人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定

人心肌成纤维细胞的培养及免疫荧光鉴定

摘要】目的:探讨和建立适用于人心肌成纤维细胞体外培养及鉴定的技术方法。

方法：从将进行心脏手术患者体内取右心耳组织，用胰蛋白酶消化法消化分离细胞，再通过差速贴壁分离法收集心肌成纤维细胞，用含20%胎牛血清的DMEM培

养液进行培养并传代，光学显微镜下观察心肌成纤维细胞基本形态特征的变化，

波形蛋白(Vimentin)，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，Ⅷ因子(VWF) 抗体对细胞进行免

疫荧光鉴定。结果：形态学观察和免疫荧光鉴定显示，成功培养心肌成纤维细胞，纯度达95%以上。结论：胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法及免疫荧光鉴定是

一种简单有效的人心肌成纤维细胞培养方法。建立了一种纯度较高且保存了成纤

维细胞自身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养模型。

【关键词】心肌成纤维细胞原代培养胰蛋白酶消化法差速贴壁分离法免疫荧光

【中图分类号】R39 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）30-0052-03

心肌纤维化是各种心血管疾病发生、发展到一定阶段的共同病理改变，是心

肌重构的主要表现之一，而心肌成纤维细胞在这一过程中发挥着极其重要的作用。当前，心肌成纤维细胞体外实验研究模型主要集中建立在动物的心肌，人的心肌

成纤维细胞体外实验研究模型鲜有文献报道。我们参照Neuss等学者差速贴壁分

离和培养人心脏成纤维细胞的方法[1]，采用胰蛋白酶消化法结合差速贴壁分离法，成功分离培养出人心肌成纤维细胞，摸索出一种纯度较高且保存了成纤维细胞自

身增殖能力特点的人心肌成纤维细胞体外培养方法，为人心肌纤维化研究及人心

肌成纤维细胞增殖模型的建立提供了一种方法，现作报道。

一、材料与方法

（一）、材料:

取福建省立医院建立体外循环将进行心脏手术患者心脏停跳前的右心耳组织

约30mg，放入置于冰面上盛有PBS的无菌培养皿并立即送入实验室进行下一步

细胞分离培养。

（二）、主要试剂及配制

胰蛋白酶（美国Amersco公司），DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），

胎牛血清（美国Hyclone），免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠cy3（碧云天生物技术

研究所），免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC（碧云天生物技术研究所），V2258小

鼠波形蛋白单克隆抗体（美国Sigma公司），A2547小鼠α-SMA单克隆抗体（美

国Sigma公司），F3520兔VWF抗体（美国Sigma公司）。酶消化液:将胰蛋白酶溶于ＰＢＳ缓冲液(ｐＨ7.2～7.4)中，配成0.25%胰蛋白酶消化液，现配现用。基

础培养液：1包装DMEM干粉倒入约400ml膜去离子水中，磁力搅拌溶解，加膜

去离子水至900ml，加NaHCO3 3.7g，青霉素和链霉素各10万U使终浓度为

100U/ml，调PH值至7.2～7.4，加膜去离子水定容至1000ml，0.22um滤膜过滤

除菌后分装，4℃保存。2周内使用。临用前，加入20%胎牛血清。

（三）、主要仪器

AL104电子天平（瑞士梅特勒-托利多），3336二氧化碳培养箱（美国Forma

公司），OlympusIMT221倒置相差显微镜（日本Olympus公司），OlympusBH2

显微镜（日本Olympus公司），DMiRB型荧光倒置显微镜（德国Leica公司），PH211C酸度计（意大利HANNA公司）等。

（四）、方法

1、取材

心脏手术中建立体外循环心脏停跳前无菌条件下获取右心耳组织约30mg，

放在装有无菌预冷PBS液的大EP管中，立即送实验室，置于盛预冷PBS液的培

养皿中，用眼科虹膜剪剪去多余的外膜和脂肪，预冷PBS液清洗3次，去除血污，把心耳组织剪1mm×1mm×1mm的组织块备用。

2、酶消化分离培养法

组织碎块移入加有搅拌子的锥形瓶中，酶消化液冲洗剪刀及培养皿，转移至

锥形瓶中。加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍，37℃水浴箱孵育，打开磁

力搅拌器，60r/min搅拌10min，吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞，自然沉降

2min后遗弃上清液。再次加入酶消化液10～15ml消化10min。吸取上清液入离

心管，加入预冷培养液2ml，吹打均匀后，1200r/min离心4min，弃上清，细胞

沉淀加预冷的培养液吹打后用封口膜封口放于冰中备用。剩余组织块重复上述过

程若干次，直到组织块消失，分次收获细胞。

3、细胞培养

将分次收获的细胞悬液集中离心1次，将所有细胞沉淀集中于一个离心管加

适量培养液再离心1次。弃上清液加10ｍｌ含20%胎牛血清的DMEM培养液中，吹打几次以散开所有的细胞团接种于培养瓶中，置体积分数5%CO2、95%空气、37℃培养箱中培养，放置1ｈ差速贴壁，最先贴壁为心肌成纤维细胞，弃含有心

肌细胞的未贴壁的细胞悬液，加10ml含20%胎牛血清的DMEM培养液中，继续

培养心肌成纤维细胞，每2天换液1次。

4、分离纯化心肌成纤维细胞

在细胞培养中，心肌成纤维细胞具有分裂增殖能力，且生长迅速，贴壁较早，根据心肌成纤维细胞较心肌细胞贴壁速度较快的原理做差速分离去除心肌细胞。

贴壁细胞基本为成纤维细胞.每天在显微镜下观察细胞，并及时更换细胞培养液。

原代培养3～5天左右，见细胞形态由长梭形逐渐变成圆形或长满瓶壁的80%以

上即可进行传代培养。小心吸去瓶中原培养液，注意避免晃动及刮擦，加入

2mlPBS清洗后（刚好浸没瓶壁），用1～2ml含0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化约1～2min，倒置显微镜下观察细胞收缩变圆后立即将消化液吸出，并加入2ml

含20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞并制成细胞

悬液，将所得细胞悬液按体积比1:2稀释后接种于新培养瓶进行传代，实验用第2～3代细胞。

5、细胞活力检测

用体积分数4%的台盼兰染液进行活细胞拒染，加入细胞计数板中，立即置

于100倍镜下，进行细胞活力检测，未被台盼兰染上蓝色的为活细胞。细胞成活

率(%)=[(总细胞数-着色细胞数)/总细胞数×100%][2]。

6、形态学观察

倒置光学显微镜观察:在倒置光学显微镜下观察培养液色泽变化;观察心肌成

纤维细胞生长状态、形态变化。

7、心肌成纤维细胞的免疫荧光染色鉴定

（1）、心肌成纤维细胞的Vimentin抗原鉴定

取传2代心肌成纤维细胞以105个细胞接种于放有无菌盖玻片的6孔板，1-2天后用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入1ml固定液（4%多聚甲醛），固定

30min，用洗涤液洗涤3次，每次3-5min；加入封闭液1ml，在摇床上轻轻摇动