重组质粒的转化

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：
在电场的作用下线性 蛋白质链在聚丙烯酰 胺凝胶介质中向正极 移动，移动的速率主 要取决于其分子量大 小（链的长短），从 而把不同分子量的肽 链分开。
电泳buffer 电泳buffer
点样
电泳方向
Dalton
凝胶中的蛋白质染色： 1）直接染色 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可 褪色回收。
1983年，世界上第一例转基因植物在美国成功 培植，当时就曾有人惊呼：“人类开始有了一双创 造新生物的‘上帝之手’。”有人预言，21世纪将 是转基因作物的一个转换期，科技含量将有很大的 提高。
• 转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入 到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起 生物体的性状的可遗传的修饰。人们常说的“遗 传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转 基因的同义词。
DNA电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分
子量大。
Marker 重组子 载体
直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆中分离质 粒，电泳、比较其分子量。
根据重组DNA分子大小鉴定重组子
原理：有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体 DNA之间的大小差异。
基本方法：提取转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离 ，电泳迁移慢的带是重组DNA的带。 此法是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法 ，只适用于重组子的初步鉴定。
操作步骤
• 取100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面 的操作)，加入10 µl重组质粒DNA(体积不超过10µl)+ 100µl感受态 细胞
• 将以上样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－ 2min，然后迅速冰上冷却2min
• 立即向上述管中分别加入 LB液体培养基（不需在冰上操作），摇匀 后于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使 转化体表达抗生素基因产物。
• 克隆是对单体的复制。转基因技术可以保持生物基因的多 样性，而克隆却没有什么帮助，反而有一定的威胁。
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克隆羊“多莉”的产生过程
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转基因食品
• 以转基因生物为原料加工生产的食品。 • 根据原料来源：动物源、植物源、微生物源 • 根据功能：增产型、控熟型、高营养型、保健型、新品种
型、加工型 • 最初目标：保护作物 • 风险评估：环境和人类健康
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“选择性繁殖”技术
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植物转基因方法
• 直接基因转移方法:基因枪法、 PEG介导的原生质 体法、花粉管通道法、电激转化法等，其中基因 枪转化法是代表。
• 生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒 介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法 操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子 叶植物的遗传转化。
• 该方法简便、快速、稳定 • 将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液
中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，
CaCwk.baidu.com2法制备感受态细胞
影响因素
• 细胞的生长状态：对数生长期 • 试剂质量：分析纯 • 杂菌和杂DNA污染：所用器皿、试剂均需灭菌 • 温度：冰上操作
转化
• 实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培 养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样， 一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载 体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，长成 白色菌落。
转基因技术
• 什么是转基因技术？
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花粉管通道
花粉管通道法是指在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利 用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵 细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而 成为带转基因的新个体。
该方法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不 需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。
筛选原理
• IPTG可以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体 平板培养基中菌落呈现蓝色。当外源DNA（即目的片段）与含lacz' 的载体连接时，会插入进MCS（即靶基因），使α肽链读码框破坏， 不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色， 培养表型即呈现白色菌落。
• 1996年，世界种植转基因农作物的面积为700万 公顷。到1999年增加到7500万公顷，美国占了 74%，中国只占1%。
• 2000年美国基因农作物产品的销售额达950亿美 元。植物基因工程源源创造新品种，转基因食品 的增长是无限的，将不断推进经济增长。
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重组子的鉴定及基因表达产物的分析
• 琼脂糖凝胶电泳检测 • 聚丙烯酰胺凝胶电泳 • SDS-PAGE • 核酸分子杂交
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
2）转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
核酸分子杂交技术
核酸分子杂交的基本原理
变性
复性
• 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下
DNA-DNA 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交双链分子 • 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知
核酸序列且已标记的DNA或RNA,称探针。
在含抗菌素 和Xgal的培 养基上培养
在含抗菌素 和Xgal的培 养基上培养
无菌斑 生长
有蓝色 菌斑生 长
带外源DNA插 入的质粒转化 的受体菌
载体产物失活，不 能互补-半乳糖苷 酶的缺失。不能分 解Xgal，但有抗菌 素抗性
在含抗菌素 和Xgal的培 养基上培养
有白色 菌斑生 长
抗生素抗性筛选
感受态
• 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA 的生理状态。它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、 外界环境等因素有关。
感受态细胞制备方法及原理
• 目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可 以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过 CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。
提高转化效率的方法
• 感受态质量 • 质粒DNA的相对分子质量和浓度 • 防止杂菌和杂DNA污染
重组子的筛选
• 转化后的细胞在筛选培养基中培养，可筛选出转化子
蓝白斑筛选
• 蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生 型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal 切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可 以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛 选的最直观有效的方法。
农杆菌介导的植物转基因技术
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农杆菌介导的植物转基因技术
感染 转化
选择
再生
转基因植株评价与鉴定
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转基因和克隆技术
• 克隆是将一个体细胞的DNA移入一个已经被去掉细胞核 的卵细胞中，然后刺激这个改造后的卵细胞，使它开始分 裂并成为一个胚胎，这个胚胎的基因与体细胞提供者的基 因完全一样。
• 关于转基因，通常因有性生殖造成同种生物个体之间遗 传物质的重组.
（1）对人类健康的直接影响（毒性）； （2）引起过敏反应的趋势（过敏性）； （3）被认为有营养特性或毒性的特殊成分； （4）插入基因的安全性； （5）与基因改良有关的营养效果； （6）由基因插入产生的任何非预期影响。
基因产品的开发现状
转基因食品的开发
• 美国55%的大豆是转基因产品，40%—50%玉米 是经过基因工程改变过的。美国超市上有4000多 种食品含有转基因成份。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷 的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
方法及原理
• 热激法：使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，细 胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞 表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。此时 ，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞 膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外 源DNA就可能被细胞吸收。
• 杂交有固一液相杂交和液相杂交。
2.1 探针（Probe)的概念:
一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序 列。
4.1 Southern 印迹杂交
此技术由Southern 1975年首先设 计。被检测对象为DNA。
限制性酶切割
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
• 是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA 而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。
• 在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热 激或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。
• 进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的 遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出 重组子。
基因工程和选择性繁殖技术有什么不同
• 转基因技术与选择性繁殖都会改变生物的基因。 • 转基因技术可以实现基因在不同物种之间的传递
和流动。可以实现物种间的基因转移。 • 转基因技术转移的基因更明确，更有目的性。 • 选择性繁殖实验过程缓慢。基因工程技术筛选优
良品种的周期更短，利用基因工程，可以很容易 地进行物种的杂交。
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
凝胶
滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印迹杂交的技术流程
凝胶
滤
玻 璃
纸板
白瓷盘
尼龙膜
滤纸
吸水纸
玻璃板
重物
吸水纸转膜
。
真空转膜
-
凝胶
尼 龙 膜
滤 纸
真空转膜槽
+
盖子
IPTG诱导的结果： MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。
通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有 DNA插入。
无质粒的 受体菌
质粒转化 的受体菌
-半乳糖苷酶部分 缺失，不能分解 Xgal；无抗菌素抗 性
-半乳糖苷酶的缺失 被载体产物互补， 能分解Xgal。且有抗 菌素抗性
重组质粒的转化
• 外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，重组的 DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存 在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体 分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态 细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通 过各种方法筛选出重组子，并可通过酶切电泳进行重组子 的鉴定。