植物生物技术-第八章原生质体融合

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原生质体融合技术简介

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中国科学院青岛生物能源与过程研究所
Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology
原生质体研究的发展
1838 1873 1896 1931 1954 1958 1970 1972 1972 1974 1976 1976 1977 1978 1981 1988 2002 Muller Lugmbuthl Unna Wathin Bnders et al Marston Power et al Carlson Ferenczy et al Michayluk Ferenczy et al Fodor et al Hopwood Gleba et al Menczel Kirimalra et al Stemmer et al 动物病理组织中发现多核细胞天花病脓胞周围发现多核细胞水痘侵害过的皮肤中发现多核细胞麻疹病人扁桃腺中发现多核细胞组织培养中发现麻疹病毒能诱导细胞用和成多核体用副流感病毒诱发细胞融合探索用硝酸钠诱导植物原生质体融合用NaNO3进行了烟草种间原生质体融合以白地霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成发现PEG是一种良好的聚合剂用于原生质体融合是一种良好的聚合剂用于原生质体融合发现以曲霉青霉营养缺陷型为材料经原生质体融合首次完成异核体形成巨大芽孢杆菌内株间原生质体融合成功链霉菌原生质融合并获融合重组子用PEG+高pH-Ca2+研究原生质体融合高用高pH-Ca2++9℅DMSO与少量与少量PEG获得较高的融合率用高与少量获得较高的融合率原生质体PEG融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株融合获得黑曲霉二倍体柠檬酸高产菌株原生质体一种新的体内分子育种方法——全基因组改组技术全基因组改组技术一种新的体内分子育种方法

植物原生质体融合技术

要点二
细胞大规模培养
通过改进细胞培养技术，可以实现植物原生质体融合后细胞的规模化培养，为快速繁殖和生产转基因植物提供有效手段。
生物反应器与细胞工厂的优化
生物反应器设计
针对植物原生质体融合过程，可以设计和优化生物反应器，实现融合过程的自动化和连续化，提高融合效率和细胞质量。
细胞工厂构建
通过优化生物反应器中的培养条件和工艺参数，可以构建高效细胞工厂，实现植物原生
技术应用领域
新品种培育
通过原生质体融合技术，可实现不同品种间优良性状的整合，快速培育出新品种。
基因功能研究
通过原生质体融合技术，可研究植物细胞中基因的表达和功能。
抗性改良
利用该技术改良植物的抗逆性，如抗旱、抗病、抗虫等。
细胞器与细胞生物学研究
该技术可用于研究细胞器的结构和功能，以及细胞分裂、分化的过程。
原生质体的诱导融合
电融合法
利用电场作用诱导原生质体融合，通常在特定的电融合装置中进行，需要在特定的电场强度和脉冲时间下进行操作。
化学融合法
利用化学物质如聚乙二醇（PEG）等诱导原生质体融合，通过调节PEG浓度、pH值等参数来控制融合过程。
融合后细胞的筛选与培养
筛选
通过特定的筛选方法如荧光染色、抗性筛选等，从融合后的细胞群体中筛选出具有优良性状的细胞。
植物原生质体融合技术
目录
CONTENTS
• 植物原生质体融合技术概述 • 植物原生质体融合技术的基本原理 • 植物原生质体融合技术的应用 • 植物原生质体融合技术的挑战与前景 • 案例研究 • 技术展望
01
CHAPTER
植物原生质体融合技术概述
定义与特点

原生质体融合和体细胞杂交的关系

原生质体融合和体细胞杂交的关系下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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原生质体培养名词解释

原生质体培养名词解释原生质体培养是一种常用的植物组织培养技术，用于繁殖植物和研究植物基因转化等问题。

本文将介绍原生质体培养的定义、原理和应用等方面的名词解释。

下面是本店铺为大家精心编写的4篇《原生质体培养名词解释》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。

《原生质体培养名词解释》篇11. 原生质体（Protoplast）原生质体是指从植物细胞中除去细胞壁后剩余的细胞质部分，包括细胞膜、质体、线粒体、质体小体、微管和微丝等细胞器。

原生质体是一个高度液态的细胞质体系，其形态和功能类似于一个微小的细胞。

原生质体可以通过融合实现远缘杂交，从而扩大植物遗传资源的利用范围。

2. 原生质体培养（Protoplast Culture）原生质体培养是指将离体的植物原生质体在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。

原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现植物遗传资源的利用和改良。

3. 原生质体融合（Protoplast Fusion）原生质体融合是指两个或多个原生质体合并成一个细胞的过程。

原生质体融合可以通过电激、化学处理或生物方法等手段诱导。

融合后的细胞称为杂种细胞，可以用于植物遗传资源的利用和改良。

4. 再生（Regeneration）再生是指通过培养技术，使离体的植物组织或细胞重新分化、再生为新的植株或组织。

再生是原生质体培养的重要应用之一，也是植物组织培养技术的基础。

5. 遗传转化（Genetic Transformation）遗传转化是指将外源基因或基因组导入植物细胞内，并使其表达的过程。

遗传转化是植物基因工程的重要组成部分，也是原生质体培养的应用之一。

通过原生质体培养技术，可以将目的基因导入植物细胞内，并实现植物的遗传转化。

6. 植物组织培养（Plant Tissue Culture）植物组织培养是指将离体的植物组织或细胞在适当的培养基上进行培养，以获得再生的植物组织或细胞。

原生质体融合育种

物理融合剂：电场、激光
（二）原生质体融合的影响因素１、融合剂电场融合的优点：适于动植物、微生物细胞；融合频率高可在显微镜下观察
（二）原生质体融合的影响因素
１、融合剂
２、温度 20~30℃
３、亲株的亲和力和原生质体的活性
４、无机离子
PEG介导融合钙离子、镁离子
电场融合
糖或糖醇
四、融合体再生复原：再生培养基细胞壁重建形成菌落 P239 图9.8
第五节酵母菌原生质体融合育种一、酵母细胞壁结构和遗传标记菌龄对原生质体形成影响大亲本灭火的方法：紫外线
热药物
第五节酵母菌原生质体融合育种一、酵母原生质体制备 p259 预处理：EDTA；巯基乙醇
蜗牛酶
第六节霉菌原生质体融合育种二、培养基及相关溶液 p262 （1）查氏培养基的作用：菌丝生长（3）酶液的制备：
（2）菌体培养方式：
1.平板玻璃纸法：
丝状菌
2.振荡沉没培养法
细菌和酵母菌
酶法分离原生质体的影响因素？
（3）菌体年龄
丝状真菌
菌丝体尖端细胞
放线菌
对数期到静止期
细菌
对数期
酵母菌
菌体同步化
酶法分离原生质体的影响因素？
（4）稳定剂
高渗溶液
无机盐：NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 微生物原生质体育种三、原生质体转化育种何种形式DNA转化率高？质粒
第一节微生物原生质体育种
五、其他微生物原生质体育种脂质体转移原生质体转染等
第二节微生物原生质体融合育种
微生物原生质体融合育种：
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程。

第八章第九章植物原生质体培养与体细胞杂交ppt课件

烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，请同学们想一想如何来治疗该病人
第二节植物原生质体培养的发展与意义
原生质体的培养技术，近年来也有很大改进，特别值得指出的是单个原生质体培养再生植株的成功（Spangenberg等，1986）。
利用这一技术，可以在单细胞水平上研究不同类型原生质体的生理特性，相互之间的作用以及单个原生质体的遗传操作。对不同亲本单个原生质体进行融合的研究也是有利的（Schweigo等，1987）。
饲养层培养法可大大提高水稻（Kyozu等，1987）、玉米（Rhodes等，1988）等作物原生质体的植板率。已有不少报道说明，琼脂糖能促进原生质体的分裂（Shillto等，1983），并有利于对原生质体生长过程的观察。
第一节
植物原生质体的定义及特点
（5）能摄取外来物质，可作遗传转化工具。
外来物质如核酸、蛋白质等高分子物质乃至病毒、叶绿体、细胞核和细菌等，是进行遗传转化研究的理想工具。
（6）变异为单细胞，变异性状易纯。
原生质体在培养中会发生变异，由于其是纯粹单细胞，因此变异原生质体再生植株的变异性状会更纯。
第三节植物原生质体培养方法
2、酶法分离原生质体：即用细胞壁降解酶，脱除植物细胞壁，获得原生
质体的方法（Cocking,1960）。目前多用此法。常用的细胞壁降解酶种类有：纤维素酶、半纤维
素酶、果胶酶、R-10（日本纤维素酶）、蜗牛酶胼胝质酶、EA3-867酶等。国内常用EA3-867酶是一种复合酶，其成分含纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（上海植物生化研究所产）。
特别是一直认为难以培养的禾谷类作物，例如，水稻（Fujimura等，1985）、玉米（蔡起贵等，1987； Rhodes等，1988）、小麦（Harris等，1988；王海波等，1989）、谷子（夏镇澳等，1989），以及高粱的原生质体培养都已相继成功。

酵母原生质体融合

酵母原生质体融合生态学院生物11 20号李香酿酒酵母，又称面包酵母或出芽酵母。

酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，广泛的用于制作面包和馒头等食品及酿酒，是发酵中最常用的生物种类。

酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径5–10μm。

其繁殖的方法为出芽生殖。

酵母菌种优劣直接影响发酵产品的价值，在自然界中菌种大多不具有较高的价值，因而对菌种的选育和改良显得尤为重要。

原生质体融合是一项应用广泛的菌种改良技术。

原生质体融合 (protoplast fusion)是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或化学的或生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，进而发生基因组间的交换重组，可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来。

从而获得带有双亲性状的、遗传性能稳定的融合子(fusant)的过程[1]。

目前常用的融合方法有化学融合、生物融合、电融合以及激光诱导融合等。

本实验用酿酒酵母2.339与酿酒酵母2.70作为融合双亲，进行融合，旨在计算两种菌原生质体的形成率、再生率及融合率。

望能将融合后的原生质体应用于酿酒生产中以获得较高的经济效益。

1材料1.1样品菌种：酿酒酵母(Saccharomgces cerevisiae)的两种营养缺陷型菌株(如met-、lys-)。

1.2 培养基和试剂(1)马铃薯培养基：马铃薯(去皮) 200g，葡萄糖20g，水1000 mL。

配制方法下：将马铃薯去皮，切成约2cm2的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，在补足水分1000 Ml,自然pH。

(2)YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄20g蒸馏水1000 mL，pH6.0。

(3)YEPD高渗培养基(含0.6 mol/L NaCl的YEPD)：在YEPD培养基中0.6mol/L NaCl，3％琼脂。

(林木育种学)第八章林木生物技术

（二）细胞培养与融合
1 原生质体分离
①材料的选择
②材料的预处理预培养法暗处理法药物及添加物处理法萎蔫处理法更新培养基法
③原生质体分离
④原生质体的收集与纯化
⑤原生质体活力鉴定
3 原生质体培养
1）原生质体培养方法液体浅层静止法固体培养法饲养法
2）原生质体培养基 KM、KM8P、V-KM等
3目的基因转化 1）农杆菌介导基因转化法 2）PEG转化法 3）电穿孔法（电激法） 4）基因枪法 5）花粉管通道导入法
4转化细胞的筛选与转基因植株鉴定 1）通过检测标记基因或报告基因：标记基因：nptⅡ基因（新霉素磷酸转移酶基因）、amp（氨苄青霉素
抗性基因）、hyg（潮霉素磷转移酶基因）等。报告基因：gus基因（B-葡萄糖苷酶基因）、luc（绿色荧光蛋白基因）、
3突变细胞的筛选方法
1）直接选择法：是指新的突变表型在选择条件下能够优先生长，或预期从感官上可以测定其它可见的差异。可分为正选择和负选择两种方式。
正选择：指在培养基中加入某种对正常细胞有毒害的化合物，使正常细胞不能生长而只有突变体才能生长，从而筛选出细胞突变体。
负选择：指用特定培养基使突变体细胞处于不能生长状态，而非突变细胞却可以正常生长，然后用汰选剂淘汰正常生长细胞，最后使突变细胞恢复生长并分离出来。
缘种B. campestris杂交、回交后代的育性，结果发现杂种花粉的育性超
过90%，且有42%左右的植株抗除草剂等。
三分子标记辅助育种 1 DNA遗传标记的特点：
数量极多；遗传上稳定；排除了环境差异。
2 DNA遗传标记的应用
构建遗传图谱；分析亲缘关系；定位目的性状；分子标记辅助选择；种质资源及杂种后代的鉴定。

《植物生物技术》教学大纲

《植物生物技术》教学大纲一、课堂教学大纲1、教学目的该课程系统地论述了植物生物技术的理论和方法，既介绍了基本知识，也反映了该领域的最新研究进展。

全课程共分三大部分：植物组织培养、植物基因工程和植物分子标记及应用。

要求学生全面系统地了解植物生物技术的发展过程和发展趋势；理解各部分的基本理论、原理和概念；融会贯通三大部分的内容，并能运用所学技术解决生产中的实际问题。

通过学习，使学生学习掌握现代生物技术知识的技能和方法，尤其要求学生具有将植物生物技术与传统方法相结合改良植物、培育新品种、设计高新技术产业的能力，提高学生综合分析问题，系统利用专业知识的综合素质。

2、教学内容第一章绪论（2学时）•生物技术的产生与发展•植物生物技术与农业革命•植物生物技术在未来农业生产中所起的作用第二章植物细胞培养实验室建设与操作技术（2学时）本章重点、难点：植物组织培养所涉及的基本概念；培养基的组成、特点和用途；植物组织培养实验室建设；无菌操作的原理与技术等。

•植物组织培养实验室建设•实验室的设置•主要仪器设备、用途和使用方法•无菌操作器械•培养基及其制备•培养基的成分组成•常用培养基及其特点•培养基的改良与效应分析•培养基的制备•植物组织培养离体操作技术•培养用品的清洗与洗涤液的使用•灭菌与消毒•无菌操作技术•无菌操作中应注意的事项第三章胚胎培养（2学时）本章重点、难点：胚培养、胚珠培养和胚乳培养的意义，在育种工作中的实用价值。

•胚培养•胚培养的意义和用途•胚培养的方法•影响胚培养效果的因素•培养条件下的胚发育•胚珠培养•胚珠培养的意义•胚珠培养操作技术•胚乳培养•胚乳培养的意义•影响胚乳培养效果的因素•植株再生•离体授精第四章植物愈伤组织的诱导与分化培养（2学时）本章重点、难点：愈伤组织诱导、继代、培养与分化的基本术语和概念；器官发生；体细胞胚胎发生与植株再生；促进细胞分化的方法手段。

•愈伤组织的诱导与继代培养•脱分化、再分化的概念•愈伤组织的诱导、时期划分，各时期愈伤组织的特征特性•继代培养及继代培养的意义•悬浮培养及其用途•愈伤组织分化与植株再生•器官发生与植株再生•体细胞胚胎发生与植株再生•体细胞胚胎发生过程•体细胞胚的概念与内涵•体细胞胚胎发生与器官发生的区别•影响体细胞胚胎发生的外部因素•影响体细胞胚胎发生的外部因素•影响体细胞胚胎发生的内在因素•试管苗的移栽与护理•试管苗与自然苗的生理区别•试管苗移栽时应注意的事项第五章体细胞无性系变异与植物改良（2学时）本章重点、难点：体细胞克隆变异产生的遗传基础；体细胞克隆变异的育种应用。

原生质体融合技术概述

3.3灭活的机理 3.4灭活原生质体特点不应用
• 灭活机制 • 目前对灭活原生质体的融合机制还丌很清楚。 • 1）Wright 的损伤互补原则 Wright使用丌同的生化药剂分别灭活两株动物细胞，融合后得到了活的杂亝细胞，他认为这是由于两株细胞的致死损伤得到了互补的结果。 Fodor等热灭活带有标记的 B.megaterium 的二个亲株原生质体，经PEG 诱导后未获得融合子。李焕娄等在研究弗氏链霉菌的株间灭活原生质体融合时发现，当两亲株的原生质体分别用热和紫外线，或都用紫外线灭活，然后迚行融合，而两亲株都用热灭活时，未能获得重组体。这些实验都支持了Wright 的损伤互补原则。
5、原生质体融合技术应用不展望
• 5.1目前的原生质体融合技术的的应用具体包括：１）提高产量或质量，合成新物质，如提高抗生素的合成；２）改良菌种的遗传特性，如酵母菌属间原生质体融合构建高温酵母菌株和L-异亮氨酸高产菌的原生质体融合育种；３）优化菌种的发酵特性，如酒精的酿造中的应用；４）质粒转移；５）原生质体不细胞核融合；６）迚行遗传分析
酶解温度对原生质体制备的影响
• 丌同的酶具有各自丌同的最适温度，同时还要注意菌株生长的最适温度，以避免因温度丌当而导致原生质体活性降低，甚至破坏，因此确定酶解温度通常要二者兼顾，这对水解细胞壁是至关重要的。一般酶解温度控制在20~40度。
酶浓度对原生质体制备的影响
• 原生质体形成率在一定范围内不溶菌酶的浓度成正比。当浓度过高溶菌酶作用于原生质体时，形成率得到提高高，但溶菌酶中往往含有一些对原生质体有害的酶类（如过氧化物酶、核糖核酸酶等），因此，当达到一定浓度时，必然会严重地影响原生质体的活性； • 而且酶量过大会使细菌脱壁太彻底，失去了原生质体再生时合成细胞壁的引物，易使菌体凝集，降低原生质体的再生率。

原生质体融合方法

原生质体融合方法原生质体融合是一种生物学实验方法，可以将两个不同类型的细胞或细胞器合并起来，形成一个新的细胞或多核细胞。

这项技术可以用于研究细胞信号传递、基因转移、蛋白质合成等生物学问题。

以下是关于原生质体融合的十条方法和详细说明。

1. 电融合法电融合法是原生质体融合中最常用的方法之一。

将两种不同的细胞分别制备成原生质体。

然后，将这两种原生质体放置于一对电极间，施加持续的电场脉冲，让细胞膜间形成暂时的孔道，从而使得两种原生质体间发生融合。

2. 化学融合法化学融合法也是一种常用的原生质体融合方法。

在这种方法中，使用一种特殊的化学物质如聚乙二醇，可直接将两种原生质体融合在一起。

在一些体系中，较低的离子浓度和温度也可以用于化学融合。

3. 热融合法热融合法是一种较为简单的原生质体融合方法。

在这种方法中，将两种原生质体放在高温环境中，以导致两种原生质体相互融合。

虽然方向较为简单，但是因为需要制备的原生质体较为容易受到热的影响，热融合法在实践中使用较少。

4. 脂质体介导法脂质体介导法是一种常用于外源基因转染的方法，但它也可以用于原生质体融合。

在这种方法中，先将两种原生质体分别与脂质体复合物混合，所形成的复合物直接融合。

5. 超声波融合法超声波法是一种比较新型的原生质体融合方法，在实验室中使用较少。

在这种方法中，使用超声波强制使分散在水相中的两种原生质体形成一个大型复合体，从而促进原生质体相互融合，形成一个新的细胞或原生质体。

6. 光融合法光融合法与其他融合方法不同之处是，它需要在特殊的光照条件下进行。

在这种融合方法中，两种原生质体分别注射不同颜色的发光蛋白，并在适当的光照条件下进行融合。

7. 激光融合法与前面介绍的融合方法不同，激光融合法使用的不是电场或化学物质，而是激光，它通过较强的能量促进原生质体的融合。

这种方法需要高度的技术要求，因此使用较为少见。

8. 微型流体融合法微型流体融合法是一种在生物芯片中使用的微型融合方法。

原生质体融合(实验报告)

酵母原生质体融合××××××××××酵母有发酵工业的灵魂之称，其发酵性能的好坏直接影响发酵产品的质量，同时也决定着发酵工艺流程和运转周期及运转费用[1]。

因此，选育优良的酵母菌种在发酵工业中具有重要的意义[2]。

对酿酒酵母的选育始终是酿酒工作者所要从事的重要工作之一。

好的酿酒酵母能够提高酒的质量和产量，赋予酒良好的风味；能够简化工艺流程，减少设备投资；能够缩短发酵周期，降低运转费。

原生质体融合育种( protoplast fusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。

通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。

1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象，同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合，从而开始了细胞融合的探索。

国内外对原生质体融合技术的研究都比较成熟, 一般认为酵母菌原生质体融合技术的关键点有原生质体的制备和再生、原生质体的融合以及融合子的筛选等。

传统的对酿酒酵母的选育方法主要有自然分离、连续培养和诱变育种[3]。

近年来重组技术，基因工程和原生质体融合技术迅速发展，得到了广泛应用。

两个或两个以上的细胞经过自然的或者人为的作用合并成为一个细胞叫融合细胞，这个过程就称为细胞融合过程。

用微生物作材料进行细胞融合，必须消除细胞壁和细胞膜。

通常采用酶解作用破除细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。

细胞融合之后，还经过细胞质融合，细胞核重组，细胞壁再生等一系列过程才能形成具有生活能力的新菌株。

融合后的细胞有两种可能：一是染色体DNA不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。

另一类是两亲本细胞核染色体DNA真正发生重组。

通过连续传代分离纯化可以区别这两类融合。

应该指出，即便是真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。

原生质体融合与植物遗传改良的例子

原生质体融合与植物遗传改良的例子
原生质体融合是一种生物技术，可以将两个不同植物的质体（细胞质和细胞核以外的细胞成分）融合在一起，形成一个新的细胞体系。

这种技术可以用于改良植物的性状，如增加植物的抗病性、耐盐性、耐旱性等等。

以下是一些原生质体融合在植物遗传改良中的例子：
1. 水稻的抗病性提高：将拥有良好抗病性的水稻品种的原生质体融合到普通水稻品种上，可以显著提高该水稻品种的抗病能力。

2. 番茄的耐盐性提高：将耐盐性较强的番茄品种的原生质体融合到普通番茄品种上，可以提高该番茄品种的耐盐性，使其能够生长在高盐度的土地上。

3. 油菜的花期延长：将具有较长花期的油菜品种的原生质体融合到其它品种上，可以使其它品种的花期延长，从而延长其生产收获期。

总之，原生质体融合技术可以为植物遗传改良提供新的途径和选择，因此在现代植物育种中得到广泛应用。

原生质体制备与融合

Thanks!
• 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
细胞壁脱去后，原生质体必须在高渗环境中保存及生长，否则会因为渗透压而破裂。因此，渗透压稳定剂也是影响原生质体制备的重要因素。
0.5% 纤维素酶+1mol/L 的山梨醇处理Lecanicillium sp.
高倍显微镜下酶解前 Lecanicillium sp. 菌丝
混合酶液处理 Lecanicillium sp. 制得原生质体（×200）
原生质体的融合
原生质体的融合的不同产物
电诱导融合法：短时间强电场作用，质膜发生可逆性电击穿，促使原生质体融合
原生质体融合的方法
激光诱导融合法：让原生质体先紧密贴在一起，后用激光对接触处照射，使细胞融合
化学诱导融合法
• 酶解时间、温度、pH值对原生质体制备的影响
酶解时间的长短直接影响原生质化的效果，处理时间过短，脱壁不完全，处理时间过长，会导致原生质体脱水皱缩，再生率显著降低。而且不同的的酶都有各自的最适酶解温度。酶解时温度选择的原则是既有利于原生质化，又能防止原生质体被破坏。酶解时的pH值随酶和物种有一定的差异，需根据实际情况对pH值进行优化。
影响原生质体融合的因素
• 无机离子对原生质体融合的影响
原生质体融合过程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促进融合，而 K+、Na+会显著降低融合率。
• 融合剂PEG对原生质体融合的影响
仅将原生质体混合在一起融合率并不高，需要添加融合剂来提高融合率。PEG较常使用。PEG的相对分子质量和浓度高低对融合都有较大的影响。PEG浓度过高会导致原生质体皱缩甚至是中毒，过低导致原生质体破裂。
融合子的筛选