放线菌抑菌圈实验

放线菌主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

本项目研究所用主要仪器为：高压蒸汽灭菌锅，生化培养箱，分析天平，电热恒温鼓风干燥箱，微波炉，空气恒温震荡器。

1.1.2 试剂

NaOH，乙醇，10%酚等。

1.1.3 菌种

本实验所用指示菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)。

1.1.4 培养基

（1）高氏I号培养基（g/L）[3]：可溶性淀粉 20；NaCl 0.5；KNO3 1；K2HPO4•3H2O 0.5；MgSO4•7H2O 0,01；FeSO4•7H2O 0.5；琼脂粉15-25，加去离子水至1L, pH7.4-7.6。121℃,灭菌20min。

（2）牛肉膏-蛋白胨培养基（g/L）[3]：牛肉膏3；蛋白胨10；NaCl5；琼脂粉15-20，加去离子水至1L,pH7.0-7.2。121℃,灭菌20min。

（3）发酵培养基（g/L）[4]：蔗糖45；黄豆粉25；KH2PO4 0.2；NaCl 1；NaSO4 0.1；FeSO40.01；CaCO3 3；加去离子水至1L，pH7.2。121℃，灭菌 20min。

1.2 方法

1.2.1采土样

选取有机质丰富、通气性良好的、偏碱性的土壤，（pH 7.0-7.5）。用小产挖取地表下5-25cm 的土壤5g。

1.2.2放线菌的筛选

（1）土壤悬浊液梯度稀释：将5.0g土壤加入到50ml无菌水中，震荡10min制备土壤悬液；用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml无菌水中作10倍稀释；按1:10稀释至10-3、10-4、10-5 [3]。

（2）倒平板：取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5，每个稀释度做两个培养皿）。然后在融化并冷却至50℃左右的高氏I号培养基加入10％的酚数滴，混合均匀；在每个培养皿中倒15-20ml左右，待冷凝备用[3]。

（3）涂布：用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-3、10-4、10-5的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小的开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀 [3]。

（4）培养：接种完毕，将平皿放入28℃培养箱中培养7天，观察平皿上放线菌菌落生长情况[3]。

（5）平板划线分离纯化：挑取培养7天后的平皿上的单个放线菌菌落，在淀粉琼脂平皿上进行三区划线法一次分离纯化，28℃培养7天。若不纯，则如上方法进一步分离纯化，直至纯培养为止，并观察放线菌菌落特征[3,4]。

1.2.3 鉴定菌种

制作装片，镜检，观察菌落特征，判断是否属于放线菌。

1.2.4产抗生素放线菌的筛选

（1）初筛：配制高氏I号液体培养基，分装于8个250mL的三角烧瓶中，每瓶50ml；鉴定出的菌株接种于高氏I号液体培养基中，于28℃，160r/min振荡培养7天。

（2）抑菌实验：配制牛肉膏蛋白胨培养基，分别倒15ml于12个培养皿中，冷却后作下层平板，将三种指示菌菌悬液和牛肉膏-蛋白胨培养液混匀后倒上层平板，并在其上放入牛津杯，在牛津杯中分别加入经离心（4000rmp，15min）的供试菌培养液0.1ml，于28℃培养24小时，观察抑菌圈情况，并测量其直径[5.6]。

（3）复筛：配制发酵培养基，分装于6个250ml三角烧瓶中。将初筛到的放线菌培养液以6%的接种量转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃，160r/min培养4天【5】，得发酵液。

2 结果与讨论

2.1 结果

指示菌菌种号

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌

2.2讨论

2.2.1关于菌种鉴定

放线菌可以产生色素，且放线菌代表属也分好几种。其菌落一般为圆形，菌落质地致密表面呈较紧密的绒状或坚实、干燥、多皱、地衣状、表面干燥，可作为鉴别菌种的基本参考依据。孢子丝生长到一定阶段可形成孢子。由于孢子含有不同色素，成熟的孢子堆也表现出特定的颜色，而且在一定条件下比较稳定，故也是鉴定菌种的依据之一（但孢子的形态和大小不能笼统地作为分类鉴定的重要依据）。

2.2.2关于放线菌的分离纯化

分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理，或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。