谢能力有关，可以用来评估细胞的存活情况。
为了分析细胞毒性，甲醛溴分解物需要从细胞中释放出来。
为此，一般会加入溶解MTT的溶剂，如二甲基亚砜。
这样，细
胞溶解后，甲醛溴分解物会被溶剂溶解，形成溶液中的紫色产物。
紫色产物的光密度与细胞的存活数量成正比。
接下来，使用酶标仪或分光光度计来测量溶液的吸光度。
常用波长为570 nm，或根据细胞系和实验条件选择适当的波长。
吸光度值越高，表示细胞的存活越多；而吸光度值越低，表示细胞的存活越少。
通过对待测物不同浓度的MTT细胞毒性实验的细胞存活率数
据进行线性回归分析，可以评估待测物的毒性效应。
通常使用IC50值（有效半数抑制浓度）来描述化合物对细胞的毒性。
IC50值越小，说明待测物对细胞的毒性越大。
总结起来，MTT细胞毒性实验通过测量细胞内MTT还原产物的吸光度来评估待测物对细胞的毒性效应。
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MTT实验
一．实验原理
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制
将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。
三．实验步骤
1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清，
正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。
2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性
测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。
（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。
）
3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基
稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含
0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结
晶的生成。
4.结晶的溶解及吸光值测定：结晶生成后，轻轻吸出原培养基，加150μLDMSO溶解，
室温轻轻震荡5min，以保证结晶完全溶解；迅速取出96孔板，在酶联免疫检测仪，选择波长490nm测定每孔的吸光值。
5.根据实验设置的需要，每隔一定时间重复测定细胞的活性，收集数据；同时进行重复
实验，以保证结果的准确性。