微生物限度方法学验证

细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
回收率测定举例 试液需用特殊制备方法（薄膜过滤法） 菌液组：1ml菌液 /平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平 均菌数：C) 供试品对照组：含1g或1ml的供试液，过滤冲洗，至少1 张膜（菌落计数：B) 试验组：含1g或1ml的供试液，过滤冲洗，+1ml菌液，过 滤，至少1张膜（菌落计数：A) 稀释剂对照组：稀释剂+菌液，过滤冲洗，至少1张膜 （菌落计数：D)
霉菌、酵母菌计数验证用菌株：白色念珠菌、黑曲霉。
菌株选择的原则:代表性,普遍性,低或非致病性,标准 菌株(或该药品中常见的污染菌)。 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。加菌 量:50～100cfu。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证方法选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、 中和法、离心沉淀法、联合方法。
微生物限度检查方法的验证
微生物限度检查方法的验证
• 细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证 ——准确性（回Байду номын сангаас率）
• 控制菌检查法的验证——专属性
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证的目的：
确认所采用的方法适合该药品的细菌、霉菌、酵母 菌数的测定。照此检查法和检验条件进行供试品细菌、 霉菌、酵母菌数检查能保证检验结果的准确、可靠。
备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数能 保证检验结果的准确、可靠。
若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用 培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法 等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并 重新验证。
控制菌检查法的验证
试验菌株：按规定检查的控制菌选择相应验证的菌株。 阴性对照菌株:选择原则，口服选用金黄色葡萄球菌，外 用选用大肠埃希菌 。 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的方法保存。 加菌量:10～100cfu
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组：最低稀释级供试液1ml+ 1ml菌液/平皿，平行2个 平皿（计算供试液平均菌数：A） 稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂 + 1ml菌液， 平行2个平皿（计算供试液平均菌数：D） 试验组回收率=(A－B)÷C×% 稀释剂对照组回收率=D÷C×%
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 平皿法：取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～ 100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基， 每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级 供试液1ml分别注入n个平皿，每个平皿再注入50～100 cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每 株试验菌平行制备2份，按平皿法测定其菌落数。
控制菌检查法的验证
验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及 下列要求进行。
验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。 试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入 增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查. 阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控 制菌检查方法的特异性，方法同试验组。
试验组：最低稀释级供试液0.2ml+ +加中和剂或乳化剂 1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计算平均菌数：A) 试验组回收率=(A－B)÷C×% 稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂+ 1ml菌液， 平行2个平皿（稀释剂对照组与试验组同法操作）（计算 平均菌数：D) 稀释剂对照组回收率=D÷C×%
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌 计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率 应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌。
样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。
培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、 营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液制备 (1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌
的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小 时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍 递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu /ml。
草芽孢杆菌）的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。 霉菌和酵母菌以各试验菌（白色念珠菌、黑曲霉）
的回收率均能达到70%以上的检测方法为准。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
计数方法的验证——结果判断 在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率
应均不低于70%。 若试验组的菌回收率均不低于70%，则按此供试液制
供试品的处理： 固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml 抑菌性供试品可采用加中和剂、自然沉降、离心或
薄膜过滤。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
• 菌液组 • 供试品对照组 • 试验组 • 稀释剂对照组 每一验证菌株均应进行上述试验（顺序）。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液， 过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu 试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。至少要一张 膜。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组： 离心沉淀法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液， 如供试液含许多药渣，先以低速500r/min离心3～5min， 取上清液，再以3000 r/min离心10～30min，取下面1ml 液体（A)，并用适当的稀释剂洗涤管底，将洗涤液与液 体（A)一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。
控制菌检查法的验证
控制菌检查验证用菌株：大肠埃希菌、沙门菌、金 黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌 。
控制菌检查法的验证
• 口服制剂 验证用菌株：大肠埃希菌 大肠菌群 沙门菌 阴性对照菌菌株：金黄色葡萄球菌 检查方法：大肠埃希菌按大肠埃希菌项下检查
回收率测定举例 供试液需用特殊制备方法（离心沉淀法） 菌液组：1ml菌液 /平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平 均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液10ml +离心，500rpm 离心取上清，加稀释剂至10ml ，取1ml 注平皿，平行2 个平皿（计算平均菌数：B)或3000rpm离心取沉淀，加稀 释剂至10ml ，取1ml 注平皿，平行2个平皿（计算平均 菌数：B)
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
回收率测定举例 供试液不用特殊制备方法 培养基稀释法（5个平皿） 菌液组：1ml菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均菌 数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液1ml分别注5个平皿，0.2 ml /平皿，平行2份，共10个平皿（计算0.2ml供试液 平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液0.2ml+1ml菌液/平皿，注5个平 皿，平行2份（计算平均菌数：A) 回收率=(A－B)÷C×%
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
过滤细菌的膜贴在预先倒好并预培养过的营养琼脂 培养基平板上，菌面朝上。
过滤霉菌酵母菌的膜贴在预先倒好并预培养过的玫 瑰红钠琼脂培养基平平板上，菌面朝上。 试验组回收率=(A－B)÷C×% 稀释基对照组回收率=D÷C×%
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
计数方法的确定 细菌计数方法与霉菌和酵母菌计数方法可以不一致。 细菌以各试验菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯
算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证细菌各平皿倾入营养琼脂培养基。 验证霉菌、酵母菌各平皿倾入玫瑰红钠琼脂培养基。 置规定温度培养48或72h,菌落计数。计算回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
回收率测定举例 供试液不用特殊制备方法 常规法 菌液组：1ml菌液 /平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平均菌 数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液1ml/平皿，平行2个平皿 （计算供试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液1ml+ 1ml菌液/平皿，平行2个平皿 （计算供试液平均菌数：A） 回收率=(A－B)÷C×%
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时， 可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌 浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
回收率测定举例 供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等) 培养基稀释法（5个平皿） 菌液组：1ml菌液/平皿，每株菌平行2个平皿（计算平均 菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液1ml分别注5个平皿， 0.2ml /平皿，平行2份，共10个平皿（计算0.2ml供试液 平均菌数：B）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液制备 (2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养
基中，23～28℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～ 10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组：最低稀释级供试液10ml+离心，500rpm离心取 上清，加稀释剂至10ml，取1ml+1ml菌液/平皿，平行2 个平皿（计算平均菌数：A)或3000rpm离心取沉淀，加稀 释剂至10ml，取1ml+1ml菌液/平皿，平行2个平皿（计算 平均菌数：A) 试验组回收率=(A－B)÷C×% 稀释剂对照组：取与菌液组细菌浓度相同的稀释剂10ml， 3000rpm离心取沉淀，加稀释剂至10ml，取1ml注平皿， 平行2个平皿（计算平均菌数：D)（稀释剂对照组与试验 组同法操作） 稀释剂对照组回收率=D÷C×%
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证的步骤：
• 根据样品特性，制定检验方法和检验条件。 • 保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试
验要求。 • 按制定的方法进行试验。 • 根据验证结果，判断是否符合验证的标准。若符合,按
验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不 符合，应重新设立验证方案，再进行验证，直至验证 结果符合设立的验证标准。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
计数方法的验证——结果判断指标 试验组的菌回收率（≥70%） 稀释剂对照组的菌回收率（≥70%）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
试验组的菌回收率计算：
（试验组菌落计数-供试品对照组菌落计数）÷菌液组×%
稀释剂对照组的菌回收率计算： 稀释剂对照组菌落计数÷菌液组×% 每一验证菌株均应进行上述试验。 验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计
菌液制备 (3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培
养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯 化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-
4～ 10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
培养基稀释法可以是1ml供试液注2个、5个或更多个 平皿。但是更多的平皿由于操作繁琐易污染一般不做。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
回收率测定举例 供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等) 常规法 菌液组：1ml菌液 /平皿，每株菌平行 2个平皿（计算平 均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液1ml /平皿，平行2个 平皿（计算供试液平均菌数：B）
菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注 入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定 供试品本底菌数。（和试验组采用同法）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证