第8章液固-液液色谱法

硅胶表面的活性作用点
物理吸附水
干燥表面
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❖ 硅胶按结构类型分类如下：
薄壳型
硅胶
无定形 全多孔型
球形
薄壳玻珠
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无定形
球形
全多孔硅中国胶药科大全学多药分孔教硅研胶室
薄壳玻珠和全多孔微粒硅胶性能比较
性能 平均粒度/μm 比表面积/（m2/g） 样品容量/（mg/g） 填充 分析速度
2、液－液分配色谱法的固定相
❖ 液－液分配色谱的固定相为涂渍在载体上的固定液。
涂渍了固定液的载体
1－流动相；2－固定液液膜；3－毛细深孔和渗入的固定液；
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4－液固界面；5－液液界面
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(1)载体
❖原则上，所有多孔性的吸附材料均可作为固 定液的载体。一般常用硅胶、硅藻土等。结 构类型主要采用多孔层微珠及全多孔微粒型 二种。
载体上涂渍的固定液越多，则因固定液流失 对样品保留体积的影响就越不显著。
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理想的载体
理想的载体应该具有如下特点： ① 孔容大； ② 孔径应为100～500埃之间。孔径太小，较大
的分子可能被完全排阻，而保留时间更短， 分离不佳；孔径太大，则固定液易流失，柱 稳定性差，由于毛细管作用，固定液在小孔 要比大孔内保持的好。
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❖ 液－液分配色谱法的固定液的选择也可参考纸色谱 法中使用的体系或从多组分中萃取已知组分的分配 体系。如在纸色谱里，甾体药物可以在浸渍甲酰胺 的纸上容易地分离，如果把甲酰胺涂在硅胶上，那 么甾族化合物就能用高效液相色谱分离，因为甲酰 胺即使在中等极性的溶剂苯、二氯甲烷中也几乎是 不溶解的。
第八章 高效液相色谱法
液－固吸附色谱 液－液分配色谱
主要内容
一 液-固吸附色谱法 二 液-液分配色谱法 三 正相硅胶反相洗脱色谱法
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一、液－固吸附色谱法
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1、液－固吸附色谱法的定义
液 色谱分离是基于吸附效应的色谱法称
︱ 为吸附色谱法，以固体吸附剂为固定
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（2）球形全多孔硅胶
❖球形全多孔填料外形为球形，常用粒径为3 μm～5 μm，下图为中国科学院兰州化学物理研究所生产的 高纯度多孔球形硅胶电镜照。
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放大3000倍
放大5000倍
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（2）球形全多孔硅胶
❖球形全多孔填料具有涡流扩散小，渗透性好 的优点；如果是硅胶先做成珠子再堆积而成 的话，即堆积硅珠，则具有传质阻抗小、载 样量大的优点，柱效也更高。球形填料外形 对称，比较容易填装出稳定的柱床，是化学 键合相的理想载体。
❖ 氧化铝分离几何异构体能力优于硅胶。
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3、液－固吸附色谱法的保留机理
固定相对它的吸附力 溶 质 流动相的“拉力”或溶解 分子 力
吸附力强而溶解能 力差时，溶质有较 大的保留。
吸附力差而溶解能 力强时，溶质有较 小的保留。
溶质处于这两相作 用力场的平衡之中
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取代基有更强的保留。
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4、液－固吸附色谱法的流动相
❖ 液－固吸附色谱中使用的流动相为各种有机溶剂， 主要为非极性的烃类（如己烷、庚烷），某些有机 溶剂（如二氟甲烷、甲醇、三乙胺等）作为缓和剂 加入其中以调节流动相的溶剂强度、极性及pH值， 即进行所谓正相色谱。流动相溶剂极性越大，洗脱 能力越强，溶质保留越小；流动相溶剂极性越小， 洗脱能力越弱，溶质保留越大。
图 液固吸附色谱法拆分苯基丁氨酸衍生物异构体
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（2）样品预处理
❖许多生物样品可使用经典液－固吸附色谱来 进行纯化，除去蛋白质等干扰物，然后再进 一步以GC或HPLC等分离分析。
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（3）制备色谱
❖由于硅胶比较便易，所以进行分离比较有利， 同时流动相为有机溶剂，容易挥发，便于产 物提取。
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薄壳玻珠 全多孔微粒硅胶
30～40 1.0～1.5 0.05～0.1 干法装柱
5～10 400～600
1～5 湿法装柱
慢
快
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（1）无定形全多孔硅胶
❖无定形全多孔的填料容易制备、价格低、 粒径一般为5 μm～10 μm，粒度分布较均 匀，理论塔板数可达50000 /m，比表面积 约300 m2/g，载样量大，但涡流扩散大， 渗透性差，比较难填装出稳定的柱床，一 般用来做制备柱。
两种模型
在吸附色谱体系中，溶剂分子和溶质分子均能被吸 附于吸附剂的活性位点上，当流动相流过固定相时， 样品组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面吸附中 心，同时，样品中不同组分分子也在竞争吸附中心。 ❖ 一是由Snyder和Soczewinski提出的竞争模式 （competition model）。 ❖ 二是由Scott和Kucera提出的溶剂作用模式（solvent initeraction model）——“双层吸附模型” 。
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己烷
己烷 环己烷
环己烷 异丙醚
甲苯 苯 乙醚 氯仿 一氯甲烷 丙酮
硝基甲烷 乙腈 丙酮 乙醇 甲醇
甲苯 苯 乙醚 氯仿 一氯甲烷 二氯甲烷 丙酮 乙酸乙酯 硝基甲烷
乙腈
丙酮
乙醇
甲醇
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（1）混合溶剂
❖液固色谱中广泛使用混合溶剂（二元、三元 体系等），这是因为虽然不同的纯溶剂有不 同的溶剂强度。但他们不一定是进行液－固 吸附色谱的最佳溶剂强度，我们可以利用不 同组成的混合溶剂获得任意需要的溶剂强度。
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（4）常用于HPLC-GC联用技术
❖由于流动相为有机溶剂，易于气化，所以目 前90%的HPLC-GC中的HPLC部分采用液－ 固吸附色谱，进行正相HPLC。
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二、液－液分配色谱法
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1、液-液分配色谱法的定义
液－液分 配色谱
基于样品组分在固定液和流动相之 间分配系数不同而分离的色谱法称 为液-液分配色谱法（Liquid-Liquid Chromatography，LLC）。
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❖ 流动相极性小于固定相极性的液－液色谱法称为正 相液－液色谱法，如以烷烃作为流动相，以含水硅 胶作为固定相的色谱系统。正相液－液色谱法适合 于分离极性化合物。
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流动相主体：弱极性的戊烷、己烷、庚烷等。 改 性 剂：调节流动相的洗脱强度与峰形。
中等极性：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯。 极性溶剂：四氢呋喃、乙腈、异丙醇、
甲醇、水等。 碱性物质：如三乙胺等，分离碱性品，
避免峰拖尾或不可逆的保留。
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（2）水的影响
❖硅胶及氧化铝为良好的干燥剂。水的含量对 该类吸附剂的活度有很大的影响，即使有极 微量的水吸附在其表面上，也会使吸附剂活 性大大降低。
双层吸附模型
❖ 双层吸附模型假定吸附剂表面先被流动相中极性较 强的组分以双层溶剂分子的形式所完全覆盖，双层 的结构及形成的程度取决于流动相中极性溶剂的浓 度，溶质通过柱子时与双层溶剂的第二层发生取代 或缔合而使溶质保留。
X. 溶质分子 Y. 溶剂分子 s. 吸附剂 m. 流动相
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❖ 流动相极性大于固定相极性的液－液色谱法称为反 相液－液色谱法，如以水为流动相，烷烃为固定相 的色谱系统。反相液－液色谱法适合于分离芳烃、 稠环芳烃及烷烃等化合物。
❖ 这两种系统由于固定液易流失、重复性差，已被键 合相色谱法所代替，但正相液－液分配色谱法在薄 层色谱法中还广泛使用。
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❖ 载体的涂渍采用GC中常用的固定液涂渍方法。
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3、液－液分配色谱法的保留机理
❖ 液－液分配色谱法的保留机理是根据样品组分溶入 固定相（s）与流动相（m）达到“平衡”后的分配 系数 K 的差异而分离。 m： 流动相 s： 固定液 Xm：在流动相中的溶质分子 Xs： 在固定液中的溶质分子
样品的吸附 能力
样品类型
无吸附
脂肪烃
弱吸附 中等吸附 强吸附
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烯烃、硫醇、硫醚、单环和双环芳烃、 卤代烃
稠环芳烃、醚类、腈类、硝基化合物和 大多数羰基化合物
醇类、酚类、胺类、酰胺类、亚胺类、 亚砜类、酸类
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一般保留规律
① F化物＜Cl化物＜Br化物＜I化物； ② 顺式几何异构体比反式几何异构体保留值大； ③ 官能团之间的分子内氢键将使保留值减小； ④ 极性基团旁边有庞大烷基存在时，保留值减小； ⑤ 环己烷衍生物和甾体化合物的中位取代基比轴端
固 相，以液体为流动相的色谱法，称为
吸 附
液－固吸附色谱法（Liquid-Solid
色 Adsorption Chromatography，LSC），
谱 简称液－固色谱法。
❖ 液－固吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一 种柱色谱类型。
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2、液－固吸附色谱法的固定相
❖ 优良的固定相填料应具备以下特性： 表面具有极性活性基团即吸附位点；形状适宜，最 好成微米级微球形，且粒径分布均匀；多孔性且比 表面积大，载样量大；化学性质稳定；机械强度高； 价格合理 。
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5、液－固吸附色谱的应用
❖随着HPLC技术的发展，虽然原来许多使用液 －固吸附色谱模式的分离分析被更方便、稳 定的化学键合相所代替，但在以下几个方面 仍有其独特的意义。
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（1）异构体的分离
❖ 许多异构体使用化学键合相来分离是不可能的或者 是很困难的，而采用以硅胶为固定相的液－固吸附 色谱却很容易分开。
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❖ 在吸附色谱中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧 化铝，此外还有高分子多孔微球（有机胶）、分子 筛及聚酰胺等。
❖ 固定相按极性大小分类如下：
按极性 大小分
极性吸附剂
酸性吸附剂：硅胶、硅酸镁 碱性吸附剂：氧化铝、氧化镁
非极性吸附剂：活性碳
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硅胶的性质
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竞争模式
❖ 竞争模式认为在被溶剂平衡的色谱柱中，弱极性或 中等极性的溶剂分子先被吸附剂吸附，覆盖于吸附 剂表面形成单分子层，当溶质分子进入色谱体系后， 便竞争置换（或顶替）溶剂分子而形成吸附。
X. 溶质分子 Y. 溶剂分子 s. 吸附剂 m. 流动相
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❖ 硅胶表面主要存在着硅羟基（Silanol，或称硅醇基） 和暴露于表面的Si－O－Si键，另外还有一些硅醇基 可能与水以氢键键合。硅羟基的表面浓度在液－固 吸附色谱中很重要，因为人们通常认为硅羟基是强 吸附位点，而Si－O－Si则是疏水性的。
OH Si
自由型硅醇基
O Si Si
O
硅氧烷型
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氧化铝
❖ 氧化铝与硅胶相似，但对水溶液、酸性或碱性水溶 液更加不稳定，所以，极少用作键合固定相的基质。
❖ 氧化铝适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非 强离解型的化合物，尤其适合于分离芳香族化合物。
❖ 当样品为碱性化合物时，用硅胶分离会造成严重吸 附，此时可选用氧化铝进行分离，但酸性易离解的 化合物容易在氧化铝上形成死吸附。
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(2)固定液
❖ 固定液可采用气相色谱中常用的某些固定液，如不 同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撑二醇等。然而， 对这些固定液，适合作为流动相的只有非极性链烃， 最多再加入少量（最高10%）的氯仿，四氢呋喃和 其它醚类。所有常见的洗脱液都是这些固定液的良 溶剂。但由于许多有机物样品在上述洗脱液中的溶 解度很小，所以这类体系的适用性是有限的。
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多孔层微珠
柱效好，分析时间短； 但它的多孔层很薄， 只能涂渍少量固定液 （最大涂渍1~2%）， 故柱容量低，柱稳定 性也差，因为少量的 固定液流失将大大改 变保留体积。
全多孔微粒
全多孔微粒（如硅胶） 孔容大（≈1ml/g）， 可涂渍较多的固定液， 涂渍量可达1克固定液 /每克载体（称为100 %涂渍），其柱效比 前者高，且柱容量高， 柱子稳定性也好。
溶质
流动相
吸附剂
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诱导力
静电力 氢键力 色散力
电荷 转移
络合物 形成
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❖组分分子中的极性官能团与固定相表面上活 性作用点（如硅羟基）之间的相互作用强弱 决定了它的竞争能力，即保留程度的大小， 这种极性相互作用的强弱归纳如下表所示。
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硅胶上各类化合物或官能团吸附强弱的分类