沙门氏菌检验详细流程ppt
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选择性增菌与分离
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL, 转种 于10 mL TTB 内, 于42 ±1 ℃培养18 ～24 h。 同时, 另取1 mL, 转种于10 mL SC内, 于36 ±1 ℃培养18 ～24 h。
分别用接种环取增菌液1环, 划线接种于一个BS琼 脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或显 色培养基平板）。于36 ±1 ℃分别培养18 ～24 h (XLD琼脂平板、HE琼脂平板、显色培养基平板) 或40 h～48 h (BS琼脂平板)，观察各个平板上生 长的菌落。
-
血清学鉴定时的注意要点：
做血清凝集时，同时应用生理盐水做对照。 O血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高(如
2.5%-3%)的斜面上，再做凝集。 如果由于Vi抗原的存在而阻止了O抗原的凝集反应
时，应挑取菌苔于1mL生理盐水中做成菌悬液。煮 沸后再检查。(常见于伤寒沙门菌)。 有极少数的二相沙门菌会同时出现2相H抗原，也 有一些沙门氏菌在培养过程中H抗原会出现第1项 和第2项之间的转变，所以血清诱导实验要用新鲜 的培养物进行诱导。
被分成2500多个血清型。
Vi抗原 O抗原 H抗原
-
沙门氏菌命名与书写方式
目前的命名方法规定：
肠道沙门菌肠道亚种（亚种Ⅰ）给予专用名，并采用 标本分离地址的地名。菌名的第一个字母需大写，且 亚种Ⅰ的所用菌名不能用斜体。例如：肠道沙门菌鼠 伤寒血清型应书写为Salmonella enterica subsp.enterica serotype Typhimurium，但在实际工作中，可简写为S. Typhimurium。
－
＋
＋
＋
－
＋
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ注：＋表示阳性；＋表示阴性。
判定结果
甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清 学鉴定结果) 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群 生化特性) 沙门氏菌个别变体(要求血清学 鉴定结果)
反应序号2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结 果均为阳性；
反应序号3：补做ONPG，ONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门 菌；但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。
GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
-
沙门菌概况
沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流 行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon 氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙 门菌属。
沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它 是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴 性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌 有2500多个血清型和变种。我国发现的有 250多个血清型。
-
沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果
斜面
三糖铁琼脂
底层
产气
硫化氢
赖氨酸脱羧酶试验培养基
初步判断
-
+
＋（－）
＋（－）
＋
可疑沙门氏菌属
-
+
＋（－）
＋（－）
－
可疑沙门氏菌属
+
+
＋（－）
＋（－）
＋
可疑沙门氏菌属
+
+
＋/－
＋/－
－
注：＋阳性，－阴性；＋（－）多数阳性, 少数阴性；＋/－阳性或阴性。
非沙门氏菌
-
穿刺TSI方法
-
接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养 基的同时，可直接接种蛋白胨水 (供做靛基 质试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼 脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h, 必要时可延长至48 h。
将已挑菌落的平板储存于2 ℃～5 ℃或室温 至少保留24 h，以备必要时复查。
典型菌落--BS
国产BS
进口BS
菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色, 菌落周围培养基可呈黑色或
棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落- , 周围培养基不变。
典型菌落--HE
国产HE
进口HE
蓝绿色或蓝色, 多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色, 中心黑色或几乎全黑色。
-
典型菌落--XLD
进口XLD
-
谢谢大家!
-
该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排 除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。
-
TSI的反应
赖氨酸脱羧酶试验
-
沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
反应 序号
A1
硫化氢 （H2S）
＋
靛基 质
－
pH7.2尿 素
－
氰化钾 （KCN）
－
A2
＋
＋
－
－
A3
－
－
－
－
注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。
赖氨酸脱 羧酶 ＋
＋
＋/－
反应序号A1：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨 酸脱羧酶3项中有1项异常, 按下表可判定为沙门氏菌。 如有2项异常 为非沙门氏菌。
-
沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
pH7.2 尿素
－
氰化钾 (KCN) －
赖氨酸脱羧 酶
－
菌均质杯中，以8 000 r/min～10 000 r/min均 质1 min～2 min，或置于盛有225 mL BPW的 无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态， 不需要均质，振荡混匀。 如使用均质袋，可直接 进行培养。于36 ℃±1 ℃ 培养8 h～18h。
-
无菌均质袋
-
沙门菌的分类
根据生化反应不同，分为2个种： 肠道沙门菌（Samonella enterica） ：
Ⅰ 肠道亚种（subsp. enterica ）
Ⅱ 萨拉姆亚种 （subsp. salamae ） Ⅲ 亚利桑那亚种（subsp. arizonae ） Ⅳ 豪顿亚种（subsp. houtenae ） Ⅵ 因迪卡亚种 （subsp. indica ）
邦戈尔沙门菌（Samonella bongori） Ⅴ
-
沙门菌种和亚种的鉴别
肠道沙门菌
项目
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
卫矛醇
＋
＋
－
－
山梨醇
＋
＋
＋
＋
水杨苷
－
－
－
＋
ONPG
－
－
＋
－
丙二酸盐
－
＋
＋
－
KCN
－
－
－
＋
注：+为阳性 - 为阴性
-
邦戈尔沙门菌
Ⅵ
Ⅴ
－
＋
－
＋
－
－
－
＋
－
－
－
＋
沙门氏菌的血清分型
迄今为止沙门氏菌有
57个O抗原 116个H抗原 Vi抗原
-
生化试验
自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型 或可疑菌落，分别接种三糖铁（TSI）琼脂、 赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板； 取菌落一部分于斜面划线后穿刺底层。
接种针在接种TSI后不要灭菌，直接接种赖 氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板， 于36 ℃培养18 ～24 h，必要时可延长至 48 h。
国产XLD
菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心， 或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色- 菌落，带或不带黑色中心
初筛微生 物
沙门氏菌
柠檬酸杆 菌属
变形杆菌
菌落颜色
紫色(直径约 1mm)
蓝色(直径约 1mm)
无色或被抑 制
特异性 灵敏度
89％ 100%
---
---
(铜绿假单胞菌也呈紫红色， 可以通过前增菌排除。所以推 荐在检测中的前增菌用TTB。 粉红色、深红色、干燥菌落、 边缘锯齿状等 均非沙门氏菌菌 落。）
-
沙门氏菌属各生化群的鉴别
必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定
项目
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
卫矛醇 ＋
＋
－
－
＋
－
山梨醇 ＋
＋
＋
＋
＋
－
水杨苷 －
－
－
＋
－
－
ONPG －
－
＋
－
＋
－
丙二酸 －
＋
＋
－
－
－
盐
KCN
－
－
－
＋
＋
－
注：＋表示阳性; －表示阴性。
-
沙门菌的其他鉴定
API 20E VITEK32 GNI＋ 卡片
-
其他沙门氏菌均不给专用名，只在亚种数字名后直接 书写抗原式，比如S.Ⅴ 66:z35:-
新的血清型名称的批准必须有巴斯德研究所、德国汉 堡卫生研究所及美国CDC 3个实验室的一致同意。
-
沙门氏菌检验程序
-
前增菌
目的：修复损伤的细菌细胞； 方法：25 g（mL）样品＋225 mL BPW的无
沙门菌的血清学鉴定
培养基：一般使用新鲜营养琼脂斜面作纯培养，取 斜面上部培养物作O抗原玻片凝集试验，下部凝结水 里的培养物作H抗原。
H抗原的位相诱导试验 制备半固体琼脂，融化完全分装10ml/管，121 ℃灭菌15分钟，冷至50 ℃备用。 取诱导用血清1滴加到小平皿中，倾入冷至50 ℃ 的10ml半固体琼脂，轻轻摇匀，凝固。 将培养物接种到平板的中央，放入湿盒中培养过 夜。取边缘的菌进行H抗原的检测。
为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用 两种以上选择性分离培养基。
-
分离培养基回收率测定（%）
进口-SS 进口-SS 国产-SS 进口-HE 国产-HE 进口-XLD 国产-XLD 进口-BS 国产-BS CHRO显色 国产-DHL 国产-WS TSA（对照）
-
65.3 81.0 52.0 83.2 80.0 83.0 86.2 106.6 77.7 68.4 98.4 71.6 100.0
选择性增菌与分离
轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL, 转种 于10 mL TTB 内, 于42 ±1 ℃培养18 ～24 h。 同时, 另取1 mL, 转种于10 mL SC内, 于36 ±1 ℃培养18 ～24 h。
分别用接种环取增菌液1环, 划线接种于一个BS琼 脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或显 色培养基平板）。于36 ±1 ℃分别培养18 ～24 h (XLD琼脂平板、HE琼脂平板、显色培养基平板) 或40 h～48 h (BS琼脂平板)，观察各个平板上生 长的菌落。
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血清学鉴定时的注意要点：
做血清凝集时，同时应用生理盐水做对照。 O血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高(如
2.5%-3%)的斜面上，再做凝集。 如果由于Vi抗原的存在而阻止了O抗原的凝集反应
时，应挑取菌苔于1mL生理盐水中做成菌悬液。煮 沸后再检查。(常见于伤寒沙门菌)。 有极少数的二相沙门菌会同时出现2相H抗原，也 有一些沙门氏菌在培养过程中H抗原会出现第1项 和第2项之间的转变，所以血清诱导实验要用新鲜 的培养物进行诱导。
被分成2500多个血清型。
Vi抗原 O抗原 H抗原
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沙门氏菌命名与书写方式
目前的命名方法规定：
肠道沙门菌肠道亚种（亚种Ⅰ）给予专用名，并采用 标本分离地址的地名。菌名的第一个字母需大写，且 亚种Ⅰ的所用菌名不能用斜体。例如：肠道沙门菌鼠 伤寒血清型应书写为Salmonella enterica subsp.enterica serotype Typhimurium，但在实际工作中，可简写为S. Typhimurium。
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ注：＋表示阳性；＋表示阴性。
判定结果
甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清 学鉴定结果) 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群 生化特性) 沙门氏菌个别变体(要求血清学 鉴定结果)
反应序号2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结 果均为阳性；
反应序号3：补做ONPG，ONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门 菌；但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。
GB 4789.4-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
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沙门菌概况
沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流 行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon 氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙 门菌属。
沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它 是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴 性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌 有2500多个血清型和变种。我国发现的有 250多个血清型。
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沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果
斜面
三糖铁琼脂
底层
产气
硫化氢
赖氨酸脱羧酶试验培养基
初步判断
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+
＋（－）
＋（－）
＋
可疑沙门氏菌属
-
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＋（－）
＋（－）
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可疑沙门氏菌属
+
+
＋（－）
＋（－）
＋
可疑沙门氏菌属
+
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＋/－
＋/－
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注：＋阳性，－阴性；＋（－）多数阳性, 少数阴性；＋/－阳性或阴性。
非沙门氏菌
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穿刺TSI方法
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接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养 基的同时，可直接接种蛋白胨水 (供做靛基 质试验)、尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼 脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h, 必要时可延长至48 h。
将已挑菌落的平板储存于2 ℃～5 ℃或室温 至少保留24 h，以备必要时复查。
典型菌落--BS
国产BS
进口BS
菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色, 菌落周围培养基可呈黑色或
棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落- , 周围培养基不变。
典型菌落--HE
国产HE
进口HE
蓝绿色或蓝色, 多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色, 中心黑色或几乎全黑色。
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典型菌落--XLD
进口XLD
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谢谢大家!
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该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排 除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。
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TSI的反应
赖氨酸脱羧酶试验
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沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
反应 序号
A1
硫化氢 （H2S）
＋
靛基 质
－
pH7.2尿 素
－
氰化钾 （KCN）
－
A2
＋
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A3
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注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。
赖氨酸脱 羧酶 ＋
＋
＋/－
反应序号A1：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨 酸脱羧酶3项中有1项异常, 按下表可判定为沙门氏菌。 如有2项异常 为非沙门氏菌。
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沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
pH7.2 尿素
－
氰化钾 (KCN) －
赖氨酸脱羧 酶
－
菌均质杯中，以8 000 r/min～10 000 r/min均 质1 min～2 min，或置于盛有225 mL BPW的 无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态， 不需要均质，振荡混匀。 如使用均质袋，可直接 进行培养。于36 ℃±1 ℃ 培养8 h～18h。
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无菌均质袋
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沙门菌的分类
根据生化反应不同，分为2个种： 肠道沙门菌（Samonella enterica） ：
Ⅰ 肠道亚种（subsp. enterica ）
Ⅱ 萨拉姆亚种 （subsp. salamae ） Ⅲ 亚利桑那亚种（subsp. arizonae ） Ⅳ 豪顿亚种（subsp. houtenae ） Ⅵ 因迪卡亚种 （subsp. indica ）
邦戈尔沙门菌（Samonella bongori） Ⅴ
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沙门菌种和亚种的鉴别
肠道沙门菌
项目
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
卫矛醇
＋
＋
－
－
山梨醇
＋
＋
＋
＋
水杨苷
－
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ONPG
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丙二酸盐
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KCN
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注：+为阳性 - 为阴性
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邦戈尔沙门菌
Ⅵ
Ⅴ
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沙门氏菌的血清分型
迄今为止沙门氏菌有
57个O抗原 116个H抗原 Vi抗原
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生化试验
自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型 或可疑菌落，分别接种三糖铁（TSI）琼脂、 赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板； 取菌落一部分于斜面划线后穿刺底层。
接种针在接种TSI后不要灭菌，直接接种赖 氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板， 于36 ℃培养18 ～24 h，必要时可延长至 48 h。
国产XLD
菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心， 或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色- 菌落，带或不带黑色中心
初筛微生 物
沙门氏菌
柠檬酸杆 菌属
变形杆菌
菌落颜色
紫色(直径约 1mm)
蓝色(直径约 1mm)
无色或被抑 制
特异性 灵敏度
89％ 100%
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(铜绿假单胞菌也呈紫红色， 可以通过前增菌排除。所以推 荐在检测中的前增菌用TTB。 粉红色、深红色、干燥菌落、 边缘锯齿状等 均非沙门氏菌菌 落。）
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沙门氏菌属各生化群的鉴别
必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定
项目
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
卫矛醇 ＋
＋
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山梨醇 ＋
＋
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水杨苷 －
－
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ONPG －
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丙二酸 －
＋
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盐
KCN
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注：＋表示阳性; －表示阴性。
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沙门菌的其他鉴定
API 20E VITEK32 GNI＋ 卡片
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其他沙门氏菌均不给专用名，只在亚种数字名后直接 书写抗原式，比如S.Ⅴ 66:z35:-
新的血清型名称的批准必须有巴斯德研究所、德国汉 堡卫生研究所及美国CDC 3个实验室的一致同意。
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沙门氏菌检验程序
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前增菌
目的：修复损伤的细菌细胞； 方法：25 g（mL）样品＋225 mL BPW的无
沙门菌的血清学鉴定
培养基：一般使用新鲜营养琼脂斜面作纯培养，取 斜面上部培养物作O抗原玻片凝集试验，下部凝结水 里的培养物作H抗原。
H抗原的位相诱导试验 制备半固体琼脂，融化完全分装10ml/管，121 ℃灭菌15分钟，冷至50 ℃备用。 取诱导用血清1滴加到小平皿中，倾入冷至50 ℃ 的10ml半固体琼脂，轻轻摇匀，凝固。 将培养物接种到平板的中央，放入湿盒中培养过 夜。取边缘的菌进行H抗原的检测。
为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用 两种以上选择性分离培养基。
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分离培养基回收率测定（%）
进口-SS 进口-SS 国产-SS 进口-HE 国产-HE 进口-XLD 国产-XLD 进口-BS 国产-BS CHRO显色 国产-DHL 国产-WS TSA（对照）
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65.3 81.0 52.0 83.2 80.0 83.0 86.2 106.6 77.7 68.4 98.4 71.6 100.0