硫酸苯酚法测定总糖原理与步骤

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原理:

苯酚法测定可溶性糖的原理是:糖在浓硫酸作用下,脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物,在10-100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比,且在485nm波长下有最大吸收峰,故可用比色法在此波长下测定。

步骤:

. 5%苯酚溶液:取适量苯酚(A.R),高温蒸馏,收集180℃馏分,称取50.0g,用水溶解,最后定容于1000m1棕色容量瓶中,冷藏避光保存。

. 葡萄糖标准液(200mg/L),精称110℃恒重的葡萄糖20.0mg,用水溶解,定容至100m1。精密吸取2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 ml分别置于100ml量瓶中加水定容至刻度,摇匀得葡萄糖稀释液。

. 标准曲线的制备:分别精密量取上述各稀释液2 ml置具塞试管中,同时精密量取水2.0 ml置另一具塞试管中,各管分别加5%苯酚溶液(新制)1 ml,摇匀,然后迅速加入浓硫酸5.0ml,立即摇匀,于40℃水浴中保温30min,取出,置冷水浴中5 min。以上述2.0ml 水所制得的空白溶液做参比,于490nm波长处测定各溶液吸收度,以葡萄糖稀释液的浓度(μg/ml)为横坐标,吸收度为纵坐标,绘制标准曲线。

. 样品的测定:吸取已定容的水解样(必要时可稀释到一定体积)2.0ml置于25ml 比色管中,加5%苯酚试剂1.0ml,迅速滴加5.0ml浓硫酸,摇匀后在室温下静置30min;每个样品做三个平行样。于490nm处用空白调零测吸光度,然后代入标准曲线算出其总糖含量。

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