酵母菌的分离纯化.

酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵

第一部分酵母菌的分离纯化

一、实验目的

应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。

二、实验原理

酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。

三、器材和用品

1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。

2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组

3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为5.5左右，再分装试管9ml2支/组。

4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。

四、实验方法

1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。

2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。

3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。

4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取0.1ml 加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。

5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后

分离得到单个菌落。

6、镜检：挑取单菌落，制片观察其形态。

7、菌种保藏：接种酵母菌到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，长出菌苔后冰箱保藏。

第二部分酵母菌的固定化技术

一、实验目的

1.了解固定化细胞的原理。

2.掌握用海藻酸钠制备固定化酵母细胞的方法。

二、实验原理

固定化细胞技术是指用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，并使其保持催化活性、反复使用的方法。优点：细胞密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、可反复使用、能实现连续操作，可大大提高生产能力。用于生产各种胞外产物，包括酒精酒类、氨基酸、有机酸、酶、辅酶、抗生素。

细胞固定化的方法有多种，如吸附法、交联法和包埋法等。吸附法：又叫载体结合法，依据带电的微生物细胞和载体之间的静电、表面张力和黏附力的作用，使细胞固定在载体表面和内部；简便，活力损失小；但细胞与载体作用力小，易脱落。交联法：利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团（如氨基酸、羟基、咪唑基等）发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其结合力是共价键。此法制备麻烦，活力损失较大；但细胞与载体结合较紧。包埋法：分为凝胶包埋法和半透膜包埋法。凝胶包埋法是将细胞包埋在各种凝胶内部的微孔中而使细胞固定；半透膜包埋法是将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内。简单，条件温和，稳定性好，包埋细胞容量高。

工业上常用包埋法固定微生物细胞。海藻酸盐是一种广泛应用的固定化介质，具有化学稳定性好、无毒、包埋效率高且价格低廉等优点。在海藻酸钠呈溶液状时，将细胞加入混匀，然后在氯化钙中凝固形成海藻酸钙凝胶，凝胶颗粒中的微小空格将细胞固定。海藻酸钙凝固的颗粒能反复使用，细胞在空格中可以新陈代谢（固定活细胞)。

三、实验材料

1、分离的酵母菌。

2、培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖30g，蒸馏水1000m L，p H自然，115℃灭菌20m i n。

3、试剂：0.2m o l/L氯化钙溶液150m l/瓶（22.2g氯化钙，蒸馏水1000m L）、

2%海藻酸钠50m l/瓶：称取一定的海藻酸钠加入无菌烧杯中，先加少量水调成糊状，在不足水份适当加热融化。

4、器具：200m l无菌烧杯1个、玻璃棒1根、无菌注射器1个（20m l）、无菌吸管1支，无菌水200m l/三角瓶、10m l培养基试管1支、200m l三角瓶培养基1个、青霉素、天平、纱布、细绳、电炉、培养箱、棉塞等。

四、实验步骤

1、将酵母菌接入10m l培养基中,于30℃培养箱中培养24h后待用。

2、取3m l酵母菌培养液（预热到35℃左右）加入到50m l2%海藻酸钠溶液中（冷却到45℃左右），均匀混合后用注射器吸入制成小球滴入150m l0.2m o l/L 氯化钙溶液中，搅拌成珠（固定酵母）。

3、待凝胶珠在氯化钙溶液中浸泡30m i n后，用蒸馏水洗涤固定酵母2次后，再转入到灭过菌的200m L液体培养基中（其中加入1m g青霉素）。

4、将固定酵母于28℃静置培养3天后观察，可见培养基中有大量的C O2气泡产生，嗅气味有酒香；用刀片切开固定酵母，镜检可见大量密集的酵母菌。

第三部分酵母菌的酒精发酵

一、实验目的

1.掌握酵母菌生产酒精的方法。

2.了解酒精发酵的主要类型及其控制条件。

二、实验原理

在厌氧条件下，己糖分解为乙醇并放出二氧化碳的作用，称为酒精发酵作用。酒精发酵的类型有三种：即通过E M P途径的酵母菌酒精发酵、通过H M P途径的细菌酒精发酵（即异型乳酸发酵）和通过E D途径的细菌酒精发酵。在工业酒精和各种酒类的生产中，酒精发酵的主要作用是由酵母菌来完成的。

酵母菌通过E M P途径分解己糖生成丙酮酸，在厌氧和微酸性条件下，丙酮酸继续分解为乙醇。但是，如果在碱性条件下或在培养基中加入亚硫酸盐时，产物主要是甘油，这就是工业上的甘油发酵。因此，如果酵母菌要进行酒精发酵，就必须控制发酵液在微酸性条件下。

三、实验材料

1、菌种：分离的酵母菌。

2、培养基：

白糖（蔗糖）80g、(NH

4)

2

SO

4

2.0g、KH

2

PO

4

1.0g、H

2

O 1000ml；pH自然，115℃

灭菌20m i n。

150m l三角瓶装上述培养基50m l，250m l三角瓶装培养基100m l，大试管中装一个注满培养基的杜氏小管，再装入10m l培养基。