实验三愈伤组织的诱导
绿豆芽愈伤组织诱导培养实验报告
绿⾖芽愈伤组织诱导培养实验报告⽣物⼯程中游技术实验--植物组织、器官培养的研究学校：学院：班级：姓名：学号：绿⾖芽愈伤组织诱导培养实验【摘要】本实验以MS＋2,4-D为基本培养基,添加NAA或6-BA,对绿⾖芽材料进⾏体外培养,诱导形成愈伤组织。
结果表明,在⼀定浓度范围内,NAA和6-BA对绿⾖芽的诱导有促进作⽤。
不同激素组合培养下，绿⾖芽外植体形成愈伤组织的类型不同,其⾊泽、细胞的形态结构显著不同。
其中，细胞分裂素和⽣长素的组合诱导芽及芽的增殖效果最好，MS+6-BA(6mg/L)+NAA(0.4mg/L)培养基最适。
【关键词】绿⾖芽；组织培养；愈伤组织；6-BA；2,4-D；NAA;全能性⼀、前⾔细胞⼯程(Cell engineering) 是指应⽤现代细胞⽣物学、发育⽣物学、遗传学和分⼦⽣物学的理论与⽅法，按照⼈们的需要和设计，在细胞⽔平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变⽣物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染⾊体或基因移植以及组织和细胞培养等⽅法，快速繁殖和培养出⼈们所需要的新物种的⽣物⼯程技术。
其常⽤技术⼿段有植物组织培养，植物体细胞杂交、动物细胞培养、动物细胞融合、单克隆抗体、胚胎移植、核移植等。
根据细胞类型的不同，可以把细胞⼯程分为植物细胞⼯程和动物细胞⼯程两⼤类。
本⽂主要综述细胞⼯程中植物细胞⼯程的植物组织培养这⼀技术⼿段。
植物组织培养技术的应⽤范围包括快速繁殖、培育⽆病毒植物，通过⼤规模的植物细胞培养来⽣产药物、⾷品添加剂、⾹料、⾊素和杀⾍剂等。
植物组织培养，诱导愈伤组织形成和形态发⽣，使⼀个离体的细胞、⼀块组织或⼀个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。
在植物组织培养中，由于植物细胞具有全能性,即植物的体细胞具有母体植株全部遗传信息并会发育成为完整的个体。
因⽽,每⼀个植物细胞可以像胚胎细胞⼀样,经离体培养再⽣成植株。
随着细胞⼯程技术的不断发展,植物细胞和组织培养这⼀细胞⼯程技术也⽆例外地得到发展,⽬前已在许多植物上,特别是在农林⽣产实践中得到了⼴泛应⽤。
愈伤组织的诱导和培养
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223愈伤组织的诱导和培养一、实验目的及意义植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。
通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。
二、实验原理植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。
如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。
植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。
三、实验仪器与药品超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗四、实验步骤1.按下表分别配制培养基将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。
洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。
进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。
3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。
取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。
4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况五、实验结果组织长芽，而当生长素含量大于细胞分裂素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定根，也可形成愈伤组织，细胞色素沉淀情况严重；NAA为植物生长素，6-BA为细胞分裂素，促进扦插生根，而当细胞分裂素含量大于生长素含量时，二者共同作用在室温下可诱导外植体生成不定芽，此次实验由于温度非形成愈伤组织的最适温度，所以未形成完整的愈伤组织细胞团。
植物愈伤组织诱导培养基的配制
植物愈伤组织诱导培养基的配制植物愈伤组织诱导培养基（简称愈伤培养基）是一种含有特定激素和营养物质的培养基，其主要作用是诱导植物体组织形成愈伤组织，从而实现植物组织培养、育种等研究。
本文将介绍植物愈伤组织诱导培养基的配制。
一、基础盐溶液的配制基础盐溶液是愈伤培养基的基础成分，其配方基本固定，主要成分包括无机盐和蔗糖等。
基础盐溶液的配入量不同，会影响培养基的pH等指标。
基本的基础盐溶液配方：碳酸钾（K2CO3）2.5g、硝酸铵(NH4NO3)1.0g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）1.0g、氯化钙（CaCl2·2H2O）0.15g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.25g、蔗糖20g、亚硫酸氢钠（NaHSO3）0.25g、维生素B5（nicotinic acid amide）0.1mg、维生素B1（thiamine·HCl）0.1mg，配入1L蒸馏水中。
注意：不同植物种类的愈伤培养基种类略有不同，需要根据实验需求和特性进行差异化调整。
二、植物生长素的添加植物生长素是愈伤组织诱导的必要因素之一，常用的生长素有IAA、IBA、NAA、2,4-D 等，其中2,4-D是最常用的生长素。
植物生长素的添加量需要视植物种类、处理目的和生长素种类而定。
一般情况下，2,4-D的添加量为1-2mg/L，但不同品种之间的生长素敏感性可能不一致，因此需要优化试验条件。
如果使用IBA或NAA等生长素，其配入量一般为0.1-0.5mg/L。
三、其他添加物除了基础盐溶液和植物生长素外，愈伤培养基还需要添加其他营养物质、激素等。
下面列举了一些常用的添加物及其配入量：1、硫酸甘露醇（mannitol）：2-3%。
用于储存或早期培养。
2、水杨酸（Salicylic acid）：10-500mg/L。
用于抑制愈伤组织的黑化和坏死。
3、多种维生素：如维生素B1、B5、C，一般用于添加到培养基中的含量为5-10mg/L。
第三章 植物愈伤组织的诱导、继代及分化
⑶先芽后根：愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心， 从中仅分化出芽，一般情况下待芽长到一定大小时，切下 移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。
有些植物在分化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根， 形成完整的植株。大多数植物均属这类正常的分化途径， 这类苗移栽较易成活。
⑷先根后芽：有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分 化出根，而后在靠近愈伤组织的根部上再分化出芽，有的 将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至 在根端也能分化出芽。
从单个细胞或外植体上脱分化形成典型的愈 伤组织，大致经历三个时期：
起动期：又称为诱导期,
是愈伤组织形成的起点。 外植体已分化的活细胞 在 外源激素的作用下，
通过脱分化起动而进入 分裂状态，并开始形成 愈伤组织。
起动期
分裂期
分裂期：外植体切口边缘开
始膨大，外层细胞通过一分 为二的方式进行分裂，从而 形成一团具有分生组织状态 细胞的过程。
二、从愈伤组织建立悬浮培养体系
多数悬浮培养物（suspension cultures）是将生长快、质地 疏松的愈伤 小块转移到与愈伤诱导含同样成分的液体培养 基里进行振荡培养而获得。
接种时必须有足够多的细胞块，以保证有较合适的细胞密 度。振荡速度一 般为 30-150rpm。
第一次继代时，应去掉开始时接入的大块细胞团——过滤。
第三节 愈伤组织分化与植株再生
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的生产。 体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着于原组织，每一 个体细胞胚称为胚状体，它可以同 合子胚一样发育成植株。 器官发生：指从愈伤组织形成芽及根的过程，芽是一个单 极性结构，物理地同母体组织联结着。
细胞分化
无论是在离体还是在活体条件下，植物细胞分化 研究的重点是维管组织的分化，特别是木质部成 分的分化。
植物愈伤组织诱导实验
实验一植物愈伤组织诱导实验一、实验目的1、掌握植物愈伤组织诱导、继代、器官分化的原理。
2、培养基的配制，灭菌等基本实验操作技术。
二、实验原理植物组织培养是将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。
植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。
而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。
植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。
超净工作台原理：本工作台是一种水平单向流型局部空气净化设备室内空气→预过滤器(初滤) →小型离心风机压入静压箱→高效空气过滤器(精滤) →出风面吹出洁净气流(具有一定的、均匀的断面风速）→不断排除工作区原来的空气→形成高洁净的工作环境三、仪器试剂培养皿及培养架、光照培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、解剖刀、弯头镊子、剪子、100ml烧杯、培养皿（或不锈钢浅盘）、封口膜、棉线、橡皮筋、次氯酸钠（或HgCl2）、MS 培养基全部试剂、植物激素及生长调节物质、无水乙醇、工业酒精、胡萝卜四、实验步骤（1）用70～75%的酒精棉擦拭双手和操作台面，进行常规的无菌操作准备。
（2）将植物体用自来水冲洗后,用酒精棉擦拭欲取材部位表面, 或于70%酒精中浸沾数秒钟。
（3）将材料放入已灭菌的100ml烧杯（或试剂瓶）中，加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡5分钟。
（4）弃次氯酸钠浸泡液，再加入10%的次氯酸钠溶液，浸泡10分钟。
（5）弃次氯酸钠浸泡液，用无菌水浸泡漂洗3～4次，每次1～2分钟，用无菌镊子搅动。
（6）将已灭菌的植物材料置于灼烧后冷却的金属盘中，按无菌操作要求剥去外皮，用解剖刀切成5mm厚的薄片，弃去两头的两片，取中间部分的薄片，用镊子将其接种在愈伤组织诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶4～6片，均匀分散，以绿豆为材料时，将绿豆纵切或横切，去皮后分别接种。
愈伤组织实验报告
一、实验目的1. 掌握植物组织培养技术的基本操作流程。
2. 熟悉愈伤组织的诱导方法及再分化过程。
3. 学习植物激素在愈伤组织形成与再分化中的作用。
4. 了解植物细胞的全能性及组织培养技术在植物育种中的应用。
二、实验原理植物组织培养技术是将植物器官、组织或细胞在人工条件下进行无菌培养，使其在适宜的培养环境中生长、分化，最终形成完整植株的过程。
愈伤组织是植物组织培养过程中的一个重要阶段，它是由已经分化的细胞脱分化形成的无定形细胞团。
通过诱导愈伤组织，可以进一步分化为根、茎、叶等器官，实现植物繁殖和育种。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段。
2. 试剂：无菌水、无菌滤纸、70%乙醇、5%次氯酸钠、琼脂、蔗糖、硝酸钙、硝酸钾、硝酸铵、磷酸二氢钾、生长素、细胞分裂素、琼脂酶、滤纸等。
四、实验步骤1. 材料预处理（1）将水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段分别用70%乙醇消毒30秒，再用5%次氯酸钠消毒5分钟，最后用无菌水清洗3次。
（2）将消毒后的材料用无菌滤纸吸干水分。
2. 愈伤组织诱导（1）将预处理后的材料切成约1cm×1cm的小块，放入含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中。
（2）将培养皿放入培养箱中，在适宜的温度和光照条件下培养。
3. 愈伤组织再分化（1）将愈伤组织转移到含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中。
（2）在适宜的温度和光照条件下培养，观察愈伤组织分化为根、茎、叶等器官的情况。
4. 数据记录与分析（1）观察并记录愈伤组织的生长情况，包括生长速度、愈伤组织颜色、形态等。
（2）观察并记录愈伤组织再分化为根、茎、叶等器官的情况，包括器官形态、生长速度等。
（3）分析不同植物激素浓度对愈伤组织形成与再分化的影响。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织诱导实验结果表明，水稻叶片、玉米叶片、胡萝卜根段在含有不同浓度生长素和细胞分裂素的MS培养基中均能诱导出愈伤组织。
第三章-愈伤组织诱导
第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。
愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。
一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。
细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。
持续十几小时~几天。
2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。
3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。
若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。
2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。
颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。
一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。
3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。
迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。
其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。
生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。
二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。
愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。
组织培养实验教案
一、实验目的和要求：植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染，第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒，使它们保持无菌状态，做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每一个学生必须学好这套基本功。
在进行各类具体的组培实验前，首先了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的，总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。
通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。
二、仪器设备：天平、烧杯、容量瓶、量筒、移液管、培养瓶、烘箱三、试剂：过氧化氢、高锰酸钾、漂白粉、次氯酸钠、酒精四、实验步骤：1. 讲解实验室的构建情况。
2. 讲解内部仪器设备的名称及作用。
3. 组培实验室常用器械的洗涤和灭菌。
(一)玻璃器皿的洗涤1. 新购置的玻璃器皿的洗涤(学习、操作)因有游离碱性物质，使用前先用1%稀盐酸浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。
2. 已用过玻璃器皿先将残渣除去；用清水洗净，再用热肥皂水或者洗衣粉洗净，清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。
3. 对一些不宜刷洗的玻璃器皿如：吸管，滴管及较脏的器皿等先用去污粉和去油剂刷洗，自来水冲干净后，晾干，再浸入硫酸－重铬酸钾洗液中浸泡若干小时，用夹子取出在自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1－3 遍，稍晾不滴水后置于干燥箱内烘干备用。
4. 对带有凡士林，石蜡，或者胶布的器皿选用特殊方法处理后，再用常规方法洗涤。
带有凡士林的器皿须先用废纸把凡士林擦去，再用汽油擦洗干净，然后用热肥皂水煮沸半小时，刷洗后，自来水冲干净。
若带有石蜡，可在玻璃器皿下垫几层废纸，放入60－70℃温箱中加热1－2 小时，待石蜡融化后，再用废纸反复擦2－3 次即去石蜡再泡入洗衣粉的热水中洗干净最后用自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净若有胶布粘着物，先用70%酒精棉球擦数遍，溶解粘胶物，并用少许去污粉刷抺，再用洗衣粉煮沸半小时，刷洗干净，自来水冲洗，晾干，再泡入洗液。
愈伤组织的诱导
先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起 来形成一株小植株，只有芽和根的微管束是相通的，才能得到成 活的植株。
花枝、果枝、和树干
香果树简介
香 果 树 (Emmenopterys henryi) 又名庙瓜树、水萝卜， 为茜草科香果树属的单种，属落叶大乔木 ，为我国特产 单种属的古老珍稀濒危树种，属国家二级保护植物。
香果树是细木工艺、雕刻、装饰、建筑和家具的优良用 材 ， 其枝皮纤维细， 是供制蜡纸及人造棉的好原料。 它的花大， 树姿雄伟， 也是庭园观赏树种。
香果树简介
主要分布在西南地区和长江流域。香果树的分布虽然较广 泛，但多零星分散，种群数量不多，自然条件下种子萌发 率低，又由于长期以来人为的滥砍滥伐、过度放牧，使其 种群分布范围逐年缩小，种群数量日益降低，处于濒危甚 至灭绝的状态。
香果树生根
香果树移栽
当苗长到3～5cm高时，洗净根上的培养基， 将苗移入装有富含有机质、易排水、透气性好的椰 绒花盆里。然后置入人工气候箱中培养，温度25℃ 左右，湿度80%左右，在人工气候箱中生长一个月 后移到室外，成活率95%以上。
移栽成活的香果树的苗
【小结】
植物组织培养过程
离体的植物 脱分化
2.外植体来源及其生理状态
理论上讲，植物体细胞均具有全能性，但在一些 植物中，胚状体产生和器官分化与离体培养的器官或 组织密切相关。如油菜的花器官比叶、根易于分化成 苗，水稻和小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。 甜菜花芽和花茎愈伤组织能分化成芽，而根切断愈伤 则不能形成芽器官。
2.外植体来源及其生理状态
一.愈伤组织形成条件
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立
烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立一、概述烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，是植物组织培养领域中的一项重要研究。
烟草作为一种重要的经济作物，其组织培养技术的研究对于提高其生产效率、优化品质具有重要意义。
愈伤组织的诱导是植物组织培养的第一步，也是后续细胞悬浮培养、基因工程操作等的基础。
烟草愈伤组织的诱导，通常通过无菌操作，利用激素等生长因子刺激烟草叶片等外植体细胞脱分化形成。
这一过程不仅受到激素种类和浓度的影响，还受到光照、温度、湿度等培养条件的影响。
优化诱导条件，降低褐化等不利因素的影响，是烟草愈伤组织诱导研究的关键。
细胞悬浮培养体系的建立，则是进一步将愈伤组织转化为可用于大规模生产和基因操作的细胞悬浮液。
通过选择适当的培养基、调节生长条件、优化细胞悬浮密度等手段，可以实现烟草细胞的稳定增殖和高效表达。
本文旨在探索烟草愈伤组织的诱导条件以及细胞悬浮培养体系的建立方法，通过系统的实验设计和优化，为烟草组织培养技术的发展和应用提供理论基础和实践指导。
这一研究也将为其他植物的组织培养提供有益的参考和借鉴。
1. 烟草愈伤组织诱导与细胞悬浮培养体系的重要性烟草愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系的建立，在植物组织培养、基因工程以及植物快繁等多个领域都具有重要的科学意义和实践价值。
愈伤组织的诱导是植物组织培养中的关键环节。
通过特定的培养基和培养条件，可以诱导烟草叶片等外植体脱分化形成愈伤组织。
这一过程不仅验证了植物细胞的全能性，而且为后续的细胞悬浮培养提供了适宜的起始材料。
细胞悬浮培养体系的建立为植物细胞的大规模培养和遗传转化提供了平台。
通过优化悬浮培养条件，可以获得大量生长状态良好的细胞，进而用于后续的基因转化、次生代谢产物生产等研究。
悬浮培养体系还可以用于筛选具有优良性状或抗性的细胞株系，为烟草育种提供新的途径。
烟草愈伤组织诱导及细胞悬浮培养体系在植物快繁方面也具有潜在的应用价值。
通过诱导愈伤组织再分化形成不定芽或胚状体，可以在短时间内获得大量的植株，从而实现烟草的快速繁殖。
实验三 大豆子叶的愈伤组织诱导
实验三大豆子叶的愈伤组织诱导姓名:曹跃强专业班级:农学10-4 学号:20100359 指导老师：刘帆、倪苏摘要：本实验以大豆子叶作为外植体，研究不同种类激素、浓度对大豆子叶的愈伤组织的影响。
实验结果表明：在四种培养基中，以MS+6-BA4.0 mg/L+NAA0.2 mg/L培养基愈伤组织诱导大豆子叶的愈伤组织最为有效。
大豆（Glycine max）别名菽、毛豆、黄豆、青豆、黑豆，是一种蝶形花科一年生草本植物[1]。
大豆呈椭圆形、球形,颜色有黄色、淡绿色、黑色等,大豆叶为三出复叶,花蝶形；大豆为短日照作物，品种间对短日照的敏感性差别大。
中国大豆的集中产区在东北平原、黄淮平原、长江三角洲和江汉平原。
大豆含有丰富的优质蛋白、不饱和脂肪酸、钙及B族维生素是我国居民膳食中优质蛋白质的重要来源。
大豆中维生素B1、维生素B2和烟酸等B 族维生素含量也比谷类多数倍，并含有一定数量的胡萝卜素和丰富的维生素E[2]。
大豆原生质体和单细胞的组织培养与植株再生早在60年代，Cocking 用酶法成功地分离出高等植物原生质体后不久，就有不少研究工作者试图用豆科植物进行原生质体的分离和培养[3]。
本实验以大豆的子叶作为外植体，通过该实验获得大量的大豆子叶的愈伤组织，且进一步学习和了解植物组织培养技术。
关键词：大豆子叶离体培养愈伤组织1 材料与方法1.1 材料名称及来源大豆子叶由植物生理系提供1.2 实验方法1.2.1 材料处理将大豆从荚中取出，用纱布包裹起来，流水冲洗，进行预处理备用。
1.2.2 培养基制备以MS作为基础培养基，添加不同种类的激素、浓度，如表1所示：表1 四种不同培养基的水平水平（mg/L）6-BA NAA 2，4-D KTA 2.0 0.2 ——B 4.0 0.2 ——C —— 2.0 1.0D —— 4.0 1.0以上培养基均加入肌醇100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5g/L，pH=5.8，且均配置500ml即可。
胡萝卜愈伤组织培养实验报告
植物细胞工程-胡萝卜的组织培养姓名：物理数学狂班级：生物技术综合班学号：2019004284【实验计划】1.MS培养基母液的配置与保存、MS固体培养基的配置（准备实验）2.外植体胡萝卜愈伤组织的诱导培养（2018.10.18）3.胡萝卜愈伤组织的继代培养（2018.11.8）4.胡萝卜愈伤组织悬浮培养（2018.11.22）5.胡萝卜愈伤组织诱导生根（2018.12.1）6.观察实验结果（2018.12.13）【实验时间】2018年10月18日-2018年12月13日实验（一）MS 培养基母液的配制与保存一、实验目的1.通过MS 培养基母液的配制，掌握配制培养基母液的基本技能；2.掌握培养基各种母液的保存方法。
二、实验原理1.MS 培养基的特点：①无机盐浓度高；②高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐；③含有一定的铵盐，营养丰富；④不需要添加更多的有机附加物。
MS 按照营养水平划分为基本培养基。
2.培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养物质，配置培养基时，为了减少试剂称取时的工作量出现的误差，以及多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，需要预先将各种营养成分配置为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到适合的浓度。
母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。
3.需要时将配置好的母液按一定比例稀释到培养基指定浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调解物质等，制成符合要求的培养基。
三、器材与试剂1.器材：各类天平、磁力搅拌器、冰箱、烧杯、量筒、玻璃棒、试剂瓶、标签；2.试剂：95%酒精，0.1-1N NaOH ，0.1-1N HCl ，配制MS 培养基所需的各种无机物、有机物，蒸馏水。
四、方法步骤（一）母液的配制母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10—100倍。
优点：（1）保证各物质成分的准确性；（2）便于配置时快速移取；（3）便于低温保藏。
1.MS 大量元素母液（10×）称10升量溶解在1升蒸馏水中。
组织培养的实验报告
一、实验目的1. 掌握植物组织培养的基本原理和方法。
2. 熟悉植物组织培养中培养基的配制、消毒和接种技术。
3. 学习植物组织培养过程中愈伤组织的诱导、继代培养和器官分化等关键技术。
4. 了解植物组织培养在植物育种、种质资源保存等方面的应用。
二、实验原理植物组织培养是指将植物的器官、组织或细胞在人工控制的条件下，通过脱分化、再分化等过程，使其生长、发育成完整植株的技术。
植物组织培养技术具有操作简便、繁殖速度快、不受季节限制等优点，在植物育种、种质资源保存、生物工程等领域具有广泛的应用。
三、实验材料1. 植物材料：小麦种子、胡萝卜切块、番茄叶片等。
2. 培养基：MS培养基、1/2 MS培养基、1/4 MS培养基等。
3. 试剂：氯化钙、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、蔗糖、吲哚乙酸（IAA）、6-苄基氨基腺嘌呤（6-BA）等。
4. 仪器设备：超净工作台、高压灭菌锅、电炉、移液管、培养皿、剪刀、镊子等。
四、实验步骤1. 培养基的配制（1）称取适量氯化钙、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁等试剂，加入少量蒸馏水溶解。
（2）将溶解后的试剂溶液加入适量琼脂，搅拌至溶解。
（3）将溶解后的琼脂溶液加入蔗糖，搅拌均匀。
（4）将溶液加热至沸腾，持续搅拌，使琼脂完全溶解。
（5）待溶液冷却至50℃左右，加入适量IAA和6-BA，搅拌均匀。
（6）将溶液分装至培养皿中，待凝固后，置于高压灭菌锅中灭菌30分钟。
2. 植物材料的消毒（1）将植物材料用流水冲洗干净。
（2）用75%乙醇消毒30秒。
（3）用无菌水冲洗3-5次。
3. 植物材料的接种（1）将消毒后的植物材料切成小块或叶片。
（2）将植物材料接种至培养基中。
4. 培养与观察（1）将接种后的培养皿置于培养箱中，温度控制在25℃左右，光照时间为12小时/天。
（2）定期观察愈伤组织的形成、生长和分化情况。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织的形成经过一段时间培养，小麦种子、胡萝卜切块、番茄叶片等植物材料在培养基上形成了愈伤组织。
第三章_愈伤组织诱导及分化调控
1. 外植体的选择 需考虑以下因素:
(1) 外植体的基因型 (2) 同一植物不同部位外植体，其细胞的分化能
力有相当大的差别 (3) 植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更
容易去分化
一个细胞向分生状态回复过程所能进行的程度， 取决于它在原来所处的自然部位上已经达到的细 胞分化程度和生理状态
再生植株：器官发生(organogenesis)和体细胞 胚胎发生(somatic embryogenesis)
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的 生产。体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着 于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以 同合子胚一样发育成植株。
器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈 伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器 官的过程 。
从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具 有全能性。
差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受 精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖 细胞的低。
全能性实现的两个必须满足的条件： 把具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影
响下解脱出来 要给予植物细胞一定的刺激
二、几个重要的概念
外植体（explant): 植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，
（2）物理因素 光：
很多光照条件下，一些植物均能进行器官发生， 说明光周期并不是非常重要的因子
有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而 在连续光照下则不能
尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期， 多数培养条件是14-16h光照，8-10h黑暗
温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉 花就不一样
B
植物缔组织实验报告
一、实验目的1. 掌握植物组织培养的基本原理和操作技术；2. 通过植物组织培养，了解植物细胞的全能性及再分化过程；3. 掌握愈伤组织的诱导、培养及再生方法；4. 培养学生的实验操作能力和科学思维。
二、实验原理植物组织培养是指将植物的器官、组织或细胞在无菌条件下，通过人工配制的培养基进行培养，使其再生出完整植株的过程。
该实验主要涉及以下几个环节：1. 愈伤组织诱导：将植物外植体在诱导培养基上培养，使其脱分化形成愈伤组织；2. 再分化：将愈伤组织转移到分化培养基上，诱导其分化出根、茎、叶等器官；3. 再生：将分化出的器官继续培养，使其再生出完整植株。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：拟南芥、玉米、番茄等植物的外植体；2. 仪器设备：超净工作台、高压灭菌锅、水浴锅、培养箱、解剖刀、剪刀、镊子、移液枪、三角烧瓶、培养皿、滤纸等；3. 试剂：MS培养基、活性炭、琼脂、蔗糖、2,4-D、IAA、6-BA等。
四、实验步骤1. 外植体消毒：将植物外植体用75%乙醇消毒30秒，再用无菌水清洗3次；2. 外植体切割：用解剖刀将外植体切割成约0.5cm³大小的组织块；3. 愈伤组织诱导：将切割好的外植体接种到诱导培养基上，置于培养箱中培养；4. 再分化：待愈伤组织形成后，将其转移到分化培养基上，继续培养；5. 再生：待分化出根、茎、叶等器官后，将其转移到生根培养基上，培养至生根；6. 成株培养：待植株生长至一定高度后，将其移栽至土壤中，进行常规管理。
五、实验结果与分析1. 愈伤组织诱导：实验中发现，拟南芥、玉米、番茄等植物的外植体在诱导培养基上均能成功诱导出愈伤组织；2. 再分化：在分化培养基上，愈伤组织逐渐分化出根、茎、叶等器官，部分植株已形成完整植株；3. 再生：在生根培养基上，植株生长良好，生根数量适中；4. 成株培养：移栽至土壤中的植株生长旺盛，叶片翠绿，根系发达。
六、实验结论通过本次实验，我们成功掌握了植物组织培养的基本原理和操作技术，了解了植物细胞的全能性及再分化过程。
植物的组织实验报告
一、实验目的1. 掌握无菌操作的植物组织培养方法；2. 通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法；3. 通过诱导豌豆根、茎、叶形成愈伤组织，学习愈伤组织的建立方法；4. 了解植物细胞通过分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整再生植株的过程，加深对植物细胞的全能性的理解。
二、实验原理植物组织培养是一种利用无菌操作，将植物器官、组织或单个细胞在人工条件下培养，使其继续生长甚至分化发育成完整植株的技术。
在培养过程中，植物组织经历脱分化作用和再分化作用。
1. 脱分化作用：植物组织在培养条件下，原本已分化停止生长的细胞重新分裂，形成无组织结构的细胞团，即愈伤组织。
2. 再分化作用：脱分化后的愈伤组织在一定条件下，重新分化形成输导系统、根和芽等组织和器官。
植物细胞的全能性是指每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，在一定培养条件下，每个细胞都可以发育成一个与母体一样的植株。
三、实验器材与试剂1. 试剂：乙醇、IAA或2,4-D、HgCl2（或次氯酸钠）、6-苄基氨基腺嘌呤（6-BA）、MS培养基2. 仪器设备：培养室、高压灭菌锅、水浴锅、解剖刀、三角烧瓶（100mL）、烧杯、量筒、培养皿、超净工作台、分析天平、长镊子、剪刀、橡皮筋等四、实验步骤1. 配制培养基（1）愈伤组织诱导培养基：将MS培养基（蔗糖含量为10g/L，2,4-D含量为2mg/L，琼脂10g/L）进行高压灭菌。
（2）试验培养基：将MS培养基（蔗糖含量为10g/L，6-BA含量为0.5mg/L，琼脂10g/L）进行高压灭菌。
2. 无菌操作（1）将豌豆种子浸泡在75%乙醇中消毒30秒，然后用无菌水冲洗3次。
（2）将消毒后的豌豆种子用解剖刀切成小块，放入含有70%酒精的三角烧瓶中消毒30秒，再用无菌水冲洗3次。
（3）将消毒后的豌豆种子放入含有HgCl2的三角烧瓶中消毒10分钟，再用无菌水冲洗5次。
3. 愈伤组织诱导（1）将消毒后的豌豆种子接种到愈伤组织诱导培养基中，置于培养室内，培养温度为25℃，光照时间为12小时/天。
水稻转基因实验操作[2]
![水稻转基因实验操作[2]](https://img.taocdn.com/s3/m/ee8ee83143323968011c927c.png)
水稻转基因实验操作（谢越、赵建宁、艾鹏慧、孙淑斌整理）（2006.7）一、水稻（日本晴）愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液（5.2%次氯酸钠），浸泡30分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在30℃光照培养箱，培养4周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在30℃光照培养箱，继代培养1-2周。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、农杆菌（工程菌）培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌（EHA105）菌液100µl于4ml YEP（含50mg/LSpec和50mg/L Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。
三、感菌与共培养1）取培养好的工程菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rmp，离心1min，去上清。
用含200µmol/LAs的30ml AAM感菌液制成悬浮液。
2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟（愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可）。
3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；4）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
28℃（组培室）暗培养2.5天。
四、愈伤组织的抗生素筛选将愈伤组织取出，用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡（组培室震荡机最大速率）。
愈伤组织培养
愈伤组织培养一、外植体的选择愈伤组织培养的第一步是选择适当的外植体。
外植体可以是植物的根、茎、叶、花、果实等任何部分，但必须具有分生能力。
通常，选择新鲜、健康的幼嫩组织作为外植体，因为这些组织分生能力强，容易诱导出愈伤组织。
同时，外植体的选择还必须考虑其遗传背景、生理状态以及是否容易进行消毒等。
二、愈伤组织的诱导外植体在适当的培养基和条件下，能够被诱导形成愈伤组织。
这个过程涉及到细胞的脱分化，即细胞从特定的组织类型转变成未分化的状态。
为了成功诱导出愈伤组织，需要使用含有足够营养物质和植物生长调节物质的特殊培养基。
例如，高浓度的生长素和细胞分裂素可以促进细胞分裂和组织形成。
三、愈伤组织的增殖诱导出的愈伤组织需要在适合的培养基中进一步增殖。
这个过程需要持续监控并调整培养基的成分，以确保愈伤组织能够快速、健康地生长。
同时，还需要控制培养条件，如温度、光照、湿度等，以提供最佳的生长环境。
四、细胞分化的诱导增殖后的愈伤组织可以进行进一步的分化。
这个过程可以通过改变培养基的成分或添加特定的生长调节物质来实现。
例如，某些激素可以诱导愈伤组织分化成特定的组织或器官。
五、遗传稳定性的维持为了保持愈伤组织的遗传稳定性，通常需要进行长期的培养和多代的筛选。
这个过程可以通过定期检查染色体数目和结构来实现，以确保细胞的遗传稳定性。
同时，通过定期进行克隆繁殖，可以进一步维持细胞的遗传稳定性。
六、培养基的选择与优化愈伤组织培养的成功与否，很大程度上取决于培养基的选择和优化。
培养基是愈伤组织获取营养的来源，必须含有细胞生长所需的各类营养物质，如碳源、氮源、维生素、矿物质等。
同时，还需要添加植物生长调节物质，如生长素、细胞分裂素等，以调节细胞的生长和分化。
对于不同的外植体和实验目的，可能需要选择不同的培养基。
例如，MS、N6、B5等都是常用的培养基配方。
此外，培养基的pH值、渗透压等也需要进行适当的调整。
为了优化培养基，通常需要进行一系列的试验和筛选，以找到最适合特定组织或细胞的培养基配方。
愈伤组织培养-3
• 理论上愈伤组织是可以无限制继代，但 愈伤组织继代次数增加，形态发生能力 逐渐丧失。 • 原因：遗传因素即继代培养中通常出现 染色体紊乱。
REASONS
遗传上表现不稳定：染色体出现多倍 体和非整倍体
• 四、培养条件
• 1、光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需 光，分化需光。继代培养一般需光。此 时光对器官的作用是一种诱导反应。 • 2、温度：一般采用24～28℃的恒温条件 进行。 • 3、湿度：较大，以免引起培养基干缩。
并杀死微生物。
3.外植体的大小和形态
消毒后的植物材料，即可进行培养。
从外表均一的外植体长出的愈伤组织，在开始阶 段是相当一致的，而从茎、根等器官切段上长出 的则是一个混杂的愈伤组织。
有些外植体外表上看来是由同一类细胞组成，例 如烟草的髓、胡萝卜的次生韧皮部、菊芋的块茎 等，这些细胞中DNA的含量有很大差别。这种差 别可能是由于细胞核中染色体数目的差别，即倍 性不同所造成的。
1.一般植物组织都能诱发愈伤组织。 : 诱导愈伤组织的成败关键主要不是实验材料，而
是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的
因素。
双子叶植物为最多，单子叶植物(1990’s)，此外，
裸子植物、蕨类和藓类植物也有诱发成功的例子。
2.材料必须完全无菌
微生物一旦与培养长。
玻璃化现象的预防措施
• • • • • • • 适当控制培养基中无机盐浓度 适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 增加自然光照，控制光照时间 控制好温度 改善培养皿的气体交换状况 在培养基中添加其他物质
培养阶段易出现的其他问题
白花苗
愈伤组织的 培养
一、培养基 培养基一般包括大量元素、微量元素和一种碳 水化合物，最常用的碳水化合物是蔗糖。 这样简单的培养基(基本培养基)只有很少几种植 物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要 添加各种各样的附加物（完全培养基），如维 生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素、 赤霉素、螯合剂如EDTA、各种营养性的提取物 如椰子汁等。
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实验三愈伤组织的诱导
一、实验目的
1．巩固无菌操作技术；掌握愈伤组织的诱导培养方法；了解愈伤组织的形态特征。
2．学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。
二、实验原理
1．在适宜的离体培养条件下，已经分化的外植体细胞会发生脱分化而恢复其分裂能力，形成无序生长的薄壁细胞团，即愈伤组织。
培养基中的激素配比是影响愈伤形成的关键因素。
2．愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。
三、实验材料、仪器及用品
1、材料：实验2培养的甜瓜无菌苗，每人（2人）1瓶。
（或烟草苗）
2、仪器及用品：超净工作台，高压灭菌锅，光照培养箱，酒精灯，小喷壶；灭菌的不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、培养皿各33个；灭菌蒸馏水8份；实验1配制的愈伤组织诱导培养基每人1瓶；75%乙醇。
四、实验内容及操作方法
1）用75%酒精喷雾、擦拭超净工作台，并将除无菌苗以外的实验用具用75%乙醇喷雾后放入超净工作台中，然后打开超净工作台风机和紫外灯，照射灭菌20min。
2）在自来水管下将手洗净，然后用75%乙醇将手消毒，再进入超净工作台操作。
3）点燃酒精灯，打开已灭过菌的剪刀、镊子、解剖刀和培养皿等。
4）将培养无菌苗的三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将无菌苗夹取到培养皿中，然后剪取5-6片子叶，剪去叶边缘，并将其剪成3~5mm见方的小片，最后用镊子将其接种于愈伤组织诱导培养基上，每瓶接种8-12片。
5）快速封好瓶口，在瓶壁上标好姓名和接种日期。
6）将接种后的三角瓶置于25℃下暗培养一周，然后在同样温度下进行每天16h 光照和8h黑暗培养，直至愈伤组织形成。
7）将形成愈伤组织的材料进行继代培养。
三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。
如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。
8）封好瓶口，标好姓名和接种日期。
9）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。
注意事项：
1）剪切外植体时动作要快，以免造成失水而影响外植体活力。
为防止失水，也可在培养皿中滴几滴无菌水进行剪切。
2）操作时双手远离培养皿和三角瓶口，以免污染。
五、观察记载内容与实验报告
1、观察记载内容：每瓶接种数，4人小组接种总数，外植体的变化，愈伤形成的时间、数目及其形态特征，污染情况（3天后开始观察）。
2、每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。
每隔3天观察一次。
2、实验报告：每人一份。
1）实验目的
2）实验原理
3）实验方法：用流程图表示愈伤组织的培养方法。
4）实验结果与分析
A. 描述愈伤的形成过程及其形态特征；
B. 统计愈伤诱导率与污染率，分析引起污染的原因。
C. 描述培养物的变化及其形态特征；
D. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。
再生率=分化绿芽（不定根/小植株/胚状体）的愈伤或外植体数/接种总数×100%。