小鼠骨髓细胞微核试验

三、固定 1 使细胞悬浮，加入固定液4ml混匀，放置 室温10－20min，然后1000r/min离心10min，去上 清 2 同样方法再固定一次，去上清，留0.5ml 四、制片染色 使细胞悬浮，将细胞悬液滴于冰冻的载玻片 上，干燥，用10％Giemsa染液染色10－20min，取 出清洗自然干 五、阅片 先在底倍镜下选择分散良好、细胞未破裂的 中期分裂相，油镜下观察并记录染色体结构异常 和数目异常细胞
低渗、固定、再离心 固定两次
染色
阅片
图13-1 细胞周期可划分为四个阶段
微核（micronucleus）
是染色体或染色单体的无着丝点片断或纺锤体受 损而丢失的整个染色体，于细胞分裂后期留在细 胞质中，末期后，单独形成几个规则的次核，包 含在子细胞的胞质内，比主核小，故叫微核。
原理：
1 有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝点 的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞 质中 2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向 移动，从而遗留在细胞质中
实验原理:
1 染色体畸变只能在细胞分裂的中期进行观察和
分析，为收集足够的中期相细胞，在收获细胞前， 用秋水仙碱处理，以阻断微管蛋白的聚合，抑制 细胞分裂时纺锤体的形成，使分裂间期和前期的 细胞停留在中期相。
2 细胞通过低渗，使染色体均匀散开，然后固定、
染色，可在油镜下观察
操作步骤
一、收获细胞 1 秋水仙碱处理实验动物（小鼠4mg/kg 处死动 物前6h腹腔注射） 2 取股骨 3 PBS液5ml冲洗骨髓，1500r/min离心10min， 去上清 二、低渗 1 打散沉淀物，加入37 ℃预温的0.075mol/L的 KCl 6ml混匀，于37℃低渗15－20min 2 再加固定液1－2ml混匀，立即于1000r/min离 心10min，去上清
结果分析与评价
结果： 以每只动物为观察单位，每只动物观察100个中 期分裂相，计算其畸变细胞率 分析与评价： 1 阴性和阳性对照组的畸变率应与所用动物 的种属及有关资料相符 2 试验结果可以用多种统计方法处理，所得 结果应该是相同的 3 各实验组即便细胞率与阴性对照组相比较， 应该有显著性差异，还应有剂量反应关系
注意事项： 1、剪胸骨时通过剪断两边的肋骨来把整块 胸骨取下来，以防不小心把胸骨剪断 2、挤出骨髓处的肌肉要剔除干净 3、滴到玻片上的小牛血清不要太多，涂时 要涂匀，以便推片 4、染色前可以先看一下整体涂片情况，细 胞分散度是否良好 5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优 良的染色
流程图
处死小鼠，取胸骨
四 观察和计数：
１ 观察：先用低倍镜观察，选择分布均匀的域，
再在油镜下观察计数。PCE细胞呈灰蓝色，正染红 细胞（NCE）桔黄色。细胞中的微核大半呈圆形， 边缘光滑，嗜色性与核质一致，一个细胞内可以 出现一个或多个微核。 ２ 计数：1000个PCE中含微核的PCE数，并计算 200个细胞中PCE/NCE的比值
图 1：正常精母细胞（× 1000 ） 图 2 ：精母细胞染色体环（× 1000 图 3 ：精母细胞链状四价体（× 1000 ） 图 4 ：精母细胞染色体数目减少（× 1000 ）
注意事项：
低渗是本实验的关键，控制好低渗时 间，做出分散良好的染色体标本，关系到 实验结果的准确性
流程图
处死小鼠，取股骨 取骨髓，离心wenku.baidu.com
小鼠骨髓细胞微核试验
受试物: 环磷酰胺 受试动物: 小鼠
实验目的
学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞(PCE)微核测定方 法
细胞分裂分为四个期：
1、G1期（DNA合成前期）：细胞生长，为DNA复制做 准备。 2、S期（DNA合成期）：体细胞的DNA含量由2C增加 到4C 3、G2期(DNA合成后期)：该期主要为M期作准备，包 括复制因子的失活和有丝分裂促进因子的分化,有 关细胞骨架系统重新组装的蛋白质合成 4、M期(有丝分裂期)：前期，早中期，中期， 后 期（微核形成期），末期
结论：
微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生的 染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传 学终点
微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中难以 与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数PCE细 胞中的微核，因为成红细胞发展为红细胞时，主 核排出，成为PCE，这些细胞保持其嗜碱性约24小 时，然后成为正染红细胞（NCE）,并进入外周血。
结果与分析： 1 结果：试验只计数PCE中的微核，微核率 以千分率表示。每组的雌雄动物分开计数 微核PCE均值。 2 分析：正常的PCE/NCE比值为1（0.6-1.2）， 如果＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制； 如果＜0.05，则表示受试物剂量过大，结果 不可靠。
图 1 ：正常嗜多染红细胞 PCE （× 400 ） 图 2 带微核嗜多染红细胞 MNPCE （× 400）
推片 固定 染色 观察并记数
动物骨髓细胞染色体畸变分析
目的和意义:
1、学习动物骨髓细胞染色体标本的制作 2、了解动物体内染毒及染色体畸变类型
染色体畸变：
指染色体的结构改变，它是指遗传物质大的 改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞 有丝分裂中期的染色体来发现
染色体畸变分析： 指观察染色体形态结构和数目改变，又称为 细胞遗传学实验
注：在主核排除时，微核仍保留在细胞中
操作步骤：
一 染毒：
染毒途径：腹腔注射环磷酰胺，染毒二次， 0、24小时各染毒一次，6h后取样 染毒剂量：50mg/kg
二 处死：
颈椎脱臼法处死小鼠
三：骨髓液的制备和涂片
1 处理：方法：取胸骨，去掉血污和肌肉，剪去 每节骨骺，用弯止血钳将骨髓挤于预先滴有小牛 血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片 2 固定：将推好凉干的骨髓片放进染色缸，甲醇 固定15分钟，取出晾干 3 染色：用新鲜配制的Giemsa应用液（Giemsa储 备液一份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9份）染色10－ 15分钟，细流水冲掉玻片染色液，晾干