丹参茎叶总酚酸组分对糖尿病多脏器损害的保护作用及机制研究

丹参茎叶总酚酸组分对糖尿病多脏器损害的保护作用及机制研究随着中药及天然药物资源经济产业快速发展,中药资源性成本大量消耗,植物根系、地上茎叶等“非药用部位”,以及在药材产地加工过程中产生的“下脚料”及破碎组织被大量废弃。

不仅成为中药行业发展的棘手问题,同时也给生态环境带来了巨大压力,限制了资源经济产业链发展。

中药丹参为唇形科鼠尾草属多年生草本植物丹参(Salviamiltiorrhiza Bge.)的干燥根及根状茎,为传统大宗药材,应用极广,但在丹参传统药用部位采收过程中,大量丹参茎叶被丢弃,造成严重的资源浪费和环境压力。

丹参茎叶含有酚酸类、黄酮及其苷类、三萜类、多糖及其苷类、甾体类、香豆素类、氨基酸类、蛋白质及挥发性成分等多种成分,其中丹酚酸类成分的含量是根部的1倍左右,总黄酮含量是根部的4倍余。

因此,充分利用丹参茎叶丰富的资源性成分是丹参茎叶资源价值开发的有效途径。

本课题在前期研究基础上,以丹参茎叶中总酚酸组分为研究对象,研究其对糖尿病多脏器损害的保护作用,并对其可能存在的生物学机制进行探讨,为实现丹参茎叶资源的开发利用、提升资源利用效率和效益提供科学依据,本课题的研究工作对实现丹参茎叶资源的产业化、延伸丹参资源产业链具有重要意义。

本论文分为四章开展相关研究工作:一、文献研究本章较为系统地对丹参非传统药用部位地上茎叶、花序中的资源性化学成分以及资源价值发现现有研究进展进行总结,同时,依据课题组创建的“三大利用策略”和“三类资源化模式”体系对丹参茎叶进行多途径、多层次资源价值发现与资源化利用模式探讨,为实现丹参茎叶资源的开发利用以及提升丹参资源利用率提供依据。

本章研究为论文的设计和系统研究提供基础。

二、实验研究(一)丹参茎叶总酚酸保护糖尿病多脏器损害的资源价值评价1.丹参茎叶各化学部位样品制备以工业化生产为背景,选用工业乙醇作为提取溶剂,综合考虑丹参茎叶酚酸类、黄酮类和三萜类这三类资源性成分的含量来考察丹参茎叶的最佳提取工艺。

并以柱层析和萃取技术联用对丹参茎叶各类资源性成分进行纯化,以制备高纯度的组分。

最终确定的样品制备工艺为:以60%乙醇对丹参茎叶进行回流提取,料液比1:10,提取1.5 h,提取2次,合并两次提取液,浓缩至干获得丹参茎叶醇提物(DJ);通过大孔树脂AB-8对丹参茎叶资源性成分进行纯化,20%乙醇溶液及1.5柱体积的30%乙醇溶液洗脱得到酚酸部位,40%乙醇洗脱得到黄酮部位,其中所得到的粗酚酸部位总酚酸含量为45.86%,纯度较低,结合萃取技术对所得到的粗酚酸部位中丹酚酸类成分进一步富集,制备得到纯度较高的总酚酸组分,其酚酸含量达到87.21%,黄酮含量为1.19%。

2.丹参茎叶总酚酸对糖尿病多脏器损伤的保护作用研究以双氧水(H202)和高糖诱导多种细胞损伤,建立细胞氧化应激及高糖损伤模型,同时结合Ⅱ型(T2DM)糖尿病小鼠模型,对丹参茎叶总酚酸保护糖尿病多脏器损伤的资源价值进行体内外评价,以期筛选出丹参茎叶总酚酸保护作用效果明显的损伤脏器,为丹参茎叶总酚酸组分资源价值开发提供基础。

(1)心血管MTT结果结果表明,丹参茎叶总酚酸组分对双氧水和高糖损伤的HUVEC细胞和H9C2细胞的保护作用弱于丹参根总酚酸组分。

小鼠造模后,血糖及糖化蛋白水平明显增加,体重明显降低,给药后,小鼠血糖值相比于模型组有下降趋势,体重上升,尤以丹参茎叶总酚酸组分降低血糖的作用最为明显。

此外,T2DM小鼠血清中甘油三酯TG、总胆固醇T-CHO、低密度脂蛋白LDL-C显著升高,高密度脂蛋白HDL-C显著降低,表明糖尿病小鼠血脂异常;血清中超氧化物歧化酶SOD活力显著降低,乳酸脱氢酶LDH活力和肌酸激酶CK活力显著增加,总酚酸组分能显著改善氧化应激指标,缓解T2DM小鼠血清氧化损伤,同时能显著降低T2DM小鼠动脉粥样硬化性血脂异常,丹参茎叶总酚酸组分对T2DM小鼠的氧化损伤、高血糖、高血脂症的缓解作用优于丹参根总酚酸组分,表明丹参茎叶总酚酸组分可以预防T2DM小鼠的血管内皮损伤。

T2DM小鼠血小板舒缩及血小板功能失衡,微循环障碍,内皮功能紊乱,丹参茎叶总酚酸组分高剂量显著降低TXB2与6-keto-PGF1α比值,且丹参茎叶总酚酸组分缓解糖尿病小鼠的内皮功能紊乱作用优于丹参根总酚酸组分。

心脏组织病理切片表明高脂饲料联合STZ造模后,T2DM小鼠心肌组织出现轻微纤维化,同时伴随着大量脂质蓄积,小鼠左心心功能降低。

丹参茎叶醇提物及总酚酸组分给药后可预防糖尿病诱导的心肌重塑、心腔扩大以及收缩功能下降等症状,丹参茎叶总酚酸组分对糖尿病心脏损害小鼠心功能和心肌组织损伤的改善作用弱于丹参根总酚酸组分。

综合以上实验结果表明,丹参茎叶总酚酸组分对糖尿病心脏损害的保护作用弱于丹参根总酚酸组分,但是其对于糖尿病血管内皮损伤及内皮功能紊乱的调节作用优于丹参根总酚酸组分。

(2)消化器官丹参茎叶总酚酸对双氧水和高糖损伤的肠上皮细胞IEC-6和肠平滑肌细胞HISMC的保护作用非常明显,即使低剂量也有很好的保护率。

高糖及STZ造模后,小鼠肠壁出现轻度病变,胃肠激素紊乱,小鼠血清中胃动素MTL和胃泌素Gas浓度显著升高,血管活性肠肽VIP、胰高血糖素样肽1GLP-1和P物质SP浓度显著降低,丹参茎叶醇提物及总酚酸组分对各胃肠激素浓度均有改善作用,且丹参茎叶酚酸组分对胃肠激素浓度的调节作用较丹参根的总酚酸组分明显。

糖尿病造模后,小鼠肝脏指数、血清中谷丙转氨酶及谷草转氨酶活力显著升高,表明小鼠肝脏功能受损。

与模型组小鼠相比,丹参茎叶总酚酸组分高低剂量和丹参根总酚酸高剂量显著改善T2DM小鼠肝功能。

造模后小鼠胃部组织粘膜上皮细胞轻度变性,给药后小鼠的胃组织并未有明显改变。

(3)其他体外细胞实验表明,丹参茎叶总酚酸组分对双氧水及高糖损伤的肾脏细胞HBZY-1和HK-2保护作用优于丹参根总酚酸组分;但对H202损伤的PC12细胞和高糖损伤的HSC细胞的保护作用低于丹参根总酚酸组分。

动物实验结果表明,与正常组相比,模型组小鼠萎靡,体型明显消瘦,尿量明显增多,各给药组小鼠以上生理状态有不同程度的改善。

模型组小鼠肾组织皮质,髓质结构清晰,肾小球略增大,肾小球性基质增生,系膜区扩大;肾小管上皮细胞中度变性水肿,表现为细胞体积增大,胞浆疏松、淡染,腔缘不清,无空泡;肾间质部分炎细胞浸润。

各给药组可见少量炎细胞浸润,丹参茎叶醇提物高剂量组及总酚酸给药组小鼠肾脏结构接近正常组。

丹参茎叶总酚酸组分能降低糖尿病肾脏指数、小鼠尿量和尿蛋白,且效果优于根茎总酚酸。

STZ结合高脂饮食显著降低小鼠胸腺指数和脾脏指数,降低小鼠免疫力,表明高糖情况下小鼠胸腺和脾脏功能降低,丹参茎叶醇提物、总酚酸组分和丹参根总酚酸组分显著提高糖尿病小鼠免疫指数,对胸腺指数改善作用:根茎总酚酸>茎叶醇提物>茎叶总酚酸;对脾脏指数保护作用:茎叶总酚酸>茎叶醇提物>根茎总酚酸。

与正常组小鼠相比,T2DM小鼠胰岛数量少,形态不规则,胰岛内细胞分布不均匀,有轻度或中度变性。

给药后,糖尿病小鼠胰腺结构有一定改善。

糖尿病小鼠血清胰岛素含量显著升高,丹参茎叶总酚酸组分降低糖尿病小鼠血清胰岛素含量作用并不明显。

研究表明丹参茎叶总酚酸组分对糖尿病多脏器损害均有保护作用,但是其对糖尿病肾脏损害和消化道损害的保护作用较好,其对糖尿病肾脏和肠道损害的保护作用略优于丹参根总酚酸。

(3)丹参茎叶醇提物对Ⅰ型糖尿病小鼠、糖尿病肾病大鼠和正常小鼠肠道的影响①STZ造模后对小鼠的十二指肠肠壁和粘膜厚度没有影响,但是导致小鼠回肠和结肠的肠粘膜萎缩,肠绒毛变短,隐窝数减少,固有层的畸形以及区域性硬化等病理变化,丹参茎叶醇提物能够有效缓解糖尿病小鼠回肠和结肠的病理形态的改变。

与对照组相比,T1DM小鼠血清VIP水平显著降低,AGEs水平显著上调。

丹参茎叶醇提物干预治疗后,糖尿病小鼠血清中VIP水平和AGEs水平被逆转。

与肠道组织病理形态变化一致,糖尿病造模前后的小鼠十二指肠中紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)的表达没有显著差异。

而回肠和结肠中ZO-1和Occludin蛋白表达显著降低,丹参茎叶醇提物给药后小鼠回肠和结肠中ZO-1和Occludin蛋白表达上调,表明肠道机械屏障被修复。

此外,采用Q-PCR检测结肠组织中TJP,ZO-1,Occludin,claudin-5的mRNA表达,STZ损伤后TJP(ZO-1,Occludin,claudin-5)的mRNA表达降低,丹参茎叶醇提物给药反转TJP mRNA表达。

采用16 sRNA对各组小鼠肠道内容物样品进行分析,评估各组肠道微生物群落结构的潜在变化。

丹参茎叶醇提物增加糖尿病小鼠肠道微生物多样性增加。

在所有样品中共鉴定了 11个主要菌门,模型组小鼠肠道菌群中脱铁杆菌门Deferribacteres、拟杆菌门Bacteroidetes、变形菌门Proteobacteria以及螺旋体门Spirochaetes丰度下降,而厚壁菌门Firmicuts和放线菌门Actinobacteria等数量增多。

T1DM小鼠肠道菌中厚壁菌门与拟杆菌门相对丰度明显高于空白对照组,而脱铁杆菌门丰度明显低于空白组,DJ给药后显著性改善失调的肠道菌群结构。

基于种的水平发现,丹参茎叶醇提物可以显著提高糖尿病小鼠肠道中粘液性细菌Mucispirillum schaedleri和丁酸弧菌Butyricimonas virsa的相对丰度;显著减少变形杆菌Proteus hauseri和罗氏杆菌Helicobacter winghaensis相对丰度。

通过样品层次聚类分析图和主坐标分析(PCoA)可以看出模型组样品与空白对照组样品很好地分离,表明造模成功,而给药组样品则分布于模型组与空白对照组之间,表明丹参茎叶醇提物对T1DM小鼠紊乱的肠道菌有调节作用。

②糖尿病肾病大鼠胃肠激素紊乱,大鼠血清中血管活性肠肽VIP和P物质SP 浓度显著降低,生长抑素SS浓度显著性升高。

丹参根和丹参茎叶提取物能不同程度改善糖尿病肾病大鼠血清中胃肠激素浓度。

糖尿病肾病大鼠肠道病理切片结果显示,肠道损害主要集中在近直肠端,表现为肠腺萎缩,黏膜层萎缩、变薄。

给药干预后,各组尤其是高剂量给药组肠道损害得以改善。

此外,对比检测各组出现黏膜层萎缩,肠腺萎缩等损害的样本数发现,丹参茎叶对肠道损害的改善效果优于丹参根。

给药干预后糖尿病肾病大鼠的肠道降低的TJP表达显著提高,尤以丹参根水提物和丹参茎叶醇提物提高Occludin蛋白表达的作用最为显著。

③丹参茎叶醇提物对正常小鼠的体重、血糖、血清VIP和AGEs水平、对各个肠段也没有明显的作用。