质粒转化大肠杆菌

质粒DNA的转化操作步骤

该实验主要有两个用途：

1．重组质粒的鉴定。当质粒的重组或其它载体重组后，通常会发生质粒的重组失败，包括质粒的自身环化。因而要求进行筛选，把重组成功的质粒找出来。在目前常用的质粒和其它载体中含有相应的抗生素抗性基因，一旦重组成功，质粒环化（包括自身环化），抗生素抗性基因表达，被转化的大肠杆菌便具备抗相应抗生素的能力，可以含该抗生素的培养基中生长传代，不然，重组失败，大肠杆菌便不能抵抗该抗生素而死亡。

2．为扩增质粒和其它载体作准备。由于大肠杆菌繁殖快，在适宜的条件下繁殖一代仅需要20~30分钟，而且常用质粒可以在大肠杆菌中达到几百个拷贝，因此，通过对转化成功的大肠杆菌培养，可以在短时内极大地扩增目的质粒。（作为分子生物学用大肠杆菌，是经过实验室改造过的工程菌。）

【原理】

转化是将外源DNA分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶(R-，

M-)。将对数生长期的细菌(受体细胞)经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的细胞)。

本实验采用CaCl2法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0～4℃，CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃90秒热激处理，促进细胞吸收DNA得合物。将细菌放置在非选择性培养基中（无抗LB培养液）于37℃振动培养一段时间，可使细菌复苏，表达质粒编码的抗生素抗性基因，在转化过程中获得的新的表型，提高转化效率。如氨苄青霉素耐药(Ampr)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。

本实验是将[ 某]重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。含[ 某]重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA。

【实验步骤】

自-70℃冰箱中取出受感态大肠杆菌，插入湿冰中溶解约15分钟，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml管，并立刻将细菌放回-70℃冰箱。

细菌50 ul

质粒1 ul

轻轻混匀，静置冰上30分钟。

于42℃水浴中热休克细菌90秒，迅速移入湿冰中，静置3分钟，加入700ul无抗LB 培养液，放入37℃恒温箱摇床，220rpm摇晃培养45min。取30-200ul涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。

次日，检查各培养皿中是否出现菌落。

【试剂与器材】

1.LB液体培养基 10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒

2.LB固体培养基在1升LB液体培养基中加15g琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。

3.倒A+、K+平板时，应冷却到50℃以下加抗生素

LB培养基

细菌培养用胰化蛋白胨10g

细菌培养用酵母提取物5g

NaCl 10g

加800ml水，放入磁力搅拌棒，在磁力搅拌器上搅拌至彻底溶解，用5M NaOH

（约0.2 ml）调节pH值至7.0，加水定容至1000 ml。高压15 lbf/in2（1.034×

105pa）消毒30分钟，冷却后可加入氨苄青霉素（50mg/ml）500ul，视载体特性

而定，混匀，即为含抗生素的LB培养液。存放于避光处。

含有琼脂的培养基

即在以上1000ml培养基中加入15g细菌培养用琼脂。

抗生素琼脂平板

待含有琼脂的培养基冷却后，加入抗生素，倾入培养皿，约30~50 ml，用煤气

灯火焰掠过培养基表面，以消除气泡。冷却后，标记，封于塑料袋中，倒置，

于4℃冰箱内避光保存。

大肠杆菌DH5α

DH5α菌株是一种能够摄入外源DNA的受容菌，普通的大肠杆菌细胞内有一种“免疫”机制，即当外源DNA

侵入时，会产生诸如限制性内切酶类的物质，将外源的DNA剪切掉，而其自身DNA因被修饰（如甲基化）所以不被限制酶识别，不会被剪切。这样的菌是不能直接用于基因工程的，我们总不希望目的基因导入进去还来不及复制就被剪切掉。DH5α菌株是一种经诱变的菌株，其基本特性是：Rˉ、Mˉ、AMPˉ。Rˉ是指DH5α菌株缺乏DNA 修饰，即其自身DNA 不会被修饰。Mˉ是指其缺乏“免疫”机制，不会对导入的外源DNA切割。AMPˉ是指其对氨苄青霉素敏感。DH5α菌株可以用于制作基因库等，除此之外，因其特性，可用作基因工程的受体菌。

如长时间保存需加灭菌甘油，在-20摄氏度保存。

限制修饰系统缺陷的变异株

即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。