蛋白质高效液相色谱技术
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精品课件
高效
高压
分析速
度快
HPLC是近二十年来发展起来的
一项新颖快速的分离技术。它
是在经典液相层析法基础上，
引进了气相层析的理论具有气
相层析的全部优点。
高灵 敏度
wenku.baidu.com
应用 范围广
精品课件
根据分离机理蛋白质HPLC又可分为
1 高效凝胶过滤色谱(HPSEC) 2 高效离子交换色谱（HPIEC） 3 高效亲和色谱（HPAFC） 4 反向高效液相色谱（RP-HPLC）
精品课件
复 泵
柱 塞
往
液缸容积小，可至0.1ml，因此易于 清洗更换流动相，特别适合再循环和 梯度洗脱 流量不受柱阻影响
泵压可达400kg/cm2
输出的脉冲性较大，现多采用双泵 系统来克服
精品课件
分离系统
三 分离系统
*色谱柱
连接管
精品课件
恒温器
色谱柱
• 柱效高 • 选择性好 • 分析速度快
精品课件
高效液相色谱法在蛋白质 分离中的应用
陈檬 张双健 郭传龙 石晨阳 汪菊芬
S1030624 S1030621 S1030622 S1030623 S1030625
精品课件
1 高效液相色谱技术特点概述 2 HPLC系统各组分介绍； 3 流动相的要求及准备过程 4 HPLC色谱技术与其他技术联用
5 HPLC 应用举例 66 现5状与展望
进入色谱柱样品的处理
精品课件
柱的使用和维护注意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就 会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。 • ①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 • ②应逐渐改变溶剂的组成 。 • ③一般说来色谱柱不能反冲 ，会迅速降低柱效。
精品课件
柱的使用和维护注意事项
• ④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避 免固定相被破坏。
。
上
分
样
析
精品课件
进样方式
部分装液法
完全装液法
进样量应不大于定量 进样量应不小于定量
环体积的50%（最多
环体积的5~10倍（最
75％），并要求每次 进样体积准确、相 同。 缺点是易产生由进
少3倍），这样才能 完全置换定量环内的 流动相，消除管壁效 应，确保进样的准确 度及重复性
样引起的峰展宽
精品课件
恒温装置
在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准 确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在 ±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。
精品课件
流动相的要求
粘度小
反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入 一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用
沸点的低固是体甲醇和乙腈与。色一谱般系情况下甲溶醇-剂水的已经 残留能 但物推够少荐满乙足腈多种-水样统做品相初的适始分应实离验，，粘与度甲小醇纯，比度价，格乙低。
高压输 液泵
二 输液系统
输液系统
在线脱 气装置
梯度仪
精品课件
高压输液泵
输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。其 作用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系 统。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分 析结果的可靠性 。
流量稳定 流量范围宽 输出压力高 液缸容积小 密封性能好，耐腐蚀
精品课件
反相高效液相色谱法对 血清中胰岛素的测定
色谱柱 流动相
梯度 洗脱
其他
C5 柱(100 mm*4.6mm5 μm，Phenomenex公 司，美国
A 相: 10mmol/L Tris缓冲液 (pH 8.5) ;
B相:乙腈;
流速:
1mL/min
精品课件
B相体积分数 变化为:0～15 min, 15%～ 25.5% ;
腈的溶剂强度高粘度小，并可满足185205nm处检测的要求。
与检测器 相适应
精品课件
流动相的准备
调整PH
根据所分离蛋白质及 色谱柱决定
流动相脱气
目前实验室主要用的 是超声15min左右
滤膜过滤
溶剂使用前都必须经 0.45μm滤膜过滤，以除去 杂质微粒。分清有机相滤 膜和水相滤膜，对于混合
流动相，在混合前过滤
精品课件
蛋白样品 的性质
精品课件
HPLC与其他色谱光谱技术的联用
HPLC
CE
MS MS
CE
UF
精品课件
高效液相色谱—质谱
•
蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的
重要手段，通过质谱可以实现对蛋白质
的自动分离检测。
高效液相色谱—毛细管电泳
当毛细管电泳与HPLC联用时，两者 各自优势都得以发挥。HPLC—CE联用技术 特别适合细胞或组织中蛋白质的分离
精品课件
Thank you
精品课件
精品课件
高效液相色谱仪
精品课件
常用的HPLC仪
• Waters公司 • Agilent公司 • 岛津公司等
精品课件
一 进进样样方式系统
隔膜进样 停流进样 *阀进样 自动进样
精品课件
六通阀进样
高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由 圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国 Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大 HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器
。 15～21 min,
25.5%
进样量 20μL 柱温 25 ℃
精品课件
现状与展望
高效液相色谱目 前多用于蛋白质 的定量分析，对 于大样品的分离 纯化成本较高且 费时，有待进一 步优化其条件或 找到适于分离纯 化蛋白质的方法。
相信随着新的色 谱柱和多种手段 的联用，高效液 相色谱能够在包 括蛋白质在内的 大分子物质的研 究领域里发挥更 大的作用
• ⑤ 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱 柱之间连接一保护柱。
• ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内 的杂质。
精品课件
四 检测系统
精品课件
噪音低
灵敏度高
要求
重复 性好
精品课件
适用范 围广
UV 检测器
精品课件
数据处理和计算机控制系统
采集 处理 分析 数据
控制 仪器
色谱 系统 优化
高效
高压
分析速
度快
HPLC是近二十年来发展起来的
一项新颖快速的分离技术。它
是在经典液相层析法基础上，
引进了气相层析的理论具有气
相层析的全部优点。
高灵 敏度
wenku.baidu.com
应用 范围广
精品课件
根据分离机理蛋白质HPLC又可分为
1 高效凝胶过滤色谱(HPSEC) 2 高效离子交换色谱（HPIEC） 3 高效亲和色谱（HPAFC） 4 反向高效液相色谱（RP-HPLC）
精品课件
复 泵
柱 塞
往
液缸容积小，可至0.1ml，因此易于 清洗更换流动相，特别适合再循环和 梯度洗脱 流量不受柱阻影响
泵压可达400kg/cm2
输出的脉冲性较大，现多采用双泵 系统来克服
精品课件
分离系统
三 分离系统
*色谱柱
连接管
精品课件
恒温器
色谱柱
• 柱效高 • 选择性好 • 分析速度快
精品课件
高效液相色谱法在蛋白质 分离中的应用
陈檬 张双健 郭传龙 石晨阳 汪菊芬
S1030624 S1030621 S1030622 S1030623 S1030625
精品课件
1 高效液相色谱技术特点概述 2 HPLC系统各组分介绍； 3 流动相的要求及准备过程 4 HPLC色谱技术与其他技术联用
5 HPLC 应用举例 66 现5状与展望
进入色谱柱样品的处理
精品课件
柱的使用和维护注意事项
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就 会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。 • ①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 • ②应逐渐改变溶剂的组成 。 • ③一般说来色谱柱不能反冲 ，会迅速降低柱效。
精品课件
柱的使用和维护注意事项
• ④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避 免固定相被破坏。
。
上
分
样
析
精品课件
进样方式
部分装液法
完全装液法
进样量应不大于定量 进样量应不小于定量
环体积的50%（最多
环体积的5~10倍（最
75％），并要求每次 进样体积准确、相 同。 缺点是易产生由进
少3倍），这样才能 完全置换定量环内的 流动相，消除管壁效 应，确保进样的准确 度及重复性
样引起的峰展宽
精品课件
恒温装置
在HPLC仪中色谱柱及某些检测器都要求能准 确地控制工作环境温度，柱子的恒温精度要求在 ±0.1~0.5℃之间，检测器的恒温要求则更高。
精品课件
流动相的要求
粘度小
反相色谱流动相以水作为基础溶剂，再加入 一定量的能与水互溶的非极性调整剂，常用
沸点的低固是体甲醇和乙腈与。色一谱般系情况下甲溶醇-剂水的已经 残留能 但物推够少荐满乙足腈多种-水样统做品相初的适始分应实离验，，粘与度甲小醇纯，比度价，格乙低。
高压输 液泵
二 输液系统
输液系统
在线脱 气装置
梯度仪
精品课件
高压输液泵
输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。其 作用是将流动相以稳定的流速或压力输入到色谱系 统。泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分 析结果的可靠性 。
流量稳定 流量范围宽 输出压力高 液缸容积小 密封性能好，耐腐蚀
精品课件
反相高效液相色谱法对 血清中胰岛素的测定
色谱柱 流动相
梯度 洗脱
其他
C5 柱(100 mm*4.6mm5 μm，Phenomenex公 司，美国
A 相: 10mmol/L Tris缓冲液 (pH 8.5) ;
B相:乙腈;
流速:
1mL/min
精品课件
B相体积分数 变化为:0～15 min, 15%～ 25.5% ;
腈的溶剂强度高粘度小，并可满足185205nm处检测的要求。
与检测器 相适应
精品课件
流动相的准备
调整PH
根据所分离蛋白质及 色谱柱决定
流动相脱气
目前实验室主要用的 是超声15min左右
滤膜过滤
溶剂使用前都必须经 0.45μm滤膜过滤，以除去 杂质微粒。分清有机相滤 膜和水相滤膜，对于混合
流动相，在混合前过滤
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蛋白样品 的性质
精品课件
HPLC与其他色谱光谱技术的联用
HPLC
CE
MS MS
CE
UF
精品课件
高效液相色谱—质谱
•
蛋白质组学和蛋白质酶谱研究的
重要手段，通过质谱可以实现对蛋白质
的自动分离检测。
高效液相色谱—毛细管电泳
当毛细管电泳与HPLC联用时，两者 各自优势都得以发挥。HPLC—CE联用技术 特别适合细胞或组织中蛋白质的分离
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Thank you
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高效液相色谱仪
精品课件
常用的HPLC仪
• Waters公司 • Agilent公司 • 岛津公司等
精品课件
一 进进样样方式系统
隔膜进样 停流进样 *阀进样 自动进样
精品课件
六通阀进样
高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由 圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国 Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大 HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器
。 15～21 min,
25.5%
进样量 20μL 柱温 25 ℃
精品课件
现状与展望
高效液相色谱目 前多用于蛋白质 的定量分析，对 于大样品的分离 纯化成本较高且 费时，有待进一 步优化其条件或 找到适于分离纯 化蛋白质的方法。
相信随着新的色 谱柱和多种手段 的联用，高效液 相色谱能够在包 括蛋白质在内的 大分子物质的研 究领域里发挥更 大的作用
• ⑤ 需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱 柱之间连接一保护柱。
• ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内 的杂质。
精品课件
四 检测系统
精品课件
噪音低
灵敏度高
要求
重复 性好
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适用范 围广
UV 检测器
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数据处理和计算机控制系统
采集 处理 分析 数据
控制 仪器
色谱 系统 优化