猪脾脏淋巴细胞分离
西藏小型猪胰岛细胞体外分离和纯化方法
西藏小型猪胰 岛细胞体外分离和纯化方法
戚 文 军 ２ ， 汪亦 男 － － ２ ， 胡 强 ， 唐 华１ ， ２那 顺 巴雅 尔 ， 顾为望１ ， ２
（ １ ． 东莞松 山湖明珠 实验动物科技有限公司， 东莞 ５ ２ ３ ８ ０ ８ ； ２ ． 南方医科大学实验动物中心暨比较 医学研究所， 广州 ５ １ ０ ５ １ ５ ） ［ 摘要］ 目的 确定成体西藏小型猪胰 岛细胞体外分离、纯化的理想条件 ，为异种移植治疗糖尿 病提供高质量的胰岛细胞 。方法 对比不同质量浓度的胶原酶（ １ ｍ ｇ ／ ｒ ｒ ａ ， ２ ｍ ｇ ／ ｒ ｒ ａ ， ３ ｎ Ｉ ｌ ｌ ， ４ ｍ ｎ １ ） 和同一质量浓度 不同时间点（ ０ ｍ ｉ ｎ ， １ ５ ｍｉ ｎ ， ３ ０ ｍ ｉ ｎ ， ４ ５ ｍ ｉ ｎ ， ６ ０ ｍ ｉ ｎ ， ７ ５ ｍ ｉ ｎ ， ９ ０ ｍ ｉ ｎ ） 分 离获得胰岛细 胞的数量和效果； 使用 Ｆ ｉ ｃ ｏ ｌ ｌ ４ ０ ０密度梯度 离心、淋巴分离液分离、离心和静置４ 种方法纯化胰 岛 细胞悬液，比较最终收集到的胰 岛细胞数量和效果； 用Ｄ Ｔ Ｚ染色计算胰岛细胞的纯度； 用Ａ Ｏ ／ Ｐ Ｉ 染 色计算胰岛细胞存活率。结果 确定了不同 质量浓度的胶原酶获取胰 岛细胞的最佳时间， 胶原 酶ｌ ｍｇ ／ ｍｌ 和２ ｍ ｇ ／ ｎ ￣ 组为４ ５ ｍ ｉ ｎ ，３ ｍ ｇ ／ ｍ ｌ 和４ ｍ ｇ ／ ｍ ｌ 组为 ３ ０ ｍ ｉ ｎ ， 各组在最佳时间点获得胰岛细
胞 的分 离效 果影 响 显著 ［ ２ － ４ 】 ，而纯 化 的手 段 决 定 了
最 终获得 的胰 岛细胞 的纯度和 数量 。本 文通过 对 比 实验确 定西藏 小型猪胰 岛细胞 体外分 离 、纯化 的理 想 条 件 ，为 下 一步 的异 种移 植 打 下 基础 ［ ５ ＇ 引。
随着畜牧业集约化和规模化的发展
随着畜牧业集约化和规模化的发展，健康养殖和食品安全已经引起人们的广泛关注。
尤其是以抗生素为代表的化学药品的大量使用，造成细菌耐药性以及畜产品中兽药残留的问题日益严重。
中药以其毒性低、副作用小、多靶点、病原微生物对其不易产生耐药性的优点引起人们越来越多的重视。
中草药免疫增强剂在免疫抑制性疾病和增强机体免疫效应方面发挥着强大的作用。
免疫增强剂(Inununopotentiator)是一类能单独与抗原同时使用，通过不同的作用方式来增强动物机体非特异性和特异性免疫的物质，如增强巨噬细胞活性、抗原物质的免疫原性和稳定性，促进抗体的合成与分泌等。
有些能非特异性地改变或增强抗原物质特异性免疫应答和发挥辅助作用的佐剂，也可称作免疫增强剂，比如胸腺激素及干扰素等生化制剂。
不同的中药成分其免疫增强作用的机制也不尽相同,尤其凸现在多靶点效应。
因此，中草药免疫增强剂在促进畜禽健康养殖过程中必将拥有广阔的发展前景。
一、中药免疫增强剂的特点（一）资源丰富，简便价廉中草药是我国传统医学的重要组成部分，有2000多年的应用历史，其原料来源广泛，种类繁多。
据统计，具有明显免疫增强作用的中草药将近200多种，除极少数是人工种植外，多数为野生。
成本低廉，易于推广应用。
（二）无毒副作用，无残留化学药物常在动物的体内蓄积残留，引起毒副作用，降低畜禽的免疫力，继而污染环境，危害人体的健康。
而中草药免疫增强剂多数无残留，不会致畸、致癌、致突变。
即使是用于防病治病的有毒中草药，经过传统炮制方法加工和科学配伍后，也可以减轻毒性或者消除毒性。
在使用剂量上，即使为常用剂量的数倍或几十倍以上，也未见机体有异常变化，安全性好。
据报道，应用40克泽漆，剂量是常用剂量的10倍。
煎水，1次灌服治疗畜禽疾病的安全范围大。
（三）无抗药性目前畜禽生产中使用的抗生素和化学药物均具有不同程度的耐药性，而中草药免疫增强剂以其独特的抗微生物作用的原理，基本不产生抗药性。
现有的研究表明，许多中药在体外实验中无显著性抑菌作用。
猪病学
猪瘟（Swine fever）猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的急性、热性、高度接触性、败血性传染病。
一直是造成养猪业重大损失的疫病之一。
其病理变化及诊断要点：（一）病理剖检变化1、超急性猪瘟病例，常常无明显病理变化，病猪突然死亡。
2、急性、亚急性病例，主要表现为多发性出血。
全身出血：常见于皮肤、会厌软骨、膀胱及胆囊黏膜，心内、外膜，各脏器的浆膜和黏膜。
全身淋巴结（包括颌下淋巴结、肩前淋巴结、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结等）均肿胀、呈现典型的周边出血，色鲜红。
由于淋巴结髓质肿胀，表现出大理石样外观。
脾脏：一般不肿大，脾脏边缘及其尖部可见大小不等、稍突出于脾脏表面，质地坚硬，切面呈三角形或椎形的红色梗死灶。
脾脏被膜下可见散在小出血点。
肾脏：不肿大，呈灰黄色，贫血状，于灰白色肾脏表面布满红色或褐色出血点，外观似麻雀卵，故称“雀斑肾”。
骨骼：由于猪瘟病毒损伤造血组织和影响钙、磷代谢，造成幼猪骨骼发育不良，肋骨和肋软骨交界处肿胀，即“骨骺线增宽”。
因骨髓出血，故有“黑骨髓”之称。
中枢神经系统：大脑、小脑呈现病毒性脑炎的典型病变，剖开颅腔，可见软脑膜呈树枝状充血，混浊，脑内压增高，稍突出于颅腔。
肺脏：猪瘟常与巴氏杆菌混合感染造成典型的出血性大叶性肺炎病变，重症病例可表现为纤维素性胸膜肺炎或心包炎。
肠道：猪瘟又称“烂肠瘟”，常表现为出血性纤维素性肠炎，或纤维素性坏死性肠炎。
如并发肠道沙门氏杆菌感染时，病变加重，尤其在回肠和盲肠交界处由于淋巴滤泡坏死常常表现为溃疡，此种溃疡病变为轮层状坏死，外观似钮扣，故称为“扣状肿”。
此外，如怀孕母猪感染猪瘟病毒可造成木乃伊胎、死胎和畸形胎。
在死胎猪中最常见的病理变化为皮下水肿、腹水和胸腔积液。
畸形胎主要表现为头、四肢和脊髓发育不良，脑和肺脏甚至不发育。
胚胎期感染且出生后不久死亡的仔猪表现为皮肤和内脏器官出血。
（二）病理组织学变化淋巴结：淋巴结周边陈旧性出血则有橙色血脂或淋巴结周边新鲜出血，淋巴细胞排空和网状细胞增生。
实验四脾淋巴细胞分离及流式检测 邵
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可重复滤过
超净台下操作全过程 4
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实验步骤
（二）制备单个核细胞悬液：
塑料漏皿
1. 将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套 中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中， 加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。 弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置34min，以破坏红细胞。然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离 心5min；
实验步骤
（一）取小鼠脾脏（3人1组） • 小鼠颈椎脱位处死
用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍 向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
• 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界 处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪 及筋膜组织。
取脾脏
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可重复滤过
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（四）计算细胞活力
1. 50μl细胞悬液+ 50μl的0.2% 苔盼兰溶液并混匀；
2. 取一滴显微镜下观察：
如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光， 则为死细胞；而细胞不被染色， 晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感， 为活细胞；
3. 计算细胞活力：计数100个 细胞中活细胞的百分率，一般 活力应在95%以上。
实验步骤
（三）计算细胞浓度
1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释） 2.混匀稀释后，取1滴加至细胞计数板中，计数细胞计数板中4大方格细胞总数； 3.计算细胞总数：
中药超微粉对断奶仔猪外周血淋巴细胞免疫功能的影响
作 者简 介 ： 发 明 （ ９４） 男 ， 授 ， 士 ， 董 １ ６一 ， 教 博 主要 从 事 中 兽 医 学 教 学 科研 工作 ， — ｉ：ｆ ｎ ＠ ｙｈ ｏ ｃ Ｅ ｍａｌｄｍｉｇ ａ ｏ ．ｎ
重耐药 性 ， 临床治 疗该 类 疾 病 必 须根 据 药 敏 试 验用 药 ， 注意用 药途 径 ， 并 只有 口服易 吸收 的敏感 药物或 注射不 易 吸 收 的 高敏 药 物 才 能起 到 明 显 的治 疗 效 果 。另外 ， 在动物 回归试验 中， 接种细菌培养物 的健 康 雏鸡未出现病变 ， 这证 明该 菌为条件性致 病菌 ， 改善 故 饲养环境 、 消除致病诱发 因素是防制该病 的基本措施 。 参考文献 ：
１ 材 料 与 方 法
１ １ 中药 紫河 车 （ 胎盘 ） 黄 芪 、 ． 人 、 麸炒 白术 、 炒苍 术 ： 自洛 阳市 医药 公 司 ； 购 牛胎 盘 ： 自洛 阳 巨尔乳 业 公 司奶 牛场 收集足 月 正 常 分娩 牛 胎 盘 ， 去 羊膜 及 除
收 稿 日期 ：０ ９０—４ ２ ０ —５０ 基 金项 目： 南 科 技 大 学 博 士科 研 启 动 基 金 （ ９ ０ ３ ９ ； 南 科 河 ００１２）河
压 积红 细胞悬 液 １ｍＬ， １日 １ ， 续 ３ｄ 次 连 。末 次 注 射 后 ７ｄ采 血 ， 测定 红细 胞 的凝 集效 价 ， 出现 “ 以 凝 集” 的最 高抗 血 清稀 释度 判 定 为血 凝效 价 。效 价 达 １： ０ ２０ ０以上者 为合格 。应 用 时采 用凝 集价 的 １ ２ ／ （ 亚凝 集 价） 为抗血 清 的稀释度 （ １： ｏ ） 作 即 ４ｏ ｏ 。
海 试 剂 三 厂 ， 号 ：７ ２ ７ 批 ０００ 。
脾脏淋巴细胞分离方法
小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。
红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。
1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。
2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。
3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。
75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。
（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。
（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。
（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。
执业兽医资格考试预防科目-1-1_真题-无答案
执业兽医资格考试预防科目-1-1(总分50,考试时间90分钟)一、A1型题每一道考试题下面有A、B、C、D、E五个备选答案，请从中选择一个最佳答案。
1. 细菌具有黏附作用的结构是A．荚膜 B．鞭毛 C．菌毛 D．芽孢E．核体2. 递呈初次接触抗原最有效的细胞是A．巨噬细胞 B．B淋巴细胞 C．树突状细胞 D．胸腺上皮细胞 E．血管内皮细胞3. 具有抗菌作用的细菌代谢产物是A．色素 B．细菌素 C．外毒素 D．内毒素 E．卵磷脂酶4. 在动物机体局部黏膜免疫中发挥主要作用的抗体是A．IgA B．IgD C．IgE D．IgGE．IgM5. 动物驱虫期间，对其粪便最适宜的处理方法是A．深埋 B．直接喂鱼 C．生物热发酵D．使用消毒剂 E．直接用作肥料6. 兔病毒性出血病的典型病理变化是A．肾出血 B．胃出血 C．肠壁变薄D．肺出血，肝淤血 E．肠系膜淋巴结肿大7. 急性型猪巴氏杆菌病病理剖检的重要特征为A．出血性肠炎 B．化脓性鼻炎 C．化脓性脑膜炎 D．纤维素性肺炎 E．纤维素性腹膜炎8. 猪肺疫的病原是A．猪丹毒杆菌 B．猪肺炎支原体 C．副猪嗜血杆菌 D．多杀性巴氏杆菌 E．猪胸膜肺炎放线杆菌9. 分离新城疫病毒，病料接种SPF鸡胚的部位是A．羊膜 B．羊膜腔 C．尿囊膜 D．尿囊腔 E．卵黄囊10. 仔猪梭菌性肠炎又称A．仔猪白痢 B．仔猪黄痢 C．仔猪红痢D．仔猪痢疾 E．仔猪胃肠炎11. 蜜蜂美洲幼虫腐臭病具有诊断意义的症状是A．房盖有穿孔 B．烂虫能拉丝 C．房盖颜色加深 D．房盖出现下陷 E．烂虫有腥臭味12. 我国动物传染病防疫工作的指导方针是A．检疫为主 B．预防为主 C．治疗为主D．抗病育种为主 E．扑杀为主13. 细菌的繁殖方式是A．芽殖 B．复制 C．掷孢子 D．二分裂增殖 E．产生芽孢子14. 细菌在固体培养基上培养，通过肉眼可观察到的是A．菌体形态 B．菌体大小 C．菌体排列D．菌体集落 E．菌体结构15. 属于典型的细胞毒型(Ⅱ型)变态反应是A．血清病 B．青霉素过敏反应 C．结核菌素肉芽肿 D．新生畜溶血性贫血 E．自身免疫复合物病16. 以呼吸困难、咳出带血的黏液为特征的疾病是A．新城疫 B．鸡传染性鼻炎 C．传染性喉气管炎 D．鸡毒支原体感染 E．传染性支气管炎17. 用于病毒克隆纯化的方法是A．空斑试验 B．血凝试验 C．血凝抑制试验 D．脂溶剂敏感试验 E．胰蛋白酶敏感试验18. 寄生于羊的大型肺线虫是A．丝状网尾线虫 B．胎生网尾线虫 C．安氏网尾线虫 D．柯氏原圆线虫 E．长刺后圆线虫19. 除马以外，马鼻疽的最易感动物是A．牛 B．羊 C．猪 D．犬 E．骡20. 确诊寄生虫病最可靠的方法是A．病变观察 B．病原检查 C．血清学检验 D．临床症状观察 E．流行病学调查21. 感染动物症状消失后，仍长期或终身携带病毒并不定期排毒的感染类型是A．隐性感染 B．局部感染 C．继发感染D．内源性感染 E．持续性感染22. 狄斯蜂螨的发育过程中无A．卵 B．蛹 C．幼虫 D．若虫E．成虫23. 属于中枢免疫器官的是A．脾脏 B．胸腺 C．淋巴结 D．扁桃体 E．哈德腺24. 实验室诊断禽霍乱的最适病料是A．肾 B．鼻拭子 C．肠黏膜 D．心血、肝 E．泄殖腔拭子25. 种蛋室空气消毒常用的方法是A．紫外线 B．α射线 C．β射线 D．γ射线 E．X线26. 属于免疫学诊断的实验室检测方法是A．凝集试验 B．PCR诊断技术 C．病原分离培养 D．核酸探针技术 E．病理组织学诊断27. 具有血凝素神经氨酸酶纤突的病毒是A．新城疫病毒 B．禽白血病病毒 C．马立克病病毒 D．禽传染性喉气管炎病毒 E．禽传染性支气管炎病毒28. 猪是猪带绦虫的A．中间宿主 B．终末宿主 C．贮藏宿主D．补充宿主 E．保虫宿主29. 细菌抵御吞噬细胞吞噬的结构是A．荚膜 B．鞭毛 C．芽孢 D．性菌毛E．普通菌毛30. 猪细小病毒病主要发牛于A．公猪 B．育肥猪 C．初产母猪 D．经产母猪 E．后备母猪31. 家蚕核型多角体病不会出现的病症是A．脓蚕 B．环节肿胀 C．行动呆滞D．体壁易破 E．体色乳白32. 接种猪水疱病病毒后，可致死的实验动物是A．1～2日龄小鼠 B．7～9日龄小鼠 C．1月龄家兔 D．3月龄家兔 E．7日龄以下雏鸡33. 以食管黏膜糜烂并呈线状排列为病理特征的牛传染病是A．口蹄疫 B．牛流行热 C．牛病毒性腹泻 D．牛出血性败血病 E．牛传染性鼻气管炎34. 可用于体外抗原或抗体检测的免疫学技术是A．淋巴细胞分离 B．淋巴细胞分类 C．补体结合反应 D．单克隆抗体制备 E．多克隆抗体制备35. 裸露病毒保护核酸免受环境中核酸酶破坏的结构是A．膜粒 B．纤突 C．芯髓 D．衣壳E．囊膜36. 怀疑奶牛发生疯牛病，实验室确诊的方法是A．检测血清抗体 B．病原分离鉴定 C．检测病原基因 D．脑组织病理学检查 E．病料接种小白鼠，观察症状37. 锥虫的免疫逃避机制主要是A．抗原变异 B．抗原伪装 C．免疫抑制D．代谢抑制 E．组织学隔离38. 革兰阳性菌细胞壁特有的组分是A．脂质 B．脂多糖 C．磷壁酸 D．肽聚糖 E．蛋白质39. 细粒棘球蚴多寄生于家畜和人的A．脑和眼球 B．胃和小肠 C．心脏和血管 D．肝脏和肺脏 E．肾脏和膀胱40. 生产中对动物皮毛进行炭疽检疫应用的方法是A．细菌分离 B．血凝试验 C．Ascoli反应 D．免疫荧光试验 E．琼脂扩散试验41. 出现双相热、肠道急性卡他性炎和神经症状的犬传染病是A．狂犬病 B．犬瘟热 C．犬流感 D．犬细小病毒病 E．犬传染性肝炎42. 牛传染性鼻气管炎临床类型不包括A．皮肤型 B．流产型 C．呼吸道型D．脑膜脑炎型 E．生殖道感染型43. 用于分离细菌的粪便样本在运输中常加入的保存液是A．70%乙醇 B．无菌蒸馏水 C．0.1%新洁尔灭D．0.1%高锰酸钾 E．无菌甘油缓冲盐水44. 分离培养牛出血性败血症病原的常用培养基是A．SS琼脂 B．鲜血琼脂 C．麦康凯琼脂D．普通营养琼脂 E．伊红-美蓝琼脂45. 属于半抗原的物质是A．外毒素 B．青霉素 C．细菌菌体D．细菌鞭毛 E．病毒衣壳46. 用鸡胚增殖禽流感病毒的最适接种部位是A．胚脑 B．羊膜腔 C．尿囊腔 D．卵黄囊 E．绒毛尿囊膜47. 新生动物通过母源抗体而获得对某种病原的免疫力属于A．先天性免疫 B．天然被动免疫 C．天然主动免疫 D．人工被动免疫 E．人工主动免疫48. 从细菌或病毒中提取蛋白成分制备的疫苗属于A．重组疫苗 B．弱毒活疫苗 C．基因缺失苗 D．亚单位疫苗 E．合成肽疫苗49. 检测敏感度可达到皮克(pg)级水平的免疫学技术是A．对流免疫电泳 B．免疫荧光抗体技术C．SPA协同凝集试验 D．放射免疫分析技术E．免疫酶组化染色技术50. 100头仔猪中有40头发病，其中20头死亡，其病死率为A．20% B．40% C．50%D．60% E．80%。
脾脏分离淋巴细胞
从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。
２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。
室温水平离心2000转/分钟，30分钟。
３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。
吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。
４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。
方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。
加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。
采用淋巴细胞分离液进行成年猪胰岛细胞纯化的研究
灌注充分的猪胰尾纯化后的胰岛 （ ４ ＊０） 图１成年猪胰腺的灌注和胰岛分离纯化结果 ２ 胰岛纯化前后的数量和当量结果如下 ： ） 纯化前胰岛收获量为 ： 岛数， 胰 ｇ 胰腺８ ４ ± ４ ８（Ｅ ： ２ ± ２９ ５ ８ １０ Ｉ Ｑ５ ３ ３６ ３ 个倌）； 纯化后胰岛收获量为 ： 岛数 腺７ ８ ±１９ ， （Ｅ ： ８ － ２ ８ 胰 胰 ８ ６ ６７ ＩＱ ９ ７ － ７ ４ ４ ２ ＋／ ｇ）。 ３ 所得胰 岛纯度很高 ，为９ ％以上。 ） ５
患者也是移植研究的—个热门方向。 文献报道成年猪和胎猪等的胰岛分离 、纯化较多，但是均存在Байду номын сангаас岛 纯度不高，试剂配制 比例不统一 、操作 复杂等问题；本研究将采用一种 淋 巴细胞分离液进行成年猪胰 岛的分离纯化 ，得到了纯度和量均较高的 胰岛，为进一步胰岛移植研究打下基础。
４）胰岛纯度测定 ：纯化后的胰岛计数 时，用显微镜下胰腺组织总 面积中胰岛的面积所占的 比 例定为纯度。 ５ 统计学处理数据采用均数五± 表示 ，使用Ｓ Ｓ １． ） ｓ Ｐ Ｓ ０ １ 软件分析处
ｉｄ ｉ ａ ｉ ｅ ［ ．ｅ Ｔ ａ ｓｌ ｔ ｉ ， ０ （２： － １ ｎ ｉ ｄ ｌｓ ｔ Ｊ Ｃ ｌ ｒｎｐａ ａ ｏ ２ ３１） ３ ４ ． ｖ ｕ ｌｓ ］ ｌ ｎ ｔｎ ０ ３
作 者简 介 傅红 兴 （ ９９ ），男 ，讲 师 ，长期从 事微囊化胰 岛移植研究 。 １７ 一
理。
３ 结 果 １ 灌注充分的胰腺外观呈葡萄状 ；采用新的纯化液纯化 ， ） 得到 的 胰 岛量很多，而且纯度非 常高 （ 图１ 如 ）。
１ 动物 、试剂 与器材
１ 动物 ： ） 成年杂种猪 ，雌雄不限 ；猪龄６ ７ ，体重１ ～ ０ｋ ， ～Ｂ ０ ２ ０ｇ ０ 温州篮子集 团禽畜屠宰场提供。 ２）试剂 ：胶原酶Ｖ ｓ ｍａ ｉ 公司 ；双硫 腙 （ Ｔ ｇ Ｄ Ｚ）上海 试剂三 厂 ； Ｆｃ ｌ Ｐ ｑ ｅ Ｌ Ｓ（ Ｅ Ｈｅｈ ｃｒ ｔ． ｉｏｌ ａｕ Ｔ Ｐ Ｕ Ｇ ａ ｈ ａｅＬｄ ）；ＨＥ Ｅ Ｓ ａ ｇ ａ ｍｙ — Ｍ Ｐ Ｓ（ ｈ ｎ Ｈ ｉ Ｍｄ Ｓｉ ｃ Ｔ ｃｎｌ ｉ ． ｄ）；青一 ｃ ｎｅ ｅｈｏ ｇ ｓ ｔ ｅ ＆ ｏ ｅＬ ． 链霉素溶液 （ ０ ｘ １Ｏ ）、Ｒ Ｍ １４ 吉诺 Ｐ Ｉ６０（ 生物 医药技术有限公司 ）；Ｄ 酶 （ ＮＡ 包头生物制剂公 司 ），Ｅ ｒ— ｏｉｓ ｕｏｃｌｎ ｌ 液、Ｈ ｎ ｓ ａｋ液、Ｄ Ｈａｋ ￣实验室 自制。 — ｎ￣ ３ ）实验器材 ：立式 电热压力蒸汽灭菌器 ：Ｌ Ｚ 一 ０ Ａ，上海 申安 Ｄ Ｘ ３Ｋ 医疗器械厂 ；电热恒温振荡水槽 ：Ｄ Ｚ ４０ ，上海森信 实验仪器有限 Ｋ －５Ｂ 公 司； 倒置显微镜 ： Ｄ 一 Ｂ Ｌ Ｍ Ｕ ；荧光显微镜 ：Ｏ Ｙ Ｐ Ｓ Ｘ Ｓ １ ，Ｏ Ｙ Ｐ Ｓ Ｌ Ｍ Ｕ ；光 学显微镜 ： Ｓ Ｏ ，Ｎｋｎ ＹＩ ０ ｉ ；洁净工作 台：Ｈ ＬＡ ｐｒ ｕ；低温离心机和 ｏ Ｄ ｐａ ｔ ａｓ 二氧化碳培养箱 ：Ｔ ｅｍ ｌ ｔｎＣｒｏａｏ 。 ｈｒｏ ｅ ｒ ｏｐｒ ｎ Ｅ ｃｏ ｉ ｔ
脾淋巴细胞分离
小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1. 熟悉细胞分离的基本原理2. 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3. 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。
丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。
通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。
2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。
人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。
三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0.2%台盼蓝染液8.显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。
2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。
（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。
用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。
弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。
然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。
(放置冰上)4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。
两种方法分离小鼠脾原始T淋巴细胞效果比较
生猪屠宰检疫中腺体和淋巴结的摘除
生猪屠宰检疫中腺体和淋巴结的摘除核心提示：河南省南阳市城区动物卫生监督所胡俊兰，张玉全，高力河南省南阳黄牛科技中心王海利根据国家有关规定，在生猪屠宰检疫中，应严格摘除三腺，即：甲状腺、肾上腺和病变淋巴结。
但仅摘除此三腺是不够的，其它腺体和根据国家有关规定，在生猪屠宰检疫中，应严格摘除三腺，即：甲状腺、肾上腺和病变淋巴结。
但仅摘除此三腺是不够的，其它腺体和淋巴结同样对人体无益。
摘除三腺的同时，也应摘除其它无益腺体和淋巴结。
其它腺体和淋巴结的内容、位置、大小、颜色、作用、危害、处理如下。
1 其它腺体和淋巴结唾液腺（分三对发达的腮腺、颌下腺和舌下腺）、胰腺、血淋巴结（水淋巴结）、扁桃体、胸腺、脾脏。
这些腺体和淋巴结随内脏或肉尸进入餐桌，有的人甚至将扁桃体和脾脏当作佳肴，这是习惯的误区。
胰腺、扁桃体、胸腺可作为生化原料。
2 其它腺体和淋巴结的结构、位置、大小、颜色2.1 唾液腺分为三对发达的腮腺、颌下腺和舌下腺。
由被膜和腺实质构成，被膜是一层疏松结缔组织，伸入腺实质，腺实质主要由腺泡和导管组成。
腺泡是腺体的分泌部，由一层椎体形腺细胞围成。
导管是分泌物排出的管道系统。
2.1.1 腮腺埋于耳根腹侧，下颌骨后缘的脂肪内，经下颌骨下缘转至面部，开口于第4、第5上臼齿相对颊黏膜上。
其范围较广，面积较大，重约300 g，呈三角形，棕红色。
2.1.2 颌下腺位于腮腺深面，颌下腺管在下颌骨内侧向前伸延，开口于舌系带两侧的口腔底的黏膜上，其大小如鸡蛋，致密，呈扁圆形，略带红色。
2.1.3 舌下腺位于舌体和下颌骨之间的黏膜下。
分为两部，前部较大，为多管舌下腺，其长而薄，后部为长管舌下腺，其短而厚。
2.2 胰腺具有明显的小叶结构，与唾液腺相似，其导管有两条，直接开口于十二指肠。
其呈三角形，重约500 g，呈灰黄色，柔软。
2.3 血淋巴结（水淋巴结）其分布在血管丰富处，如脊椎下、腰部两侧、腹腔、骨盆腔等处。
水淋巴结是在整个屠宰过程中，由于各种因素直接或间接作用于猪体，如：机械损伤、长途运输使机体过于疲劳、各种应激反应、电压电流过大等造成的浅表淋巴结水肿。
20100528 猪常见病原实验室检查及分离培养方法
病原名称
流行性腹泻病毒
样品种类
采样方法
采病仔猪空肠一段置灭菌的平皿中，刮取肠内容物及空肠粘膜，用含有1000U/ml青霉素和1000ug/ml链霉素的PBS液做5倍稀释制成悬液，4℃条件下3000rpm离心30min，取上清液，经0.22um微孔滤膜过滤，用于细胞培养接种。
圆环病毒病
病原名称
支气管败血波氏杆菌菌落不变红，直径约1－2cm，光滑、圆整、隆起、透明，略呈茶色；较大的菌落其中心较厚且凹陷，有的菌落在凹陷处有皱褶成茶褐色，对光观察呈浅蓝色。
分离多杀性巴氏杆菌的马丁琼脂平板，于37℃培养18－24h。多杀性巴氏杆菌菌落直径约1－2cm，圆整、光滑、隆起、透明，菌落单个或呈粘液状融合成菌苔。
圆环病毒
样品种类
采样方法
取病料（肺或和淋巴结），研磨粉碎（与PBS1：5），－20℃反复冻融3次，10000rpm离心15min，上清液用氯仿抽提3次，然后用灭菌的孔径为0.22um微孔滤膜过滤，分装，－70℃保存。用于接种细胞。
兰耳病
病原名称
PRRS病毒
样品种类
采样方法
采集病猪、疑病猪、新鲜死胎或活产胎儿组织的病料，哺乳仔猪的肺、脾、脑、扁桃体、支气管淋巴结、血液和胸腔液。木乃伊胎儿和组织自溶胎儿不宜进行病毒分离。用含抗生素的维持液（含2%胎牛血清的MEM营养液）做1：10稀释，4500 rpm离心30 min，经0.45nm滤膜过滤，上清液用MEM做1：30稀释，制成悬液，供分离病毒接种之用。
猪副伤寒
细菌名称
猪沙门氏菌
样品种类
采样方法
最好将死后12h内的猪整体送检。或无菌采取心血、肝、脾、淋巴结等，放置于30%甘油盐水中送检。
培养基
小鼠脾脏B淋巴细胞纯化培养方法的建立
小鼠脾脏B淋巴细胞纯化培养方法的建立李文娟;邹家琦;韩欣欣;田志辉;刘杰;李海东【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(000)002【摘要】背景：B淋巴细胞是机体免疫系统重要的参与者，目前的研究主要采用磁珠、补体等方法进行B淋巴细胞的分离纯化，但是这些方法费用高或者细胞损伤大、纯度低，体外分离、培养B淋巴细胞的方法还有待进一步改进。
目的：探讨从小鼠脾脏细胞中对 B 淋巴细胞同时进行分离、培养的方法。
采用加入白细胞介素4、脂多糖或者CD3单克隆抗体及其组合，探讨体外分离、培养小鼠脾脏B 淋巴细胞的适宜条件。
方法：体外分离培养小鼠脾脏细胞，随机分为7组，分别用白细胞介素4，CD3，脂多糖，白细胞介素4+CD3，白细胞介素4+脂多糖，CD3+脂多糖组进行干预、将未给予刺激的脾细胞作为对照组。
用流式细胞仪检测在不同培养条件下小鼠脾脏细胞T、B淋巴细胞及其亚群的变化。
结果与结论：与对照组比较，白细胞介素4组淋巴细胞在培养后第3-5天数量达到高峰；脂多糖组在培养初期无明显作用，第3天开始淋巴细胞数量有明显的增加，第5天达到高峰；培养体系中加入CD3单克隆抗体，可导致T淋巴细胞消失，培养2 d后，可得到较为单一的B淋巴细胞，其细胞数量在第3天达到高峰。
其中B220+IgD+成熟B淋巴细胞亚群数量显著增加。
体外培养24 h后，各组B220+CD93+Transitional B淋巴细胞亚群均完全消失。
结果说明，体外培养的小鼠脾脏细胞加入CD3单克隆抗体和白细胞介素4可以去除T淋巴细胞，并维持成熟B淋巴细胞的生存和增殖。
%BACKGROUND:B-lymphocytes are an important participant in the immunity system. Currently, magnetic beadsand complement methods are mainly used to isolate and purify B-lymphocytes. However, these methods are costly or cause large cel damage and low purity, which need further improvement. OBJECTIVE: To explore the isolation and culture methods of B-lymphocytes from mouse spleen and to study suitable conditions for B-lymphocyte isolation and culture in vitro by using interleukin-4, lipopolysaccharide, CD3 monoclonal antibody or their combination. METHODS:B-lymphocytes from mouse spleen were isolated and randomly divided into seven groups, respectively treated with interleukin-4, CD3 monoclonal antibody, lipopolysaccharide, interleukin-4+CD3, interleukin-4+lipopolysaccharide,CD3+lipopolysaccharide, and no stimulation (control group). Flow cytometry was used to detect the changes in the number and proportion of T-lymphocytes, B lymphocytes, and their subpopulations under different culture conditions. RESULTS AND CONCLUSION:The number of lymphocytes peaked at 3-5 days after addition of interleukin-4. In the lipopolysaccharide group, the number of lymphocytes began to increase at 3 days, and then peaked at 5 days. T-lymphocytes disappeared after addition of CD3 monoclonal antibody, so relatively pure B-lymphocytes could be obtained after 2 days and the number of B-lymphocytes reached the peak at 3 days. The number of mature B-lymphocytes (B220+IgD+) increased significantly after addition of CD3 antibody. In al the conditions we tested, transitional B cel subset (B220+CD93+) disappeared completely after 24 hours of culture. Experimental results indicate that after addition of CD3 monoclonal antibody and interleukin-4, T-lymphocytescan be removed in mouse spleen cels cultured, but mature B-lymphocytes remain to survive and proliferate.【总页数】6页(P207-212)【作者】李文娟;邹家琦;韩欣欣;田志辉;刘杰;李海东【作者单位】天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，天津市300070;天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，天津市 300070;天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，天津市 300070;天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，天津市 300070;天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，天津市 300070;天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系，天津市 300070【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.小鼠子宫内膜细胞对小鼠脾脏淋巴细胞和山羊PBMC转化与分泌活性的影响 [J], 周丽梅;贺亚媚;牛雅静;付胜勇;靳亚平2.小鼠脾脏B淋巴细胞纯化培养方法的建立 [J], 李文娟;邹家琦;韩欣欣;田志辉;刘杰;李海东;3.TCA对小鼠脾脏T B淋巴细胞和T淋巴细胞亚群变化的影响 [J], 王彩云;李培锋;刘明强;李成应;关红4.抗痨颗粒剂对小鼠胸腺皮质厚度、淋巴细胞数及脾脏淋巴细胞数的影响 [J], 秦俊莲;张卫红5.小鼠脾脏自然杀伤性树突细胞纯化方法的比较 [J], 陈蓉明;郑秋红;龚福生;应敏刚;谢云青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪脾脏淋巴细胞分离
五、注意事项
• 往分离液加组织液时，要沿着管壁，缓慢
加入，避免它们互混。
• 密度梯度离心后，弃去上层血浆时，要尽
量轻，切勿打破形成的分层。
• 细胞计数时，要等量加入细胞悬液和台盼 蓝染液，结果也要2倍。
• 整个实验操作要尽量快，避免细胞过度死 亡。
思考题
• 1、台盘蓝染液如何配置？
• 2、你认为本次试验成败的关键因素是什么 ？应该怎样把握？
• 红细胞、粒细胞比重大，约为1.090，离心后沉于 管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分 层液比重，约为1.075，离心后漂浮于分层液的液 面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中；血小 板的比重最小，约为1.030，离心后浮于分层液上 面。
• 借助密度梯度离心，吸取分层液液面的细胞，就 可从外周血中分离到单个核细胞。
猪脾脏淋巴细胞分离与细胞计数
华南农业大学生命科学学院微生物学教研室 张玲华课题组
一、实验目的
• 掌握密度梯度离心的原理及方法 • 掌握细胞计数板的工作原理及使用方法
二、实验原理
• 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 (商品名为淋巴细胞分离液) ,比重 1.077±0.001 。
• 倾斜地缓缓地 将你的组织液 沿着管壁加入 分离液(5mL) 上层，避免互 混。
密度梯度离心
← 分离的对象 在取淋巴细胞层的方法上，可以采用吸掉上层的血浆，或者直接缓缓从中间 吸出约2mL的淋巴细胞层。
取淋巴细胞层
• 弃去上层血浆
• 将中间的淋巴 细胞层（约 2mL）移到新 的离心管中
加入Hank’s液
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
三、实验材料
猪脾脏解剖实验报告(3篇)
一、实验目的1. 了解猪脾脏的位置、形态和结构；2. 掌握猪脾脏的解剖方法；3. 认识猪脾脏的生理功能；4. 培养学生动手操作能力和观察分析能力。
二、实验原理脾脏是猪的重要器官之一，具有血液净化、免疫调节、储血等功能。
通过对猪脾脏的解剖，可以了解其形态结构，掌握其生理功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜猪脾脏1个；2. 实验仪器：解剖刀、解剖剪、解剖镊、解剖板、显微镜等。
四、实验步骤1. 将猪脾脏放置于解剖板上，用解剖剪将脾脏表面皮肤剪去；2. 观察猪脾脏的形态、大小和颜色；3. 用解剖刀将猪脾脏横切成两半，观察其内部结构；4. 观察脾脏的表面和内部血管分布情况；5. 将猪脾脏横截面置于显微镜下观察，观察脾小梁、脾窦、脾细胞等结构；6. 记录观察结果。
五、实验结果与分析1. 猪脾脏呈扁椭圆形，位于腹腔左上方，与胃底相邻；2. 猪脾脏表面为红色，内部为紫红色；3. 脾脏表面可见丰富的血管分布，内部血管呈网状；4. 显微镜下观察，可见脾小梁、脾窦、脾细胞等结构。
1. 猪脾脏位于腹腔左上方，与胃底相邻，有利于对血液进行净化和免疫调节；2. 猪脾脏表面和内部血管丰富，有利于血液的运输和免疫细胞的分布；3. 脾小梁、脾窦、脾细胞等结构是猪脾脏的主要组织，具有血液净化、免疫调节、储血等功能。
六、实验结论通过对猪脾脏的解剖实验，我们了解了猪脾脏的位置、形态、结构和生理功能。
猪脾脏在血液循环和免疫系统方面发挥着重要作用，对于猪的健康和生长具有重要意义。
七、实验注意事项1. 实验过程中，应保持猪脾脏的完整性，避免损伤；2. 解剖过程中，应注意观察猪脾脏的形态、大小、颜色等特征；3. 解剖过程中，应注意观察猪脾脏的血管分布情况，以便了解其血液供应；4. 实验结束后，应将猪脾脏妥善处理，避免污染环境。
八、实验拓展1. 通过对猪脾脏的解剖实验，可以进一步研究猪脾脏的生理功能，为动物疾病防治提供理论依据；2. 可以通过比较不同品种、不同年龄猪脾脏的结构和功能，探讨猪脾脏的生物学特性；3. 可以将猪脾脏的解剖实验与其他器官的解剖实验相结合，进行综合性的生物学研究。