动物病毒学

《动物病毒学》实验课

讲稿

任课教师：***

授课对象：2002级动物医学专业1-4班

授课时间：2004.09-2005.01

目录

实验一鸡胚接种 (1)

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养 (6)

实验三原代细胞培养 (9)

实验四病毒TCID50的测定 (11)

实验五中和试验 (13)

实验一鸡胚接种

一、实验目的

了解鸡胚的基本结构与功能及鸡胚接种的方法，掌握常用的鸡胚接种方法。

二、鸡胚接种的作用

主要用于：

①分离病毒，并根据病变初步鉴定病毒

②培养病毒，制造抗原和疫苗

③测定各毒株之间的抗原关系（用鸡胚作中和试验和交叉保护实验）

④测定病毒毒力

三、材料

1、鸡胚10日龄

2、病毒鸡传染性支气管炎病毒（IBV）

3、照蛋灯

4、打孔器

5、石蜡

6、注射器

7、蛋座

8、酒精棉球、碘酊棉球

四、鸡胚用于病毒培养的优缺点

（一）优点

1、组织分化程度低

2、可选择不同的日龄和接种途径

3、病毒易于增殖

4、感染病毒的组织和液体中含大量病毒

5、容易采集和处理

6、来源充足

7、设备和操作简便易行

（二）缺点

1、胚内可能污染细菌和病毒

沙门氏菌、禽白血病病毒、新城疫、禽脑脊髓炎病毒

2、母源抗体

3、许多病毒在鸡胚中增殖缺乏特异性的感染指针

五、鸡胚的结构与功能

1、卵壳上有细孔，进行气体交换

2、壳膜使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。

3、气室呼吸和调节压力

4、绒毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能，氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。

5、尿囊腔胚胎的排泄器官，内含有尿囊液，初为透明液体，是单纯生理盐溶液，以后尿囊液中

尿酸盐迅速增加，胚胎发育到第12-13天后，尿囊液开始变得混浊。

6、羊膜与羊膜腔其中盛有羊水，胎体浸泡于其中

7、卵黄在胚胎发育早期供给鸡胚营养。

8、卵白在胚胎发育晚期供给鸡胚营养。

六、受精卵的选择

1、最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响。

2、受精卵的壳最好是白色的，以便于检卵。

3、受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。

七、鸡胚的孵育

1、孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃

2、相对湿度：50%-60%

3、必须保证具有充分的新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后

4、从孵育后第3天开始，每天翻卵一次

八、检卵

自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。

孵育4-5日后即可于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。

未受精卵：只见模糊的卵黄卵影，不见血管和鸡胚痕迹

活胚：具有清晰的血管和鸡胚暗影，较大鸡胚还可见到胚动，但孵育14、15天以后胎动不明显，甚至无胎动。

死胚：血管昏暗模糊，没有胚动

九、接种前处理

1、用检卵灯再次检查鸡胚活力，用铅笔画出气室和胚胎的位置，并在将要接种的部位做好记号。

2、对鸡胚进行消毒。

十、接种途径

1、绒毛尿囊膜接种

2、尿囊腔接种

3、卵黄囊接种

4、静脉接种蓝舌病毒

5、羊膜腔接种正粘病毒和副粘病毒

6、脑内接种狂犬病毒

7、眼球接种

（一）卵黄囊接种法

主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。

方法一：

1）取6-8日龄鸡胚，用检卵灯照视画出气室和胚胎位置后，垂直放置在卵座上(大头向上)

2）用碘酊和酒精消毒气室端

3）用钢锥在气室中央锥一小孔

4）用注射器吸取病毒悬液，沿气室端所穿小孔垂直刺入3cm，注入0.1-0.5ml病毒液。

5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，每天翻卵1-2次，24h内死亡者废弃。

方法二：

1）2）同一

3）将卵横放在卵座上，胚胎位置向下。在卵长径的1/2处用碘酊和酒精消毒。

4）用钢锥打一小孔，将针头刺入约1.5cm，注入病毒液0.1-0.5ml

5）用熔化的石蜡封孔，置孵卵箱内继续孵育，24h内死亡者废弃

（二）绒毛尿囊膜接种

主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。

方法一：

1）取10-12日龄鸡胚，画出气室部，消毒

2）在气室端的卵壳上开一1.5×1.5cm的口

3）用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜

4）滴入接种物

5）用胶布或透明胶纸封闭切口

方法二：（要做人工气室）

1、在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。

2、用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。

3、在气室端中央钻一个小孔。

4、用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破处。

5、用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形

成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。

6、用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。

7、用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用

石蜡密封。

8、胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。

（三）尿囊腔接种

主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病毒、新城疫病毒的分离和增殖。

1、选用10-11日龄的鸡胚，画出气室和胚位

2、在气室接近胚体处用碘酊和酒精进行消毒

3、用钢锥穿一小孔

4、将注射器沿小孔插入0.5-1.0cm，注入0.1-0.2ml接种物

5、用石蜡封口，并置孵卵箱中孵育，每天翻卵并检卵一次，24h内死亡者废弃。

十一、传染性支气管炎病毒（IBV）接种鸡胚后对鸡胚的影响

IBV一般采用尿囊腔接种

最初几代鸡胚极少发生变化，随着传代次数的增加，鸡胚死亡率增高，鸡胚病变明显，至第10代时，可使80%鸡胚死亡。

病变：

1、鸡胚停止生长，卷曲呈球形，即所谓卷曲胚。

2、羊膜水肿增厚，紧贴鸡胚，尿囊液增量，卵黄囊皱缩，肾中尿酸盐沉着，鸡胚发生肝坏死、肺炎和肾炎。

3、病毒经尿囊腔接种后36h，最高滴度可达107个鸡胚致量。

十二、收毒

收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上，冻死胚胎，防止出血。

根据接种途径的不同，收获相应的材料

1、绒毛尿囊膜接种收获接种部位绒毛尿囊膜

2、尿囊腔接种收获尿囊液（5-8ml）

3、卵黄囊接种收获卵黄囊或胚体

4、羊膜腔接种收获羊水（0.5-1ml）