原位杂交的基本方法

原位杂交的基本方法

一、组织的取材

注意事项：刀要锋利、不能用力向下挤压组织；组织块不宜过大、及时固定。

二、固定

（一）原则：及时固定、避免RNA酶的污染

4％多聚甲醛（0.1M PBS PH7.4，可加1/1000的DEPC）,动物实验标本最好先灌流固定。（二）固定液的浓度、固定时间及温度要适宜

1 浓度越高组织结构保存的越好，但mRNA的保存越差；

2 固定时间越长，mRNA破坏的越多；做原位杂交组织固定时间不宜过长，一般24h，不能高温固定（微波可使组织内温度升高），低温可保护RNA不降解（4 ℃冰箱内固定）。mRNA杂交：最好用冰冻切片

a. 4％多聚甲醛中固定1－2h，浸入15%蔗糖溶液中

4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中。

b. 取材后直接液氮冷冻，切片后4％多聚甲醛固定

10min，空气干燥后－70 ℃低温冰箱保存。

注意：a. 多聚甲醛与戊二醛混合固定的组织可同时用作光、

电镜检查，但不能用于原位杂交实验。

b. 石蜡切片蛋白质交联影响探针穿透，包埋降低

mRNA含量

三、玻片和组织切片的处理

玻片的处理：

洗涤：洗涤剂→水洗→洗液（24h）→水洗→双蒸水洗→60 ℃烤干→250 ℃烘烤4h，锡箔纸包裹无尘存放。

玻片硅化：将烘烤过的载玻片用2％APES丙酮液浸泡3min →用丙酮洗两次→用DEPC处理过的蒸馏水洗1～2次→40 ℃烘干→防尘保存待用。（整个过程要戴消毒手套进行）

未经硅化的玻片可以涂粘附剂（多聚赖氨酸）

2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：稀释的酸洗涤、去垢剂Triton X-100或消化酶（蛋白酶k、胃蛋白酶），用量及孵育时间视组织的种类、固定剂的种类及切片的厚薄而定。为保持组织结构，可用4％多聚甲醛再固定。

3.降低背景染色：杂交后的酶处理和杂交后的洗涤。

预杂交：预杂交液不含探针和硫酸葡聚糖，可封闭非特异性杂交点。

杂交后用低浓度RNA酶溶液洗涤一次，以减少残留的内源性RNA。

4.防止RNA酶污染：整个杂交前处理过程都需戴消毒手套，所有实验用玻璃器皿和镊子于实验前一日200 ℃烘烤。

四、杂交

将杂交液滴于切片的组织上，加盖硅化的盖玻片以防止杂交液蒸发。（放在湿盒中，37 ℃孵育）

五、杂交后处理

用不同浓度、不同温度的盐溶液漂洗，可有效地减低背景染色，RNA酶液的洗涤可将组织中非碱基配对的RNA除去。

原则：盐溶液的浓度由高到低，温度由低到高。

注：切勿使切片干燥。

六、显示

根据核酸探针标记物的种类可进行不同显色处理，原位杂交探针一般是用半抗原地高辛标记的，借助于间接加入的酶（酶标的抗地高辛抗体）使底物显色，常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。

1.AP显色系统：－AP+BCIP→BCL-OH+Pi

BCL-OH+NBT →蓝紫色↓

2. HRP显色系统：－HRP+H2O2 →HRP.H2O2

HRP.H2O2 +ODA-NH2 →棕色↓

细胞或组织的原位杂交切片显色后可进行半定量检测，但

要注意严格控制实验条件的同一性，包括切片的厚度、核酸的

保存量等。

七、对照实验和结果的判断

对照实验的设计须根据核酸探针和靶核苷酸的种类以及

现有可能的条件选定：

1.将cDNA或cRNA探针进行预杂交（吸收实验）。

2.与非特异性序列和不相关探针杂交（置换实验）。

3.将切片用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交，应用同义RNA探针进行杂交。

4.以不加核酸探针杂交液进行杂交（空白实验）。

5.组织对照应用已确定为阳性或阴性的组织进行杂交对照。

6.应用未标记探针做杂交进行对照。

八、阳性信号的评定

1.阳性信号定位于胞浆，蓝色细颗粒状，信号越强颜色越深，阴性对照片中无阳性信号检出。

2.阳性细胞数：阳性细胞数≤10％、≤30％、≤70％和>70％分别计为1、2、3和4分。

3.阳性着色强度：可分为弱、中、强三级，分别计1、2、3分，上述两种计分相加，1～3分为阴性，4～5分为阳性，6～7分为强阳性。