活性氧的检测方法

展。直到 1969 年 McCord 和 Fridovich[ 1] 发现 了清 除 超氧 化物 自由 基的 超氧 物 岐化 酶 ( SOD) 并研究其生物学作用, 提出了氧毒性 的超氧化物自由基学说后 , 人们才开始逐步 认识到自由 基在生物 体内存在 的危害 , 同 时 , 由于分子生物学的迅猛发展, 研究短寿 命的自由基的方法有所突破, 带动自由基生 物学的发展 , 使自由基生物学这门学科渗透 到医学、 植物生理学、 病理学等许多学科中, 显示出其极大的发展前景。 生物学、 医学最先研究活性氧的方法, 有脉冲射解 、 快速停流 、 顺磁共振和自旋 搜集技术 [
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第2期
陈惠萍等:
活性氧的检测方法
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SOD 作用的底物 , 故原则上许多检 测 SOD 的方 法, 如化 学 发光、 NBT ( 氮 蓝四 唑 ) 还 原、 细胞色素、 连苯三酚、 肾上腺素都可以用 来检测生物系统的 O2. , 但干扰因素很多, 实 际应 用时困难不 少[ 4~ 6] 。 1976 年 Elest ner 等 提出用羟胺氧化反应来检测生物材料 的 O 2. 。此法灵敏 度高, 专一性好 , 药 剂价 廉。能同时检测大量样品。但叶绿素等色 素含量严重影响比色测定。王爱国等 为 了消除这些干扰 , 对实验步骤进行了改进, 并在分离时以乙醚取代正丁醇 , 检测了四季 豆幼苗叶片 叶绿体在光 暗下衰老 过程 O2 产生速率, 其结果与 McRac 等
1
、 水稻
[ 17]
、 眉豆
[ 18]
等植物上观察到
的现象类似。 4
1
O2 的检测 早在 1930 年 , M ulliken 通过 分子轨道
的计算就已 预言单 线态氧的 存在, 但 直至 1963 年 Khan 和 Kasa 发现 可以 用 NaOCl 和 H 2 O2 反应来产 生单线态氧才 使该领域 研究 得以迅速发展。用于1 O 2 检测的 方法 有化学发光法、 猝灭剂抑制法、 在2 H 2 O 中延 长寿命法、 产物分析法等几种方法 。其 1 中最直接的检 测方法是观察 O2 的化学发 光, 这种方法需要聚集较大量的1 O2 才能检 测出来。使用1 O 2 猝灭剂抑制 1 O2 参与的反 应, 最常使用的是类胡萝卜素, 它以物理方 式或猝灭 1O 2 而自 身并不发生任 何化学反 应。此外还有叔胺、 维生素 E 、 氮化合物、 四 甲基 乙烯、 2, 5
摘要 关键词
简述近代植物组织活性氧的检测方法及其例证。 活性氧 自由基 检测
凡是含有不成对电子的分子、 原子或离 子都统称为自由基。所有的自由基都有极 高的化学活性 , 非常活泼, 具有很强的氧化 能力, 常常与相邻的物质迅速反应, 寿命极 短且浓度低, 可以发生链式反应。生物自由 基是通过生物体自身代谢产生的一类自由 基, 具备一般自由基所具有的上述特点。 生物 体内的 自由基 主要是 指活性 氧。 所谓活性氧就是氧的某些中间代谢产物或 含氧的衍生 物质, 具有比氧 更强的氧 化能 力。在植物组织中, 活性氧类型主要有: 超 氧阴离子( O2. )、 过氧化氢 ( H 2 O2 ) 、 羟自由基 ( OH ) 、 单线 态氧 ( 1 O2 ) 和脂质过 氧化自由 基( ROO ) 等。它们存在于植物细胞壁、 叶 绿体、 线粒体、 微粒体和细胞核等部位。在 正常情况下 , 活性 氧水平很 低不会引 起伤 害, 细胞内活性氧的产生与清除处于一种动 态平衡状态。一旦这种平衡被打破 , 就可能 产生伤害作用 , 首当其冲的就是膜系统, 导 致膜脂过氧化或脱脂化, 膜差别透性丧失, 离子大量外渗 , 引起一系列生理生化变化, 代谢紊乱 , 严重时植物死亡。 50 年代初期出现了自由基生物学 , 但由 于当时借助的是电子共振仪来研究自由基 , 其仪器昂贵 , 难于普及, 阻碍了这一学科的发
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。然
而, 这 些 方 法 均 不 能 定 量 测 定 生 物 体 内 OH 的含量。随后根据 OH 可使胸腺嘧啶 或胸腺嘧 啶核苷羟 化的原理 来测定 OH , 此法虽检测 OH 较专一, 但操作较繁琐, 药 品较 昂贵, 一般实验 室使用受 到局限。 80 年代末, Babbs 等
第 6卷 第 2期
V ol. 6 N o. 2
华南 热 带 农 业 大 学 学 报
JO U RN AL O F SOU TH CHIN A U N IV ERSIT Y O F TRO PICA L A G RICU LTU R E
2000 年 6 月
Jun. 2000
活性氧的检测方法
陈惠萍
( 华南热带农业大学农学院 海南儋州 571737)
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幼苗叶片叶绿体中由 1 O2 所介导的 NDA 漂 白作用明显加强, 这种漂白作用可为 1O 2 的 清除剂 Car 显著抑制, 而为促进 O 2 形成 的光敏化剂 RF( 核黄素 ) 和 NB( 亚甲基蓝 ) 所促进, NDA 的漂白与 Car 、 Chl 的 降解及 膜脂过氧化产物 MDA 的增加存在 极显著 的相关 关系。用以上 各种方法对 1 O2 进行 检测 的报 道尚 少, 也许是 1 O2 在体 内寿 命 短 , 难以检测的缘故。 5 脂类过氧化物( M DA) 的检测
9]ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1 OH 、 O2. 、 O 2 比较 而言, H 2 O2 是最稳 定的
活性氧。测定 H 2 O2 的方法较多 , 有碘滴定 法、 分光光度法、 化学发光法、 荧光法等测定 方法[ 3 ] 。由于过氧化氢酶和过氧化物酶可 以清除体内产生的 H 2 O2 , 故还可以通过测 定这 两类 酶的 活性来 估测 H 2 O 2 的水 平。 总的来说, 这些方法受到多种因素影响, 如 样品杂 质、 人 为因 素、 灵 敏 度 等。林 植 芳 等 在 M acNev in 等 及 P at terson 等 方法的基础上, 对 H 2 O2 含量测定进行了改 进 , 此法步骤为 : 叶片或叶绿体加冷丙酮提 取 , 然后取 1 mL 提取 液加 0. 1 m L 20 % T iCl4 浓 H Cl 液, 0. 2 mL 浓氨水。生成的过 氧化物 T i 复合物用 3 000 r/ min 速度离 心 10 min, 沉淀再用丙酮悬浮洗涤 5 次以减 少色 素 的 干 扰。最 后 将 沉 淀 溶 于 3 mL 1mol/ L H 2 SO4 中, 410 mm 波长 测定光 吸
2]
, 然而这些技术所需要的仪器
十分昂贵, 一般实验室无法购置。近代对活 性氧的检测虽有较大进展 , 但因活性氧在体 内活泼 , 产生的量相对较少 , 因此, 到目前为 止 , 活性氧的检测技术并未彻底解决 。这 无疑大大影响了研究活性氧的进展。为此, 寻找出简便、 易行、 可靠的活性氧检测方法, 将有助于活性氧在有关研究领域的开展。 1 O2. 的检测 最先用于检测 O2 的方法有: 电子顺磁 共振波谱分析法及酶学分析法等 。这些 方法局限性大, 灵敏度也不高。由于 O 2. 是
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法 , 他们利用这一方法成功地检测到百草枯 处理的水生植物浮萍( Lamnamin) 和多年生 野黑麦( LaL ium pererne) 中 OH 的产生, 并 且首次观察到生物系统中致死剂量的 OH 水平, 此法采用 DMSO 为 OH 的分子探针, 以 DMSO 与 OH 的 反应产 物甲基 亚磺 酸 ( M et hanesulfinic acid, MSA) 作为 OH 形成 的标志 : CH 3 SO CH 3 + OH ! CH 3 SOOH + CH 3 DM SO 与 OH 氧化后形成的单一而又 稳定的产物 M SA 易从组织中提取出来, 且 可用分光光度计测定。所以 DMSO 是捕获 OH 的理想分子探针 , 对 OH 检测来说 , 这 是个突破。首次直接检测生物体内活性氧 存在及实际水平 , 无疑为我们研究生物体内 活性氧的相互关系及调节机理奠定了基础。 但此法冗长而繁琐, 所用药剂毒性较大, 灵 敏度较低, 有待于我们在实验中不断改进。 3 H 2 O2 的检测 H 2 O2 在 化 学上 常 作 为 弱 氧 化剂 , 与
用电子自
旋共振检测结果规律相似。这两者各有优 点, 电子自旋共振法虽操作相对简便, 但所 用仪器昂贵, 而羟胺氧化法所需费用则要低 得多。运用羟胺氧化法时还必须严格控制 反应系统 pH< 8. 0, 并尽可能降低反应中的 溶解氧及铁含量 , 这样测出的 O 2. 产生速率 才更接近实际水平。 2 OH 的检测 由于 OH 是生 物 体 内最 活 泼 的活 性 氧, 寿命极短, 故给检测带来了困难。过去 人们主要是根据 SOD 和 CAT 对其产生的 抑制作用以及 OH 清除剂 ( 如乙醇 、 甘露 醇、 叔丁醇、 苯甲酸钠、 生育酚等) 对其产 生的 清除作用 等来估测 OH 水平。此 外, 还可用 DMPO ( 5, 5 二 甲基 1 吡咯 啉 N 氧化物 ) 作为自旋捕获剂进行电子顺 磁共振 ( EPR ) 自旋捕获以及检测蛋氨酸 形成乙烯的速率等估测 OH 的产生[
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发现了一 种新的方
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华南热带农业大学学报
第6卷
收。按同样程 序制备 H 2 O2 标准曲线。此 法简便快捷 , 易掌握易操作, 保证在较短时 间内 完成 对 H 2 O2 的检 测, 从而 提高准 确 度。许长成等 采用此法进行实验 , 证实 大豆叶片 H 2 O2 在干旱条件很快累积, 与在 黄麻
甲基 呋喃、 9, 10 二 苯基
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酮。O2 的寿命在 H 2 O 中比在 H 2 O 中长得 多, 故在 H 2 O 中寿命延长法可以确定某个 反应是否产生1 O 2 或有1 O2 的参与。产物分 析法也可以用于1 O2 的检测。有人认为1 O2 的检测比其它活性氧困难。在微粒体等完 整细 胞器中检测 1 O2 已 获得成功。但 在植 物方面, 尤其是完整叶绿体中 O2 的检测仍 然不完善。蒋 明义等 [ 20] 参照 Chakraborty 和 T ripat hy [ 21] 所采用的方法 , 以 H is( 组氨 酸) 作为1 O2 的分子捕获 剂, 用分 光光度法 检测 NDA( 对亚硝基二甲基苯胺) 的漂白反 应作 为1 O2 产生的指标。检测了水稻 叶绿 体中1 O 2 的产生 , 实验证实, 在- 0. 8MP a 渗 透胁迫及 250 mol. m