细胞增殖实验(MTT assay)

MTT实验

一．实验原理

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制

将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。

三．实验步骤

1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清，

正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。

2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性

测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。）

3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基

稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含

0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结

晶的生成。

4.结晶的溶解及吸光值测定：结晶生成后，轻轻吸出原培养基，加150μLDMSO溶解，

室温轻轻震荡5min，以保证结晶完全溶解；迅速取出96孔板，在酶联免疫检测仪，选择波长490nm测定每孔的吸光值。

5.根据实验设置的需要，每隔一定时间重复测定细胞的活性，收集数据；同时进行重复

实验，以保证结果的准确性。