免疫细胞化学技术

免疫细胞化学技术

一、免疫细胞化学技术的概述

*免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)

-是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为～。

(一) 对抗原和抗体的要求

*具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。

-对抗体的要求：纯度高、比活性强；

*高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。

-对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。

(二) 抗原(antigen, Ag)

*抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性：

-免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；

-免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。

*根据抗原是否显示免疫原性分为：

-完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。

*免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。

-半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。

*半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。

载体

*通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。

-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OV A)等。

-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。

（三）抗体(antibody, Ab)

1、抗体的概念：

*机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。

-抗体主要存在于血清内；

-抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。

-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。

2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。

*单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。

-特异性强、抗体产量高。

*多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

-特异性低，会产生抗体的交叉反应。

-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。

-抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。

3、抗体的制备——多克隆抗体的制备

*动物的选择

*佐剂(adjuvant)

*免疫方法

*免疫剂量

*抗体效价的测定

*放血或定期抽血

(1) 动物的选择

选择什么动物来免疫取决于：

*所需抗血清的量

-小鼠只能提供1.0～1.5ml的血液，而山羊能提供几升。

*能供免疫用的抗原量

-小鼠50g足够，而山羊需要几毫克。

(1) 动物的选择(续)

*动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。

-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。

-常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。

(2) 佐剂(adjuvant)

*一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。

*最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为:

-弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)

-弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)

弗氏不完全佐剂

(Freund's incomplete adjuvant, FIA)

*是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。

*使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。

弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant, FCA)

*在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2～20mg/ml)，即成为FCA。

*免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。

-一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。

佐剂与抗原乳化的方法

*研磨法：适于制备大量的佐剂抗原

-先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。

-按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。

*缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。

佐剂与抗原乳化的方法(续)

*注射器混合法

-将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。

*优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。

*缺点：不易乳化，时间长。

佐剂与抗原乳化的方法(续)

*快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。

-将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。

-每次乳化10～15s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。

*优点：简单、快速、节省材料。

乳化剂的鉴定

*判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。

(3) 免疫方法——免疫途径

*常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。

*一般采用多点注射方法

-常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。

-皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。

(3) 免疫方法——免疫途径(续)

*几点说明：

-大动物一般不用腹腔注射

-颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射

-抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100g抗原即可获得较好的免疫效果。

-皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。

(3) 免疫方法——次数及间隔时间

*次数一般为2～3次(初次免疫和加强免疫)

-首次注射后，10～15天再加强注射；

-剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。

*间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长

-豚鼠、大鼠为7～8天，兔子为10～15天，羊为14～28天；

-第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。

举例1：家兔的免疫

*初次免疫

-用50～200g Ag加入FCA，在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射；

*两周后，加强免疫

-将50～200g Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射；

*抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血

-抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。

举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔