细胞培养

AEP对LPS诱导的Raw264.7细胞炎症模型抗炎实验

一、试剂与仪器

（一）细胞系

RAW264.7。

（二）试剂

胎牛血清

DMEM HyClone，美国

10000 U/mL 青霉素/链霉素Gibco，美国

DMSO Sigma，美国

lipopolsaccharide Sigma，美国

甲基四唑蓝(MTT) Sigma，美国

对氨基苯磺酸Sigma，美国

N-α-萘乙二胺Sigma，美国

（三）仪器

超净台

酶标仪

CO2恒温细胞培养箱

显微镜

离心机

（四）供试品配置

LPS 溶液配置：称取LPS 粉末5 mg，溶于1 mL DMSO 中，得5 mg/mL 母液。用时将母液用培养基稀释至 2 μg/mL（DMSO＜0.1%）。

MTT 溶液配置：称取MTT 50 mg，溶于10 mL PBS 中，避光震荡30 min。

0.22μm 滤膜过滤除菌，分装于避光EP 管中，4℃保存，备用。

Griess试剂配置：A 液：对氨基苯磺酸0.5 g，溶于稀醋酸（10%）150 mL 中，浓度1%。B 液：N-α-萘乙二胺0.1 g 用纯净水20 mL 溶解，再用醋酸（10%）稀释至150 mL，浓度0.1%。临用前分别加入50 μLA液和50 μL B 液，避光显色30 min。

待测化合物：AEP1，AEP2，AEP3，称取化合物固体5-10 mg，用DMSO 溶解成50 mg/mL 母液。用前用培养基稀释至所测浓度。

二、实验方法

（一）细胞培养

RAW264.7细胞用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM 培养基于37℃，5% CO2条件下培养。RAW264.7 细胞培养2-3 天或者长至70-80%左右时进行传代，弃去培养瓶中旧培养基，加入新鲜培养基，拧紧盖子后轻拍培养瓶底部再用吸管反复吹打，将细胞吹匀后进行传代。

（二）细胞毒性实验

取长至70%-80%的RAW264.7 细胞，用滴管吹成单细胞悬液，加入含10% FBS DMEM 培养基，调整细胞浓度为1×105cell/mL，接种至96 孔板中，100 μL/孔，每组6 个复孔，37℃和5% CO2培养过夜。除去旧液，除空白组外其他组给予相应浓度的含药培养基，培养24 小时。实验结束前 4 小时，除去上清，加入150 μL无血清DMEM 培养基和20 μL MTT (5 mg/mL)，37℃和5% CO2培养4 小时。4 小时后用注射器轻轻吸去上清，加入150 μL DMSO，漩涡震荡15 min，540 nm 下用酶标仪测各孔吸光度（OD）值，重复3 次。

（三）化合物对LPS 刺激RAW264.7 细胞TNF-α生成的影响

取长至70%-80%的RAW264.7 细胞，拍打培养瓶背面，吹成单细胞悬液，加入含10% FBS DMEM 培养基调整细胞浓度为5×105cell/mL，接种于24 孔板中，每孔1 mL，37℃5% CO2培养过夜。吸去上清，除空白组外其余加入 1 mL 含2 μg/mL LPS的DMEM 培养基，37℃5% CO2孵育 2 小时后，空白组和LPS 模型组加入1 mLDMEM培养基，其他加入1 mL 含各浓度药物的DMEM 培养基。37℃5% CO2孵育24 小时。培养结束后取上清用PBS 稀释20 倍，用ELSA 试剂盒测按说明书操作测上清中TNF-α含量。

（四）化合物对LPS 刺激RAW264.7 细胞IL-2生成的影响

取长至70%-80%的RAW264.7 细胞，拍打培养瓶背面，吹成单细胞悬液，加入含10% FBS DMEM 培养基调整细胞浓度为5×105cell/mL，接种于24 孔板中，每孔1 mL，37℃5% CO2培养过夜。吸去上清，除空白组外其余加入 1 mL 含2 μg/mL LPS的DMEM 培养基，37℃5% CO2孵育 2 小时后，空白组和

LPS 模型组加入1 mLDMEM培养基，其他加入1 mL 含各浓度药物的DMEM 培养基。37℃5% CO2孵育24 小时。培养结束后取上清用PBS 稀释20 倍，用ELSA 试剂盒测按说明书操作测上清中IL-2含量。

（五）统计分析

实验重复 3 次。实验数据以 x±SD表示。使用SPSS 18.0 软件对数据进行统计学分析，采用单因素方差分析(One-Way ANOV A)，组间差异以LSD-t 法和Dunnett’s t-test法进行比较；与空白组比较，显著性差异分别表示为*p<0.05，**p<0.01。

AEP抗炎机制

一、试剂和仪器

（一）Western blot:

RIPA 组织细胞快速裂解液上海基尔顿生物

BCA 蛋白定量试剂盒Thermo

蛋白预染MarkerFermentas

丽春红(Ponceau S) 上海基尔顿生物

NC 膜/发光液Millipore

脱脂奶粉BD 分装

Tween-20 吐温-20Amresco

X 光胶片柯达

仪器

mini protean 3 cell 电泳仪

电转仪

MK3 酶标仪

水浴锅

抗体

TLR-4

p38

JNK

ERK1/2

p-IκB

p-p65

p-IKK

GAPDH

羊抗兔HRP 标记二抗碧云天

羊抗鼠HRP 标记二抗碧云天

（二）RT-PCR:

Trizol

氯仿HPLC 级

异丙醇HPLC 级

SYBRGreen PCR 试剂盒

逆转录试剂盒

仪器

旋涡振荡器

电动匀浆机

低温冷冻离心机

ABI-7300Real-time 检测仪

mRNA 引物

Rat COX-2

Primer F 5' CCTGGTCTGATGATGTATGC 3'

Primer R 5' GTATGAGTCTGCTGGTTTGG 3'

Rat iNOS

Primer F 5' GTCCTACACCACACCAAAC 3'

Primer R 5' CTCCAATCTCTGCCTATCC 3'

Rat GAPDH

Primer F 5' ATCACTGCCACCCAGAAG 3'

Primer R 5' TCCACGACGGACACATTG 3'

二、实验方法

（一）供试品配置

LPS 溶液配置：称取LPS 粉末5 mg，溶于1 mL DMSO 中，得5 mg/mL 母液，使用时用DMEM 培养基稀释至 2 μg/mL（DMSO＜0.1%）。

待测化合物：称取化合物固体（LC-36, LC43）5-10 mg，用DMSO 溶解成50 mg/mL 母液，用前用DMEM 培养基稀释至所测浓度。

TBST 缓冲液：称取Tris base 2.42 g，NaCl 8.01 g，溶于800 mL 去离子水中，用HCl调pH 至7.6，去离子水定容至1000 mL，加入 2 mL 吐温-20 混匀。