实验一 酶的提取

实验一酶的提取及活力测定

实验目的

掌握酶提取的一般方法

了解不同因素对酶活力的影响

掌握测定酶活力的方法

实验原理

多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，是组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用。

PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌，邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成，色素分子量愈高，颜色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。

本实验将采用苹果为主要材料，通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、有机溶剂沉淀等步骤获得PPO的粗酶液，并对酶活力进行测定。

实验步骤

1.苹果洗净后，在4℃保温，去皮取果肉200g，立即加入冷冻丙酮500ml，用高速组织捣

碎机匀浆2min，用布氏漏斗抽滤，滤饼用200ml冷冻丙酮再次提取抽滤，白色粉末冷冻真空干燥，即得PPO丙酮粉。

2.称取丙酮粉0.5g，溶于250ml 0.05M、pH6.8的预冷（4℃）磷酸盐缓冲液，用磁力搅拌

器搅拌20min，5000rpm离心10min，上清液过滤，即得PPO粗酶液。

3.酶活性测定：

取酶液1ml，加入3ml反应混合液（2.0ml 0.1MpH6.5磷酸缓冲液、0.6ml 1%邻苯二酚溶液、0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37℃恒温水浴10min，立即加入6M尿素3ml终止反应，4000rpm 10min 取上清液。在460nm处于1-2min内测吸光值，空白对照中用缓冲液代替反应液中的邻苯二酚。

4.计算以每克样品每分钟内A460吸光值增加0.1为1U

酶活力=A460*酶提取液总量（ml）/（0.1*反应时间*样品重量*测定用酶液量ml）(按齐莹组的数据进行计算)

思考题：

除了用有机溶剂沉淀酶外，还可以用什么样的方法沉淀酶？

实验二酶提取液中蛋白质含量测定

实验目的

学习紫外分光光度计的使用方法

掌握紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理和方法

实验原理

由于蛋白质中存在含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，最大吸收峰在280nm处。在此波长范围内，蛋白质溶液的吸光度与其浓度成正比关系，可作定量测定。

实验操作

1.标准曲线的绘制，取四支试管，按表编号并加入试剂

加完后混匀，用紫外分光光度计测A280，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图，绘出标准曲线

2，取酶提取液1.0ml，加蒸馏水3ml，混匀，测A280nm，利用标准曲线算出蛋白质浓度。思考题

本法与其他蛋白质定量法相比，有哪些优缺点？

实验三酶的固定化及固定化酶测定

实验目的

掌握酶固定化方法

熟悉酶固定化效率的衡量指标

实验原理

凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定性状的固定化酶或固定化菌体。常用的凝胶有琼脂、海藻酸钙、明胶、聚丙烯酰胺等。本实验把脲酶用聚丙烯酰胺凝胶包埋起来制成固定化脲酶。

固定化酶活力回收率是指固定化酶的活力与用于固定化的溶液酶的活力之百分比。固定化酶活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种。常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶，放在一定形状、一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定时间，取出一定量的反应液，进行活力测定。

脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH7.0。氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，可用于测定酶活力大小。

实验用具（自己写）

实验步骤

1.称取丙烯酰胺

2.5g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺0.5g，溶于30mlpH=7.0的磷酸盐缓冲液中。

2.取上述溶液10ml于烧杯中，冰水浴下加入100mg脲酶，搅拌均匀，加入0.5ml10%过硫

酸钾溶液和0.5ml10%亚硫酸氢钠溶液，待聚合反应完成后，即得含酶凝胶。

3.待凝胶充分固化后，切成2mm-3mm见方的小块，反复水洗后，用干滤纸吸干水，称重。

4.将所得凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。取固定化脲酶0.3g，切碎。

5.取两支比色管（3号样品管、1号空白管），分别称取固定化酶100mg（m2）置于两管中，

各加蒸馏水9.0ml，磷酸缓冲液1.0ml，塞好管塞，于30℃保温5min

6.向3号管中加入30℃预保温的3%尿素溶液1.0ml，并准确开始计时，向1号管中加蒸

馏水1.0ml，塞好管塞。在30℃的恒温水浴中反应20min，并不断振摇。

7.酶反应管反应20min后准时加入1.0ml 1MH2SO4终止反应，空白管同样操作

8.取3支干净干燥试管编号（2号为标准氨溶液，1号、3号与上对应）。3号管：吸取酶

反应液0.1ml，加蒸馏水4.40ml，纳氏试剂0.5ml，摇匀。2号管：吸取空白反应（1号）

液0.1ml，加水4.30ml，加水0.1ml，纳氏试剂0.5ml，摇匀。1号管：吸取1号管反应液0.1ml，加入标准氨溶液0.1ml，纳氏试剂0.5ml，摇匀。30min内，在480nm波长下比色测试吸光度，分别即为A1(空白)、A2(标准)和A3(样品)。

定义脲酶在30℃，中性条件下，每分钟水解底物产生1umol氨的酶量为1U。

2.溶液酶活力测定

称取脲酶100mg溶于10ml磷酸缓冲液中，加入3%尿素1ml，反应后从中取出反应液

0.2ml，加入蒸馏水4.30ml，加入纳氏试剂0.5ml，混匀在30Min内测定吸光值。（也需

要样品、空白及标准管）

3.计算

100mg脲酶粉所得固定化酶的总活力（U1）

U1=（A3-A1）*m1*V1*NH3的微摩尔数*n/{(A2-A1)*m2*V2*t}

100mg脲酶溶液的总活力（Us）

Us=（A3-A1）*m1*V1′*NH3的微摩尔数*n/{(A2-A1)*m2*V2′*t}

固定化酶的活力回收率=U1/Us*100%

实验四酶的纯度检测