抗体技术实验四(研究生)
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• 水质: 电阻率 > 10 MW.cm TOC < 30 ppb • 纯水应用特点：对离子纯度有一定要求，但有机 杂质的要求并不严格。 –滴定 –pH缓冲溶液 –玻璃容器清洗 –UV 光谱分析 –植物细胞培养 –灭菌锅供水 实验中心 –超纯水供水
超纯水的应用
• 水质：电阻率 18.2 MW.cm @25℃, TOC < 10 ppb，微生 物<1cfu/ml。 • 超纯水应用特点：对离子纯度、有机物、微生物、颗粒均 有严格要求。 –精密仪器分析 –分子生物学实验 –细胞学实验 • 超纯水的使用习惯： –现取现用 –电阻率只反应离子含量，与无机物含量无关 –尽量避免纯水系统中有菌膜形成 实验中心
实验中心
黑胶虫
实验中心
平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS）
主要是由无机盐、葡萄糖组成。无机离子是细 胞的重要成分，它的作用是维持细胞渗透压平衡，
保持pH稳定；葡萄糖提供细胞生存所需的能量。
平衡盐溶液是人工合成培养基的基础用液，又 常用来洗涤细胞，配好的平衡盐溶液可以通过过滤 除菌或高压灭菌。
生物技术学院 陈白虹 2012.12.8
实验中心
实验目的
1.了解动物细胞培养所来自百度文库的常用液。 2.掌握细胞培养实验用水的制备。 3.重点掌握RPMI-1640培养液的配制及操 作要求。
实验中心
细胞培养常用液
平衡盐溶液
基本试剂
培养液
PBS、Hanks等
消化液、抗生素等
DMEM、1640等
实验中心
细胞培养实验用水的制备
根据临床试验标准国际委员会（NCCLS）标准，将水质分 为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 级和特殊用水。 • Ⅰ级水：测试用时要求最小的干扰物和最大的纯度和精度，如 原子吸收、痕量元素分析等。 • Ⅱ级水：测试用时有可容忍的细菌存在，例如，不用保存的一 般试剂的制备等。 • Ⅲ级水：一般洗刷用水，制备高纯度纯水用水，配制微生物培 养基用水等。 • 特殊用水：操作过程中要求除去特殊的污染物，例如组织/细 胞培养中除去热源，HPLC中除去痕量有机物等。
实验中心
牛血清的筛选
1.细胞培养法 20%不同批号血清的培养液培养同一细胞数 的细胞，连续传三代，若细胞生长良好，再将血清浓度降 至10%或更低继续传代，由此可确定所试血清是否适合于 该细胞的培养及所需的最低浓度。 2.克隆化法 20%不同批号血清的培养液分别对同一株杂交瘤 细胞以有限稀释法进行克隆化，5-7天镜下观察细胞克隆 生长情况，一般好血清可使70%以上的孔长出克隆，且生 长迅速、细胞圆亮、胞浆丰满。
实验中心
谷氨酰胺补充液
谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中 都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解， 4℃
下放置7天即可分解约50%，所以在4℃放置2周以上时，要重
新加入谷氨酰胺使其终浓度为0.002mol/L。 100×贮存液：称取2.92g L-谷氨酰胺，用三蒸水或超纯 水溶解至100ml，过滤除菌，分装小瓶,-20℃冻存。
双抗溶液
1000×双抗贮存液：各取100万U(0.6g)青霉素、 100万U(1g)链霉素(Sigma公司)溶于10ml三蒸水或
超纯水中，过滤除菌，分装小瓶,-20℃冻存。
使用时，在培养基中按1:1000稀释，即终浓度 为青霉素和链霉素各100U/ml。
实验中心
实验中心
细胞培养基的定义
人工模拟细胞体内生长环境，
维持细胞生存和促进细胞生长增殖 的营养物质。
实验中心
细胞培养基的种类和组成
⒈天然培养基 是使用最早的培养基，主要取自于动物体液或
从动物组织分离提取，包括动物血浆、胚胎浸出液、 血清、羊水、腹水等。 优点: 营养成分丰富、培养效果良好。 缺点: 成分复杂、个体差异大、来源有限。 实验中心
0.001
0.01
-
蒸发残渣（105±2℃），mg/L ≤
-
1.0
2.0
可容性硅[以（sio2）计]，mg/L <
0.01
0.02
实验中心 -
水中的污染物
颗 粒 离 子
H H H-C-C-OH H H
有机物 微生物 气 体
实验中心
自动双重纯水蒸馏器
• 制水前先通电、通水，制水过 程需实验人员看护以防止停水 导致蒸馏水器损坏。 • 使用380V电源，安全性能差， 耗电量大，运行成本高。 • 一次蒸馏水质难以满足实验要 求，二、三次蒸馏，能源浪费 极大，制水过程麻烦。
实验中心
pH调整液
NaHCO3溶液 常用浓度为7.5%。称取7.5g NaHCO3，用三蒸水或超纯 水溶解至100ml，过滤除菌，分装小瓶，4℃冻存。 HEPES[N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙基磺酸]溶液 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在观察细胞时培养 基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若 加了HEPES，此时pH可以维持在7.0左右。使用终浓度一般为 10-50mmol/L。 1M储存液：用20ml双蒸水溶解4.76gHEPES，过滤除菌， 分装小瓶，4℃保存。 实验中心
⒉合成培养基
是根据天然培养基的成分，用化学成分和数量完 全了解的物质经过反复实验筛选、组合后形成的培养 基。 常用的合成培养基有MEM、DMEM、199、RPMI-1640 等，其主要成分为：氨基酸、维生素、糖类、无机盐 和添加动物血清。具有成分精确，重复性强，便于控 制和标准化。
实验中心
⒊无血清培养基
实验中心
PBS（Phosphate-Buffered Sallines）
KCl NaCl KH2PO4 Na2HPO4·2H2O H 2O 0.2g 8.0g 0.2g 1.56g 1000ml
实验中心
实验中心
消化液（0.25%胰酶+0.02%EDTA）
将0.25g胰酶、0.02g EDTA加入 100mlD-Hanks液或PBS（无Ca2+、Mg2+) 中，一边滴加1N NaOH一边搅拌，作用 是促进溶解和调pH值至7.2-7.4。完全 溶解后，过滤除菌，4℃备用。
清或抗生素) 实验中心
血 清
牛血清的主要作用 ⑴提供生长因子和激素
⑵提供贴附因子和伸展因子
⑶提供结合蛋白
⑷提供必需脂肪酸和微量元素
实验中心
牛血清质量要求
胎牛血清 牛龄 血清收集 无菌 病毒 支原体 噬菌体 内毒素(ng/ml) 血红蛋白(g%) pH 渗透压(mom/KgH2o) 新生牛血清 小牛血清 8月龄胎牛 12-24小时 <3个月 心脏穿刺 静脉放血 静脉放血 ≤1 ≤10 ≤10(15) 3.0-4.5 3.5-6.0 5.0-8.5 6.7-8.0 7.0-8.0 7.8-8.0 240-340 240-340 240-340
实验中心
中国实验室用水国家标准GB6682-2000
名称
PH值范围（25℃）
一级
-
二级
-
三级
5.0-7.5
电导率（25℃）,mS/m
≤
0.01
10 -
0.10
1 0.08
0.50
0.2 0.40
比电阻（MΩ.cm.25℃）≥
可氧化物质[以（0）计]，mg/L < 吸光度（254nm,1cm 光程）≤
使用这种水配制。
实验中心
●制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、 滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养 基液体的器具都应进行灭菌）。 ●搅拌时容器口应用锡纸封口，配好后应马上过滤 。
●培养液过滤后，要先抽取少许放入培养瓶内在37℃温箱内
放置72小时，以检测培养液是否有污染。 ●4℃保存6-9个月(不含谷氨酰胺)或2-3周(含谷氨酰胺、血
主要成分有： ⑴生长因子和激素 ⑵结合蛋白 ⑶贴附因子和伸展因子 ⑷有利细胞生长的因子和元素
实验中心
RPMI-1640培养基的配制
1.溶解培养基：将1包干粉培养基溶于总量2/3的水中，再用 少量水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，搅拌3-4小时。 2.补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3、谷氨酰 胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。 3.调pH值：加水到900ml，然后用5％ NaHCO3调节pH到7.2，加 水至终体积1000ml。 4.过滤除菌：采用0.45和0.22µm滤膜各一张，上层为0.45、 下层为0.22µm，以保证过滤效果。注意滤膜正面（光面） 朝上。过滤后分装于小瓶中（250ml），4℃保存。
实验中心
制备超纯水的复合纯化技术
水箱 预过滤柱
连续电去离子(EDI) 反渗透 UV254nm 离子交换树脂 + 活性碳 超滤柱
自来水
UV185/254nm UV254nm
电阻率检测器
预处理单元
TOC 检测器
TOC
精纯化单元
(Milli-Q)
Ultrapure water
实验中心
实验中心
纯水的应用
实验中心
膜的完整性 调节流速 控制压力
串 珠 状
实验中心
注意事项
●认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见 的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、 HEPES等。这些成分 有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验
需要决定。
●配制时要保证充分溶解。
●配制培养基最好使用新制备的三蒸水或超纯水。一般在试 验前当天或前一天制备为好。调节pH值的酸碱溶液也应该
RPMI-1640培养液的配制
1.量取约700ml超纯水，倒入1L烧杯。 2.分别称取3g Hepes、2.4g NaHCO3，加入上述烧杯。
3.剪开一包1640干粉培养基倒入上述液体并用超纯水 洗包装袋内部二次，洗液全部移入容器内。
4.容器口用原包装封口，室温磁力搅拌溶解，不要加 热。
实验中心
实验四 细胞培养常用液
超纯水的应用
• 水质：电阻率 18.2 MW.cm @25℃, TOC < 10 ppb，微生 物<1cfu/ml。 • 超纯水应用特点：对离子纯度、有机物、微生物、颗粒均 有严格要求。 –精密仪器分析 –分子生物学实验 –细胞学实验 • 超纯水的使用习惯： –现取现用 –电阻率只反应离子含量，与无机物含量无关 –尽量避免纯水系统中有菌膜形成 实验中心
实验中心
黑胶虫
实验中心
平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS）
主要是由无机盐、葡萄糖组成。无机离子是细 胞的重要成分，它的作用是维持细胞渗透压平衡，
保持pH稳定；葡萄糖提供细胞生存所需的能量。
平衡盐溶液是人工合成培养基的基础用液，又 常用来洗涤细胞，配好的平衡盐溶液可以通过过滤 除菌或高压灭菌。
生物技术学院 陈白虹 2012.12.8
实验中心
实验目的
1.了解动物细胞培养所来自百度文库的常用液。 2.掌握细胞培养实验用水的制备。 3.重点掌握RPMI-1640培养液的配制及操 作要求。
实验中心
细胞培养常用液
平衡盐溶液
基本试剂
培养液
PBS、Hanks等
消化液、抗生素等
DMEM、1640等
实验中心
细胞培养实验用水的制备
根据临床试验标准国际委员会（NCCLS）标准，将水质分 为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 级和特殊用水。 • Ⅰ级水：测试用时要求最小的干扰物和最大的纯度和精度，如 原子吸收、痕量元素分析等。 • Ⅱ级水：测试用时有可容忍的细菌存在，例如，不用保存的一 般试剂的制备等。 • Ⅲ级水：一般洗刷用水，制备高纯度纯水用水，配制微生物培 养基用水等。 • 特殊用水：操作过程中要求除去特殊的污染物，例如组织/细 胞培养中除去热源，HPLC中除去痕量有机物等。
实验中心
牛血清的筛选
1.细胞培养法 20%不同批号血清的培养液培养同一细胞数 的细胞，连续传三代，若细胞生长良好，再将血清浓度降 至10%或更低继续传代，由此可确定所试血清是否适合于 该细胞的培养及所需的最低浓度。 2.克隆化法 20%不同批号血清的培养液分别对同一株杂交瘤 细胞以有限稀释法进行克隆化，5-7天镜下观察细胞克隆 生长情况，一般好血清可使70%以上的孔长出克隆，且生 长迅速、细胞圆亮、胞浆丰满。
实验中心
谷氨酰胺补充液
谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中 都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定容易降解， 4℃
下放置7天即可分解约50%，所以在4℃放置2周以上时，要重
新加入谷氨酰胺使其终浓度为0.002mol/L。 100×贮存液：称取2.92g L-谷氨酰胺，用三蒸水或超纯 水溶解至100ml，过滤除菌，分装小瓶,-20℃冻存。
双抗溶液
1000×双抗贮存液：各取100万U(0.6g)青霉素、 100万U(1g)链霉素(Sigma公司)溶于10ml三蒸水或
超纯水中，过滤除菌，分装小瓶,-20℃冻存。
使用时，在培养基中按1:1000稀释，即终浓度 为青霉素和链霉素各100U/ml。
实验中心
实验中心
细胞培养基的定义
人工模拟细胞体内生长环境，
维持细胞生存和促进细胞生长增殖 的营养物质。
实验中心
细胞培养基的种类和组成
⒈天然培养基 是使用最早的培养基，主要取自于动物体液或
从动物组织分离提取，包括动物血浆、胚胎浸出液、 血清、羊水、腹水等。 优点: 营养成分丰富、培养效果良好。 缺点: 成分复杂、个体差异大、来源有限。 实验中心
0.001
0.01
-
蒸发残渣（105±2℃），mg/L ≤
-
1.0
2.0
可容性硅[以（sio2）计]，mg/L <
0.01
0.02
实验中心 -
水中的污染物
颗 粒 离 子
H H H-C-C-OH H H
有机物 微生物 气 体
实验中心
自动双重纯水蒸馏器
• 制水前先通电、通水，制水过 程需实验人员看护以防止停水 导致蒸馏水器损坏。 • 使用380V电源，安全性能差， 耗电量大，运行成本高。 • 一次蒸馏水质难以满足实验要 求，二、三次蒸馏，能源浪费 极大，制水过程麻烦。
实验中心
pH调整液
NaHCO3溶液 常用浓度为7.5%。称取7.5g NaHCO3，用三蒸水或超纯 水溶解至100ml，过滤除菌，分装小瓶，4℃冻存。 HEPES[N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙基磺酸]溶液 主要作用:防止培养基pH迅速变动。在观察细胞时培养 基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若 加了HEPES，此时pH可以维持在7.0左右。使用终浓度一般为 10-50mmol/L。 1M储存液：用20ml双蒸水溶解4.76gHEPES，过滤除菌， 分装小瓶，4℃保存。 实验中心
⒉合成培养基
是根据天然培养基的成分，用化学成分和数量完 全了解的物质经过反复实验筛选、组合后形成的培养 基。 常用的合成培养基有MEM、DMEM、199、RPMI-1640 等，其主要成分为：氨基酸、维生素、糖类、无机盐 和添加动物血清。具有成分精确，重复性强，便于控 制和标准化。
实验中心
⒊无血清培养基
实验中心
PBS（Phosphate-Buffered Sallines）
KCl NaCl KH2PO4 Na2HPO4·2H2O H 2O 0.2g 8.0g 0.2g 1.56g 1000ml
实验中心
实验中心
消化液（0.25%胰酶+0.02%EDTA）
将0.25g胰酶、0.02g EDTA加入 100mlD-Hanks液或PBS（无Ca2+、Mg2+) 中，一边滴加1N NaOH一边搅拌，作用 是促进溶解和调pH值至7.2-7.4。完全 溶解后，过滤除菌，4℃备用。
清或抗生素) 实验中心
血 清
牛血清的主要作用 ⑴提供生长因子和激素
⑵提供贴附因子和伸展因子
⑶提供结合蛋白
⑷提供必需脂肪酸和微量元素
实验中心
牛血清质量要求
胎牛血清 牛龄 血清收集 无菌 病毒 支原体 噬菌体 内毒素(ng/ml) 血红蛋白(g%) pH 渗透压(mom/KgH2o) 新生牛血清 小牛血清 8月龄胎牛 12-24小时 <3个月 心脏穿刺 静脉放血 静脉放血 ≤1 ≤10 ≤10(15) 3.0-4.5 3.5-6.0 5.0-8.5 6.7-8.0 7.0-8.0 7.8-8.0 240-340 240-340 240-340
实验中心
中国实验室用水国家标准GB6682-2000
名称
PH值范围（25℃）
一级
-
二级
-
三级
5.0-7.5
电导率（25℃）,mS/m
≤
0.01
10 -
0.10
1 0.08
0.50
0.2 0.40
比电阻（MΩ.cm.25℃）≥
可氧化物质[以（0）计]，mg/L < 吸光度（254nm,1cm 光程）≤
使用这种水配制。
实验中心
●制备培养基的器皿清洗要绝对干净，烤干后备用（滤器、 滤膜、量筒、移液管及盛放培养基的小瓶等存放和转移培养 基液体的器具都应进行灭菌）。 ●搅拌时容器口应用锡纸封口，配好后应马上过滤 。
●培养液过滤后，要先抽取少许放入培养瓶内在37℃温箱内
放置72小时，以检测培养液是否有污染。 ●4℃保存6-9个月(不含谷氨酰胺)或2-3周(含谷氨酰胺、血
主要成分有： ⑴生长因子和激素 ⑵结合蛋白 ⑶贴附因子和伸展因子 ⑷有利细胞生长的因子和元素
实验中心
RPMI-1640培养基的配制
1.溶解培养基：将1包干粉培养基溶于总量2/3的水中，再用 少量水洗包装袋内面两次，倒入培养液中，搅拌3-4小时。 2.补加试剂：根据包装袋说明和试验需要加入NaHCO3、谷氨酰 胺、丙酮酸钠、HEPES等其他试剂。 3.调pH值：加水到900ml，然后用5％ NaHCO3调节pH到7.2，加 水至终体积1000ml。 4.过滤除菌：采用0.45和0.22µm滤膜各一张，上层为0.45、 下层为0.22µm，以保证过滤效果。注意滤膜正面（光面） 朝上。过滤后分装于小瓶中（250ml），4℃保存。
实验中心
制备超纯水的复合纯化技术
水箱 预过滤柱
连续电去离子(EDI) 反渗透 UV254nm 离子交换树脂 + 活性碳 超滤柱
自来水
UV185/254nm UV254nm
电阻率检测器
预处理单元
TOC 检测器
TOC
精纯化单元
(Milli-Q)
Ultrapure water
实验中心
实验中心
纯水的应用
实验中心
膜的完整性 调节流速 控制压力
串 珠 状
实验中心
注意事项
●认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见 的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、 HEPES等。这些成分 有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验
需要决定。
●配制时要保证充分溶解。
●配制培养基最好使用新制备的三蒸水或超纯水。一般在试 验前当天或前一天制备为好。调节pH值的酸碱溶液也应该
RPMI-1640培养液的配制
1.量取约700ml超纯水，倒入1L烧杯。 2.分别称取3g Hepes、2.4g NaHCO3，加入上述烧杯。
3.剪开一包1640干粉培养基倒入上述液体并用超纯水 洗包装袋内部二次，洗液全部移入容器内。
4.容器口用原包装封口，室温磁力搅拌溶解，不要加 热。
实验中心
实验四 细胞培养常用液