硫酸苯酚法测定总糖原理与步骤

原理：

苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。

步骤：

. 5%苯酚溶液：取适量苯酚(A.R)，高温蒸馏，收集180℃馏分，称取50.0g，用水溶解，最后定容于1000m1棕色容量瓶中，冷藏避光保存。

. 葡萄糖标准液(200mg/L)，精称110℃恒重的葡萄糖20.0mg，用水溶解，定容至100m1。精密吸取2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 ml分别置于100ml量瓶中加水定容至刻度，摇匀得葡萄糖稀释液。

. 标准曲线的制备：分别精密量取上述各稀释液2 ml置具塞试管中，同时精密量取水2.0 ml置另一具塞试管中，各管分别加5%苯酚溶液（新制）1 ml，摇匀，然后迅速加入浓硫酸5.0ml，立即摇匀，于40℃水浴中保温30min，取出，置冷水浴中5 min。以上述2.0ml 水所制得的空白溶液做参比，于490nm波长处测定各溶液吸收度，以葡萄糖稀释液的浓度（μg/ml）为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。

. 样品的测定：吸取已定容的水解样（必要时可稀释到一定体积）2.0ml置于25ml 比色管中，加5%苯酚试剂1.0ml，迅速滴加5.0ml浓硫酸，摇匀后在室温下静置30min；每个样品做三个平行样。于490nm处用空白调零测吸光度，然后代入标准曲线算出其总糖含量。