原位杂交的基本方法

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原位杂交组织化学技术的基本方法

原位杂交组织化学技术的基本方法一、核酸分子杂交技术1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。

自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。

按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。

固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybri dization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（ N orthern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。

液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。

二、原位杂交组织化学技术的由来及发展原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。

但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。

菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。

Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。

它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。

1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。

单细胞荧光原位杂交技术基础分析

单细胞荧光原位杂交技术基础分析单细胞荧光原位杂交技术（single-cell fluorescent in situ hybridization，scFISH）是研究个体细胞基因组结构和功能的重要手段。

它通过特定的荧光标记探针与细胞内核酸靶点的结合来实现对单个细胞的基因表达模式分析。

本文将对单细胞荧光原位杂交技术的基本原理、方法以及在研究领域的应用进行详细介绍。

一、基本原理单细胞荧光原位杂交技术利用高度特异的核酸探针与细胞内特定的目标序列结合，通过荧光信号的检测来观察细胞的基因表达模式。

其原理主要包括以下步骤：1. 探针设计：根据所研究的基因或序列，设计特异性的DNA或RNA探针。

探针通常标记有荧光染料或荧光素，以便在显微镜下直接观察。

2. 细胞固定：将待研究的细胞进行固定，以保持其形态结构不变。

固定方法可以使用化学物质如乙醇或乙酸乙酯，或者采用热处理方法。

固定后，细胞的DNA或RNA会在某种程度上变性，使得探针能够更好地与其结合。

3. 探针杂交：将设计好的探针与固定的细胞一起进行孵育反应，使其在一定的温度和盐度条件下与目标序列发生特异性结合。

探针可以是产生互补序列的DNA或RNA，以便与目标序列形成特异性的双链结构。

4. 检测信号：利用荧光显微镜或其他适当的检测设备观察探针与目标序列的结合情况。

荧光标记的探针在特定波长下会发出荧光信号，通过检测信号的强度和位置，可以确定基因的表达量和位置。

二、方法步骤单细胞荧光原位杂交技术的实施通常包括以下几个步骤：1. 细胞样品处理：获取待研究的细胞样品，并进行适当的处理，如培养、分离、固定等。

处理过程中需注意细胞的完整性和特定的实验条件。

2. 探针设计和制备：根据研究目的选择合适的目标序列和探针设计方法。

针对目标基因或序列，用合成的核酸片段进行探针标记或直接购买商业化的标记好的探针。

3. 探针反应：将待研究的细胞样品与探针进行孵育反应。

反应条件应根据探针设计和实验需求进行优化，包括反应温度、时间和缓冲液的选择等。

原位杂交技术

原位杂交技术原位杂交技术是一种基因分析技术，可以用来研究细胞内基因的表达模式和基因组的结构。

本文将介绍原位杂交技术的基本原理、应用领域以及未来发展方向。

原位杂交技术最早是在20世纪70年代发展起来的，主要用于研究DNA在细胞中的位置和分布情况。

其基本原理是利用亲和性标记的探针与目标DNA序列特异性结合，通过显色或荧光等方法来检测标记物的位置。

原位杂交技术的具体步骤包括控制组织或细胞的形态、固定样本、渗透处理、杂交、洗脱、显色和观察等。

其中最关键的步骤是杂交反应，需要合理设计探针的序列和标记方法，并进行适当的条件优化。

原位杂交技术广泛应用于生物医学领域，可以用于寻找新的基因、研究基因的表达调控机制、探索基因组的结构与功能等。

例如，科学家可以用这种技术来研究染色体异常、肿瘤基因的异常表达、发育过程中的基因调控等。

此外，原位杂交技术在遗传学、生物学、植物学、动物学和微生物学等领域也有广泛的应用。

在遗传学中，可以用原位杂交技术检测并分离具有特定基因型的个体；在植物学中，可以研究植物的组织分化和发育过程；在动物学中，可以研究胚胎发育和器官再生等。

虽然原位杂交技术在基因研究中起到了重要作用，但仍存在一些局限性和挑战。

首先，该技术的灵敏度和特异性受到探针选择、探针标记和杂交条件等多个因素的影响。

其次，原位杂交技术在细胞外不易实施，因为固定和渗透处理可能会对细胞和组织结构产生破坏。

未来，随着生物技术的不断发展，原位杂交技术也将得到进一步改进和完善。

例如，可以利用新型的标记物和探针来提高技术的敏感度和特异性，同时也可以开发新的杂交方法来降低对样本的破坏。

此外，结合其他高通量分析技术，如转录组学和蛋白质组学，可以更全面地揭示基因表达和调控的网络。

总之，原位杂交技术是一种重要的基因分析技术，可以揭示细胞内基因的表达模式和基因组的结构。

在今后的研究中，我们有理由相信原位杂交技术将发挥更大的作用，并帮助科学家们更好地理解生命的奥秘。

免疫荧光原位杂交技术FISH

阴性：除以上扩增的情况
EGFR基因扩增检测试剂盒（FISH）
无荧光信号
没有用酶进行处理, 用了不恰当的滤光镜
镜下观察可能出现的问题没有加入探针(或探针没有经过适当变性),杂交条件不够恰当探针不合格(或探针没有适当保存),荧光显微镜没有适当地起作用
荧光信号微弱
杂交条件不够充分
探针过分稀释造成浓度太低, 没有适当变性,探针和杂交液没有充分混合,洗涤条件不够恰当(或洗涤太过), 滤光镜不对
37ºC 蛋白酶k
5-30min
洗片
DAPI染色
阅片
脱蜡
石蜡切片浸于二甲苯中3次,每次10分钟浸入100%的乙醇中5分钟.然后梯度复水
各2分钟浸入去离子水3分钟
(脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交率降低,荧光背景高等)
预处理
I. 100 ºC沸水处理组织切片30分钟
II. 100ug/mL的蛋白酶K溶液,37 ºC孵育5-30 分钟
有背景荧光荧光信号计数问题
杂交后洗涤不够充分洗涤缓冲液盐的浓度过高洗涤时温度过低
选择分散较好不重叠的细胞计数
IGH/C
HER-2扩增
C-MYC
CBFB基因断裂重组检测试剂盒
探针：GLP CBFB CBFB基因（Core binding factor β，CBFB）：核心结合因子 ,位于 16号染色体上。
III. 2*SSC漂洗,梯度脱水各2分钟,干燥玻片.
• 探针变性 • 玻片变性
变性
83 ºC
5min
DAPI复染
杂交
42ºC 湿盒
孵育过夜
洗涤
• 50%甲酰胺 • 2XSSC • 0.1%NP-40 • 75%乙醇

荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应用

荧光原位杂交技术（FISH）的基本原理及应⽤我接触“FISH”也是刚刚两年多的时间，作为⼀个“初学者”刚开始接触“FISH”可能跟⼤多数⼈⼀样满脑⼦的疑惑：“FISH”是做什么的?有什么临床作⽤呢?那些红红绿绿的点都是些什么意思?……今天让我们慢慢的去揭开FISH的不太神秘的⾯纱。

1.FISH的前世今⽣在FISH技术问世之前，基于20世纪60年代，放射性核素探针的原位杂交⽅法，检测间期染⾊体和分裂期染⾊体上特定DNA和RNA序列的⽅法，该⽅法存在操做⽐较⿇烦、分辨率有限、探针不稳定、放射性同位素的危害较⾼等问题，故⽬前弃之不⽤。

20世纪80年代⽤⾮放射性半抗原如⽣物素进⾏核酸标记的技术逐渐开展后，探针也开始使⽤这种⾮放射性标记⽅法。

随后FISH技术逐渐开展起来，1986年以后该技术被应⽤于分析细胞分裂期染⾊体铺⽚的DNA序列。

相对于放射性来说，FISH具有稳定性好、操作安全、结果迅速、空间定位准确、⼲扰信号少、⼀张玻⽚可以标记多种颜⾊探针等优点。

这些优点逐渐使FISH成为⼀种研究分⼦细胞遗传学很好的⽅法。

FISH即染⾊体荧光原位杂交(Flourescence in situ hybridization,FISH)是通过荧光素标记的DNA探针与样本细胞核内的DNA靶序列杂交，从⽽获得细胞核内染⾊体或基因状态的信息。

FISH是将传统的细胞遗传学同DNA技术相结合，开创了⼀门新的学科——分⼦细胞遗传学。

（如下图所⽰)2.FISH信号解读-红红绿绿是什么⽬前临床上⽤于FISH检测的探针的荧光素⼤都是绿⾊的和橙红⾊标记，可⼤致分为：染⾊体计数(着丝粒)探针(centromere-enumerationprobes，CEP)，位点特异性识别探针(locus-specific identifier probes，LSI)，染⾊体涂染(paint，WCP)探针。

其中CEP和LSI探针中的计数探针、融合探针及分离重排探针，在⾎液病诊断与预后分型中最为常⽤。

荧光原位杂交法 pcr-荧光对比

荧光原位杂交法 pcr-荧光对比荧光原位杂交法（FISH）和PCR-荧光对比（PCR-FLP）都是分子生物学中常用的技术，可以用于基因定位、染色体结构和功能等方面的研究。

本文将分别介绍这两种技术的基本原理、应用场景和优缺点。

一、荧光原位杂交法1.基本原理荧光原位杂交法是一种基于DNA序列互补碱基配对原理的技术，利用荧光探针对染色体上的特定区域进行标记，以便于观察和分析。

该技术主要包括以下几个步骤：（1）制备探针：将已知序列的DNA片段与荧光标记分子连接，生成荧光标记的DNA探针。

（2）加热解离：将待检样品中的DNA加热，使其解离成两条单链DNA。

（4）荧光显色：利用显微镜观察染色体上的荧光标记，并确定标记位置及数目。

2.应用场景荧光原位杂交法可用于以下方面的研究：（1）核型分析：检测染色体数目、大小和形态等信息。

（2）染色体重排：观察染色体间的换位、倒位等结构改变。

（3）基因定位：确定特定基因在染色体上的位置。

（4）肿瘤诊断：检测肿瘤细胞染色体的数目和结构变化。

3.优缺点（1）高灵敏度：能够检测到细胞核中的单个分子。

（2）高特异性：探针与目标序列可以实现完全互补。

（3）数据可视化：能够直观地呈现染色体结构及荧光信号大小。

而其缺点主要包括：（1）长时间实验：需要多个步骤和时间，且荧光信号非常容易被淬灭。

（2）需要DNA标记：需要荧光标记作为探针，费用较高。

二、PCR-荧光对比PCR-荧光对比（PCR-FLP）是一种应用荧光标记测量PCR产物数量的技术，能够在短时间内准确、可靠地检测和测量DNA的含量和变异。

具体操作过程如下：（1）样品制备：将待测DNA标记荧光标记，与另一非标记探针PCR反应。

（2）荧光PCR扩增：通过PCR反应增生DNA分子。

（3）荧光观察：利用荧光标记观察PCR产物。

（1）定量PCR：准确检测PCR反应中模板DNA的数目。

（2）基因表达：测量基因在不同实验条件下的表达水平。

（3）点突变检测：定性判断DNA中的单个碱基是否发生变异。

细胞各种染色方法

细胞各种染色方法细胞染色方法是一种用于研究细胞结构和功能的重要技术。

通过对细胞进行染色，可以使细胞成分和结构可见，便于观察和研究。

下面将介绍几种常用的细胞染色方法。

1.基本染色方法-干燥染色法干燥染色法是最常见的染色方法之一，用于观察细胞的形态和结构。

在细胞表面涂上染色剂（如吉姆萨、范斯丁染料等），然后用胶片或显微镜进行观察。

这种方法方便快捷，适用于常规的细胞观察。

-神经元染色法神经元染色法主要用于研究神经系统的结构和功能。

常见的神经元染色方法包括尼氏染色法、戈登染色法和格尔染色法等。

这些方法可以染色神经元的胞体、突触和轴突等结构，以及神经元之间的连接方式。

2.核酸染色方法-核酸荧光染色法核酸荧光染色法是一种用于检测细胞核酸的方法。

常见的核酸染色剂包括达尔林紫、伊曼纽尔蓝和乳胶蓝等。

这些荧光染料可以与DNA或RNA 结合，生成荧光信号，便于观察和分析。

-原位杂交法原位杂交法是一种利用互补的单链DNA或RNA探针与目标细胞中的互补序列发生杂交反应的方法。

这种方法可以检测特定的基因表达情况或检测一些病毒的感染情况。

常见的原位杂交方法包括原位PCR、荧光原位杂交和非放射性原位杂交等。

3.蛋白质染色方法-共聚焦显微镜染色法共聚焦显微镜染色法是一种利用荧光染料标记特定蛋白质的方法。

常见的荧光染料包括荧光素、乳酸钙蓝和荧光蛋白等。

这种方法可以使用不同的荧光染料标记不同的蛋白质，通过共聚焦显微镜观察细胞中的蛋白质分布和相互作用。

-银染法银染法是一种用于检测蛋白质的方法，特别适用于低表达量的蛋白质。

该方法通过将目标蛋白质与银离子结合，形成黑色或棕色的颗粒，便于观察和分析。

银染法常用于检测蛋白质在凝胶电泳中的分子量和含量。

4.细胞器染色方法-非特异性染色法非特异性染色法是一种用于检测细胞器的方法，常用的非特异性染色剂包括宙斯金、吉姆萨和荧光素等。

这些染料可以与细胞器特有的成分结合，使其在显微镜下可见。

-特异性染色法特异性染色法是一种用于检测特定细胞器的方法，常见的特异性染色剂包括桡胞蛋白、核蛋白和线粒体染料等。

原位杂交技术

严格度（stringency）决定探针是否与含不相配碱基的核酸序列结合的条件称为严格度
高严格度条件下低严格度条件下
碱基完全互补的双链可形成杂交体碱基对不完全互补的双链也能形成杂交体
二、杂交体的探测
使标记的杂交体在光镜或电镜下可见（一）放射自显影方法（二）免疫细胞化学方
（一）放射自显影方法用同位素标记探针来显示杂交反应的方法
去除或抑制RNA酶方法：
去除或抑制RNA酶的方法有两类
物理方法：对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器具作高温烘烤（180-200℃干烤4-6小时）对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒
化学方法：焦碳酸二乙酯( DEPC ) 作用机制是通过与组氨酸结合而使蛋白质变性
组织样品制备
(二) 取材 (三) 固定
胶体金联结的抗小鼠抗体
电镜非放射性原位杂交：地高辛标记探针－间接胶体金检测
第二节原位杂交方法
一、探针二、组织样品制备三、原位杂交四、杂交体的探测五、基本实验过程六、一些关键问题
一、探针
（一）探针的选择（二）探针标记物的选择
（一）探针的选择
cDNA和RNA ：适宜于检测mRNA分子
பைடு நூலகம்
（六）冷冻切片冷冻切片保存靶核酸较多较易获得杂交信号
三、原位杂交（一）杂交前处理
1.灭活内源性酶在用酶作为报告分子时
（过氧化物酶碱性磷酸酶）
2.RNA酶处理
3.盐酸和乙酸酐处理提高杂交效率并降低背景
4. 通透处理消化去除细胞表面和内部特别是靶核
酸周围的蛋白质，增加探针等反应分子对靶核酸分子的接触机会
DNA —— 可以是中期染色体上的或是间期细胞核内的，也可以是线粒体DNA或病毒DNA

荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用_理论说明

荧光原位杂交技术(fish)的基本原理和应用理论说明1. 引言1.1 概述荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ Hybridization，简称FISH）是一种广泛应用于生物学研究的重要技术。

它通过在细胞或组织水平上定位和检测特定DNA或RNA序列的分布情况，可以提供关于基因组结构、功能和表达的有价值信息。

该技术最早于20世纪80年代被开发出来，并且经过不断改进与扩展，如今已成为分子生物学研究中不可或缺的工具之一。

1.2 文章结构本文将首先介绍荧光原位杂交技术的基本原理，包括DNA探针的选择与设计、杂交反应条件的优化以及检测与可视化方法。

然后，我们将深入探讨荧光原位杂交技术在生物医学研究领域、植物遗传研究领域和动物进化研究领域的应用实例。

接下来，我们将评述荧光原位杂交技术的优势与局限性，包括其高灵敏度、高分辨率等优势以及对样本处理要求高、无法确定基因功能等局限性。

最后，我们将给出结论并展望荧光原位杂交技术的未来发展方向。

1.3 目的本文的目的是系统地介绍荧光原位杂交技术的基本原理和应用领域，以帮助读者深入了解这一重要技术。

通过阅读本文，读者将能够全面了解荧光原位杂交技术在生物学研究中的作用和意义，并对该技术的优势与局限性有所了解。

此外，本文也将探讨该技术未来可能的发展方向，为读者提供展望与思考。

2. 荧光原位杂交技术基本原理:2.1 DNA探针的选择与设计:荧光原位杂交技术（FISH）是一种利用DNA或RNA分子作为探针，通过特异性互补配对识别和定位目标序列的方法。

在进行FISH实验时，首先需要选择合适的DNA探针。

DNA探针通常由由人工合成的寡聚核苷酸（oligonucleotide）或从天然来源提取得到的全长DNA片段构建而成。

选择DNA探针时，需要考虑以下因素：首先是目标序列的特异性，即该序列在待检测样品中是否具有较高的丰度，并且只存在于感兴趣的目标区域中。

其次是探针长度和两个主要互补区域之间核苷酸序列的碱基组成比例。

原位杂交和荧光定量

原位杂交和荧光定量
原位杂交是一种将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。

基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，能过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双键分子的特点，应用带有标记的（放射性同位素、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA 的存在并定位。

荧光定量原位杂交技术则是一种分子遗传学实验技术，将直接与荧光素结合的寡聚核苷酸探针或采用间接法标记的寡聚核苷酸探针与变性后的染色体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交，经变性-退火-复性-洗涤后即可形成靶DNA 与核酸探针的杂交体，直接检测或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微镜下显影，即可对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

总的来说，原位杂交和荧光定量原位杂交都是一种在细胞或组织切片中定位特定核酸序列的技术，其中荧光定量原位杂交技术可以提供更多的定量和定性信息。

一种在g-显带的玻片上进行分子荧光原位杂交处理方法

一种在g-显带的玻片上进行分子荧光原位杂
交处理方法
分子荧光原位杂交技术（FISH）是一种重要的生物学技术，它能够检测和定位细胞核中的特定DNA序列。

在g-显带玻片上进行分子荧光原位杂交处理，可以用于研究染色体结构和基因组变异。

以下是在g-显带玻片上进行分子荧光原位杂交处理的基本步骤：
１．预处理玻片：在开始实验前，需要将玻片进行预处理，包括清洗、脱蜡、消化等步骤，以去除玻片表面的杂质和固定细胞。

２．制备探针：选择与目标DNA序列互补的DNA或RNA片段作为探针，将其标记上荧光染料或其他可检测的标记物。

３．杂交反应：将制备好的探针与玻片上的染色体进行杂交，使探针与目标DNA序列结合。

这一步需要控制杂交温度和时间，以确保探针与目标DNA的有效结合。

４．洗涤：杂交反应后，需要将未结合的探针洗涤掉，以避免背景干扰。

这一步需要严格控制洗涤条件，如洗涤液的成分、温度和时间等。

５．检测与分析：最后，使用荧光显微镜或其他检测设备对染色体的荧光信号进行检测和分析。

通过观察荧光信号的位置和强度，可以推断出染色体结构和基因组变异的情况。

总之，在g-显带玻片上进行分子荧光原位杂交处理需要严格控制实验条件和处理步骤，以确保结果的准确性和可靠性。

荧光原位杂交fish基本原理和流程

荧光原位杂交fish基本原理和流程
荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种重要的非放射性原位杂交技术，其基本原理是依据碱基互补原理，应用荧光素直接或间接标记的核酸探针，在组织切片、细胞涂片、染色体铺片上检测间期细胞核染色质数量及结构变化，进行定性和相对定量的分析检测。

FISH的实验流程主要包括以下步骤：
1. 探针标记：将荧光素直接或间接标记到探针DNA上。

2. 变性：将探针DNA和染色体或细胞核靶DNA分别变性成单链。

3. 杂交：将变性后的探针DNA与变性后的染色体或细胞核靶DNA按照碱基互补的原则进行杂交，形成可被检测的杂交双链核酸。

4. 观察记录：在荧光显微镜下观察并记录结果。

荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

gus原位杂交原理

gus原位杂交原理GUS原位杂交原理引言：GUS（β-葡萄糖苷酸酶）原位杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因的表达模式和细胞定位。

它基于互补配对的原理，通过探针与目标序列的特异性结合，实现对目标基因在细胞和组织水平上的检测，为研究基因功能和调控机制提供了重要的工具。

一、GUS原位杂交的基本原理GUS原位杂交是通过将GUS基因序列与目标基因的DNA序列进行杂交，利用互补配对的原理，使GUS基因探针与目标基因在细胞或组织中发生特异性结合。

GUS基因来自于一种细菌，能够产生β-葡萄糖苷酸酶，因此可以通过检测β-葡萄糖苷酸酶的活性来确定目标基因的表达情况。

二、GUS原位杂交的步骤1. 样品准备：收集待研究的植物材料，包括叶片、根部、花器官等。

将样品固定、切片或裂解，以便后续的探针杂交。

2. 探针制备：利用PCR技术将GUS基因片段扩增，标记酶或荧光素等，以便在细胞或组织中进行检测。

探针的序列应与目标基因的DNA序列有高度的互补性。

3. 杂交：将探针与样品中的目标基因进行杂交，使其在细胞或组织中发生特异性结合。

杂交条件包括温度、盐浓度、杂交时间等，需要根据实验要求进行优化。

4. 洗涤：将未结合的探针通过洗涤的方式去除，以减少背景干扰。

洗涤条件需要严格控制，以确保只有特异性结合的探针留在样品中。

5. 检测：通过检测β-葡萄糖苷酸酶的活性或标记物的信号，确定目标基因在细胞或组织中的表达情况。

可以使用显微镜观察细胞或组织的染色情况，或者使用荧光显微镜等进行定量分析。

三、GUS原位杂交的应用1. 基因表达模式研究：通过GUS原位杂交技术，可以确定基因在不同组织和发育阶段的表达模式，揭示基因的功能和调控机制。

2. 基因定位：利用GUS原位杂交，可以确定基因在细胞和组织中的定位，了解基因的空间表达模式，为进一步研究基因功能提供线索。

3. 转基因植物研究：GUS原位杂交是评价转基因植物中外源基因的表达情况和定位的重要方法，可以帮助筛选和鉴定转基因植物中的目标基因。

原位杂交技术

原位杂交技术一、概述（一）概念：原位杂交( in situ hybridization, ISH )是应用生物化学中核酸分子杂交( nucleic acid molecular hybridization )的原理,在组织切片、细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或RNA序列的一项技术。

是将分子杂交与组织学相结合的一项技术，也称之为杂交组织化学(hybridization histochemistry)、细胞杂交(cytologicalhybridization)或原位杂交组织化学(in situ hybridizationhistochemistry)。

（二）历史和现状可以检测组织细胞本身的或外源的DNA或RNA序列。

二、原位杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理是利用核酸分子(DNA , RNA)的碱基对形成氢键的互补性(A=T , A=U , C=G)，用一标记的核酸探针去检测与之碱基互补的靶核酸，这与免疫学中抗原－抗体的反应相似。

优点：①分子杂交的特异性强、灵敏度高，同时又有组织细胞化学染色的可见性。

②既可用新鲜组织，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究。

③所需样本量少，可用活组织细针穿刺和细胞涂片。

④应用范围广泛，可对特定的基因(如癌基因、病毒基因)DNA、mRNA的表达进行定位、定性和定量、组织细胞分布和杂交电镜的亚细胞定位研究。

三、探针(probe)是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂，探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上。

用于原位杂交的探针有不同种类，可用于不同靶核酸的探测。

（一）探针种类、来源和应用1. 双链cDNA探针2. 单链cDNA探针3. 寡核苷酸探针4. cRNA探针（二）探针标记的种类1.放射性标记2.非放射性标记最常用的为生物素(光敏生物素、补骨脂素生物素)和地高辛(digxigenin , DIG)，此外还有荧光素、酶类，如辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)等。

荧光原位杂交技术

硕士学位论文荧光原位杂交技术及其在环境领域内的应用Fluorescence in situ hybridization technology and its application in thefield of environment作者姓名：**学科、专业：环境科学与工程学号：********指导教师：***完成日期：2014/3/26XX理工大学Dalian University of Technology摘要荧光原位杂交（FISH）是现代分子生物学及基因工程中广泛应用的新技术，本文概述了FISH实验原理、实验流程以及技术问题等。

总结了一些实验关键步骤的操作要点和注意事项，并对荧光原位杂交技术在环境微生物监测方面的应用做了综述。

利用FISH 技术在环境样品上直接原位杂交，不仅可以测定不可培养微生物的形态特征及丰度，而且可原位分析它们的空间及数量分布。

并且展望了FISH技术的未来。

关键词：荧光原位杂交技术；探针；环境微生物；监测AbstractFluorescence in situ hybridization （FISH）isa new technologywhich is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. This article summarizes the experimental principle, process and technical issues of FISH.Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps, and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples, can not only measure the morphology and abundance of uncultured microorganisms, but alsoanalyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the futureof FISH.Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology; Probe; Environmental microbes; monitoring目录摘要IAbstractII1 荧光原位杂交技术简介41.1 FISH发展历史41.2 FISH原理51.3 FISH基本过程61.3.1 探针制备61.3.2 探针的标记71.3.3杂交前处理71.3.4 杂交81.3.5荧光检测与结果分析91.4 FISH技术特点101.5 常见的技术问题及解决措施101.5.1 FISH检测的假阳性101.5.2 FISH检测的假阴性112 FISH技术在环境领域的应用112.1 对硝化细菌的监测112.2 对除磷细菌的监测122.3 FISH技术在丝状微生物研究中的应用122.4 对厌氧颗粒污泥中微生物的监测132.5 对自然环境中微生物多样性的监测133 未来展望14参考文献151荧光原位杂交技术简介荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法，探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。

免疫组化与原位杂交

显色特点： ---深蓝色
---不溶于水及脂类溶剂 ---不扩散 ---永久保存 2.碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）碱性磷酸酶的作用物（底物，substrate） 1）四唑淡蓝 /5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(Nitro-BlueTetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-inodlylphosphate, NBT/BCIP）显色特点： ---紫色 ---不溶于水但溶于脂类溶剂 ---容易扩散 ---不能永久保存
二、常用于标记抗体的标记物
一）酶（enzyme） 1.辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）辣根过氧化物酶的作用物（底物，substrate） 1）二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）显色特点： --- 棕色 ---不溶于水及脂类溶剂（酒精 ethanol, 二甲苯xylene） ---不扩散 ---永久保存 2）3氨基9乙基卡巴唑（3-Amino-9-Ethylcarbazole，AEC）
5）修快：将包有组织的蜡块用刀切去多余的部分，修成一定形状的过程。 6）切片：将包有组织的蜡块安装在切片机上进行切割的过程。一般切3–6μm。 2.冰冻切片的基本步骤： 1）固定：根据所检测组织的抗原性质决定是否先进行固定及选择适当的固定剂。除非有特殊要求，否则应当先进行固定以防止抗原破坏及降解。常用的固定液是4%多聚甲醛（paraformaldehyde） 2）减少组织水分防止冰晶形成:通常采用高渗的30%蔗糖(sucrose) 溶液吸收组织中的水分。
优点：敏感性高，特异性很低。缺点：极易受内源性生物素影响，假阳性率极高。
五、免疫组织化学的特异性与敏感性

原位杂交实验

原位杂交实验1 探针的设计与合成1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82，以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用T akara胶回收试剂盒回收纯化。

引物编号引物序列长度p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bpp82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp2)目的片段克隆a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。

加入成分及比例如下：目的PCR片段 5 μlpGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μlT4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl无菌去离子水 3 μl总体积10 μlb. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。

置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。

c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal （20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。

d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。

向离心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。

目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

将菌液于4000g下离心10分钟，去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。

待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。

原位杂交技术

核酸分子杂交技术分子杂交是利用某些分子与另外的一些分子特异结合而形成结合体的过程，狭义指核酸分子杂交即具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。

根据杂交对象位置的不同可分为：固相杂交,液相杂交,原位杂交。

1、固相杂交固相杂交即先将待测单链核酸样品结合到支持物（常用有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然后与溶液中的已知序列的标记探针进行杂交。

固相杂交的特点：固相杂交后，未杂交的游离片段易除去，从而使膜上留下的杂交分子较易检测，并可有效避免靶DNA自我复性。

故固相杂交技术最为常用。

常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

2、液相杂交液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液中，探针于待测核酸在液体环境中按照碱基互补配对形成杂交分子的过程。

液相杂交是研究最早的杂交类型，但应用的普遍程度较固相杂交为低。

液相杂交的特点：无需支持物。

待测核酸分子不用固定在支持物上。

其弊端是由于杂交后过量的未杂交探针存在于溶液中，在已有杂交结合物检测水平条件下检测误差较高。

故液相杂交在过去较少应用。

近年来由于杂交检测技术的不断进步，商业检测试剂盒的开发等液相杂交技术得到了迅速发展。

常用的液相杂交类型有：吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交、复性速率液相分子杂交等。

3、原位分子杂交原位分子杂交实际上是固相杂交中的一种形式，杂交过程中待测DNA处于未经抽提的染色体之上，并在原位置上被变性成单链，与探针进行分子杂交。

原位分子杂交与其他杂交技术主要区别在于待测碱基序列位于染色体上。

其主要特点是可以准确定位目的DNA在染色体上的位置。

因此在分子遗传学研究、癌基因定位、遗传性疾病临床诊断方面具有重要而广泛应用。

下面做下具体介绍：1、菌落原位杂交●基本原理：菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。

原位杂交原理及具体操作

原位杂交原理及具体操作原位杂交实验原理与方法一、目的本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。

了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。

二、原理原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry ；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。

原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。

当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。

探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。

目前，大多数放射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA 中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。

同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。

非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。

探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。

cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA 探针。

原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。

菌落原位杂交( Colony in situ hybridization ) 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。

将NDA烘干固定于膜上与32P 标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。

组织原位杂交( Tissue in situ hybridization ) 组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。