工业微生物资源的保藏
菌种的保藏与复壮
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
• (2)保护剂 不同种类的保护剂对不同
微生物的作用是不同的，如个别菌种在 脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达 99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时 死亡率大大减少。一般情况下，那些容 易保存的菌种对保护剂的要求不很严格， 而不易保存的菌种对保护剂的要求却很 苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干 燥保存菌种的关键因素。
(六)真空冷冻干燥法
• (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是 新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂， 用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养 基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种， 则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细 胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。 悬液中菌数要求达到10 8～10 10cfu/ml 为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分 装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部， 装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六)真空冷冻干燥法
• (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-
30～40℃下冻结20～60min，也可以用干冰和无水 乙醇冻5～10min。
• (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始
抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下， 并尽快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加 速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。 干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而寂， 以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时 是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空 载时最高真空；样品温度与管外温度接近。 完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频 真空检测真空度。
微生物菌种保藏方法及关键技术
目录
01 一、微生物菌种保藏 方法
02
二、微生物菌种保藏 关键技术
03
三、应用实践及注意 问题
04 四、结论
05 参考内容
微生物菌种是生物科学领域中的重要资源，它们具有广泛的工业和医学应用价 值。然而，微生物菌种的保存和保藏是一项充满挑战性的任务，因为微生物细 胞的生命周期短暂，且对环境条件极为敏感。为了更好地利用和保护这些珍贵 的资源，本次演示将详细介绍微生物菌种保藏方法及关键技术。
2、需要根据菌种的特性和应用需求，选择合适的培养基和培养条件，以保证 菌种的活性和稳定性。
3、在使用液氮保藏方法时，需要注意液氮的纯度和保存容器的密封性等问题， 以免影响菌种的存活率和保藏效果。
4、在菌种保藏过程中，需要注意防止杂菌污染和交叉感染等问题，以保证菌 种的纯度和质量。
5、需要注意菌种的定期检测和维护，及时发现并处理衰退和失活的菌种，以 保持菌种种群的健康和稳定。
三、应用实践及注意问题
在实际应用中，不同微生物菌种的保藏方法具有各自的优势和适用范围。一般 来说，对于一些常见的微生物种类，如细菌、酵母和霉菌等，冷冻保藏和液氮 保藏是常用的保藏方法。在实际操作中，需要根据具体情况选择合适的保藏方 法和操作条件。此外，还需要注意以下问题：
1、在菌种保藏过程中，需要注意菌种的来源和背景信息的记录和整理，以便 更好地了解菌种的特性和进行相应的管理。
2、种子管理
种子管理是微生物菌种保藏的关键环节之一。良好的种子管理包括对菌种的纯 度、质量、稳定性和活性的监控和维护。在菌种保藏过程中，需要定期对菌种 进行纯度检测，确保菌种的纯度和质量。同时，需要根据菌种的生长特性和环 境条件，制定相应的管理措施，包括培养基的选择、培养温度和湿度的控制等， 以维持菌种的稳定性和活性。
工业微生物菌种的保藏方法
关键词 ： 微生 物； 菌种 ； 保藏
中 图分 类 号 ： ９ —３６ Ｑ ３ ３ 文 献 标 识 码 ： Ａ
Ｐｒ ｓ ｒ ａ ｉｎ ｍ ｅｈ ｄ ｆｍ ｉｒ ｂｏｏ ｉａ ｔａｎ ｅ ｅ ｖ ｔｏ ｔ ｏ ｓｏ ｃ ｏ ｉｌｇｃ ｌｓｒ ｉｓ
Ｌ Ｈｏ ｇ ｘａ ＧＵＯ ｉｍｅ Ｕ ｎ — ｉｎ， Ｌ— ｉ
维普资讯
第 ２ 卷 第 １ １ 期 ２ ０ 拄 ０７ ３月
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Ｍａ妥善保存 ， 使之达到
不死 、 不衰 、 不变异 、 不污 染 ， 长时 间 内保 持原有 的 在 生产性 状和 生命 活力 ， 以便 于科 学研 究和 生产使 用 。 为 了有 效地 保 藏微 生 物 菌种 ， 首先 需要 有 良好
２ 保藏菌种用培养基
１ 微生物菌种保藏 的基本原理
菌种是一个国家 的重要 自然资源， 菌种保藏工 作是一 项重要 的 微生 物 学 基础 工 作 ， 种保 藏 工 作 菌
者 的任 务是把 从 自然界分 离得 到 的野 生型 或经人 工 选育得 到 的用于科 学研究 和工业 生产 等方 面 的优 良
点， 人工创造条件， 使微生物 的代谢处于不活泼、 生 长 繁殖受 抑制 的休 眠状态 。这些 人工 造成 的环境 主 要 是低温 、 干燥 、 缺氧 三者 ， 种条 件 ， 此 可使菌株 很少 发 生突 变以达 到保持 纯种 的 目的［一 １引。
（ｃｏｌ ｆ ｏｄａｄＢｏ ｇ ａ Ｅ ￣ｅ ｎ，ｈｎｏｇＩｓｔｅｏ ｔｇｔｎ ｕｔ ，ｎｎ２０５ ，ｈ ａ Ｓｈｏ ｏ Ｆｏ ｎ ｉｏｉ ｌ ｎ ｅｒ ｇＳａｄｎ ｔｕ ｆｉｈ ｄｓ ｙＪ ａ ３３ Ｃ ｉ ） ｌ ｃ ｉ ｎｉｔ Ｉ ｒ ｉ ５ ｎ
微生物的分离培养和菌种保藏
感谢您的观看
THANKS
菌种保藏技术的改进
现有的菌种保藏技术存在一些局限性， 如长期保藏过程中菌种活力的下降等， 如何改进这些技术以提高菌种的保藏 效果是另一个挑战。
培养基和培养条件的优化
不同微生物对培养基和生长条件的需 求各异，如何优化这些条件以适应各 种微生物的生长是一个重要问题。
伦理和法规问题
在微生物分离培养和菌种保藏过程中， 可能涉及到伦理和法规问题，如人类 微生物、病原体和转基因微生物的管 理等。
未来的发展方向
开发新的培养方法和技术
随着技术的发展，未来将开发出更多新的培养方法和技术，以满足各 种微生物的培养需求。
提高菌种保藏效果
未来将致力于改进菌种保藏技术，提高菌种保藏效果，延长菌种寿命。
加强微生物多样性保护
未来将更加重视微生物多样性保护，采取有效措施保护珍贵的微生物 资源。
加强伦理和法规建设
选择性分离法
利用培养基或试剂的选择性抑 制某些微生物的生长，从而分 离出所需的特定微生物。
温度、酸碱度分离法
通过调节培养基的温度、酸碱 度等条件，使适应特定条件的
微生物得到分离。
微生物分离的步骤
1 2
采集样品
根据需要选择合适的微生物样品，如土壤、水、 空气等。
样品处理
将采集的样品进行适当的处理，如稀释、研磨等。
在医学和药学中的应用
抗生素耐药性研究
分离培养耐药性微生物，研究其耐药机制，有助于开发新的抗生 素药物。
疫苗制备
通过分离培养病原微生物，制备疫苗，预防和控制传染病。
药物筛选
微生物保藏中心汇总
03
CCTCC
中国典型培养物保藏中心
China Center for Type Culture Collection
湖北武汉
04
CMCC
中国医学细菌保藏管理中心
National Center for Medical Culture Collections
北京朝阳
11
GDMCC
广东省微生物菌种保藏中心
Guangdong Culture Collection Center
广东广州
09
ACCC
中国农业微生物菌种保藏管理中心
Agriculture Cultuer Collection of China
北京海淀
10
CICC
中国工业微生物菌种保藏管理中心中心
China Center of Induatrial Culture Collection
微生物菌种保藏中心汇总
序号
缩写
名称
地区
网址
01
ATCC
美国模式培养ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ集存库（世界上最大的生物资源中心）
American type culture collection
美国
https://
02
CGMCC
中国普通微生物菌种保藏管理中心
China General Microbiological Culture Collection Center
北京大兴
05
CVCC
中国兽医微生物菌种保藏管理中心
北京
/
06
CPCC
中国药学微生物菌种保藏管理中心
China Phamaceutical Culture Collection
菌种保藏方法
一、石蜡油低温保藏法本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。
保藏温度要求在-4～4℃下。
液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。
具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油，置三角烧瓶中经过121℃高压蒸汽灭菌1～2h，将其放烘箱中(160℃左右)干热处理，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm为宜。
二、甘油管冷冻保藏法1．试验方法介绍本法也是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。
其方法是，将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。
将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液(108～1010/ml)。
取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-70℃下冻存。
-20℃保存时间较短。
或采用体积比为8：2的甘油－生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20℃冰箱保存。
2．效果该法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。
甘油－生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。
三、真空冷冻干燥法1．试验原理真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。
冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。
为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
微生物菌种保藏方法
微生物菌种保藏方法菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。
菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。
(一)常规保藏方法1 目的1.1 了解菌种保藏的基本原理1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。
2 原理菌种保藏的方法很多。
其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。
使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。
依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。
一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。
3 材料3.1菌株待保藏的适龄菌株斜面3.2培养基肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。
3.3 试剂10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。
3.4 器具用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l 毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。
4 流程斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏5 步骤5.1斜面保藏5.1.1流程标记试管→接种→培养→保藏5.1.2步骤5.1.2.1贴标签取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。
在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。
在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.1.2.2斜面接种将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。
5.1.2.3培养置37恒温箱中培养48小时。
5.1.2.4保藏斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。
这种方法一船可保藏三个月至半年。
5.2半固体穿刺保藏5.2.1流程标记试管→穿刺接种→培养→保藏5.2.2 步骤5.2.2.1贴标签取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。
5.2.2.2穿刺接种用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。
微生物菌种保存方法及技术要点
微生物菌种保存方法及技术要点摘要：微生物保存是依据菌种变异快的特点，通过一定方法降低微生物的代谢活性，从而延长其保存期限。
本文对微生物菌种保存方法进行概述，并分别阐述药品微生物菌种的主要保存方法和工业微生物菌种主要保存方法。
只要选择恰当的保存方法，才达到良好的保存效果，真正实现保存的目的。
关键词：微生物菌种;保存方法;技术要点现阶段，微生物产业已具相当大的规模，其中在发达国家占有生产总值比重较高。
在微生物产值的不断增长的前提下，其中在工业、医药、农业等多个领域发挥着重要作用。
本文主要对工业微生物菌株和药品微生物菌株的保存方法进行分析研究，可以得出其保存方法是否合理对保持菌株的优良特性十分重要。
1、微生物菌种保存方法概述微生物菌种是一个基本的分类单元，其表型特征极其相似，并且与同属其他菌种有差异很大[1]。
环境条件对微生物菌种的繁殖过程有一定的影响，其保存的主要目的是保持菌种的原有活力和形状，更好的完成微生物检验等工作。
基于此，要做好优良的菌种的选择工作，将其代谢水平降低到最低，保证菌种不发生变异并保持相应的活性。
菌种保存方法还要考虑到保存方法的经济性与便捷性，主要是操作成本以及生产推广使用的可行性。
2、药品微生物菌保存方法阐述2.1 斜面低温保藏法此方法是一种经常使用的保藏法，主要是将微生物菌种转移培养到斜面培养基中，待到微生物菌种全部覆盖于整个斜面之后，将其低温保藏，温度一般为4℃。
通过一段时间之后，对微生物菌种按照相同的方法进行转培，通过保藏方法以及不断转培进行菌种的保藏。
该方法具有的优势主要体现在操作简单、对操作设备要求低，并且菌种的存活率比较高。
此方法适用于多种微生物菌种的短期保藏，其保存菌种的时间为几个月，并不适合需要长期保藏的菌种。
在温度为4℃的情况下，菌种一般还具有一定的代谢水平，会使菌种的活性降低。
同时，反复多次的培养菌种，容易使菌种发生变异，引发感染现象等。
2.2 石蜡油封藏法此方法主要适用于培养成熟微生物菌种斜面，采用做过无菌处理并去除水分的石蜡，将培养斜面进行封存[2]。
微生物的保藏原理
微生物的保藏原理微生物的保藏原理：微生物保藏是指将微生物保存在适当的环境下，以保持其活力和遗传特性的一种方法。
微生物保藏的目的是为了长期保存有用的微生物资源，以供科学研究、工业应用和教学实验等方面的需要。
一、低温冷冻保藏：低温冷冻保藏是常用的微生物保藏方法之一。
它的原理是通过将微生物培养物暂停在低温环境中，减缓其新陈代谢并有效抑制微生物的繁殖。
常见的低温保藏方法有甘油冻存和液氮冻存。
甘油冻存是将微生物培养物加入含有甘油溶液的冻存管中，然后经过特定的冷冻程序，将培养物保存在低温下。
液氮冻存是将微生物培养物直接置于液氮中进行保藏。
这些低温冷冻方法可以长期保存微生物，并保持其原有的功能和特性。
二、真菌与酵母菌的干燥保藏：真菌和酵母菌常常通过干燥来进行保藏。
干燥保藏的原理是利用干燥条件下的低水分环境，抑制微生物的生长和代谢活动。
首先，将微生物培养物涂布在导电性载体上，然后置于无菌环境中进行干燥。
常见的干燥方法有热浸法和真空浸法。
热浸法是将微生物培养物置于高温环境中，利用蒸发的方式将水分去除。
真空浸法是将微生物培养物放置在真空环境中，通过降低压力使水分蒸发。
这些干燥方法可以在长时间内保存微生物，并保持其遗传特性和功能。
三、冷冻干燥保藏：冷冻干燥保藏是将微生物在冷冻状态下进行干燥，以提高微生物的保藏效果。
冷冻干燥的原理是先将微生物培养物冷冻，然后将其放置在真空环境中，通过升华的方式将水分去除。
这种方法可以在同时保持微生物活性的同时，减少微生物在干燥过程中受到的损伤。
冷冻干燥保藏方法适用于对微生物活性和遗传特性要求较高的保藏。
总结起来，微生物的保藏原理主要包括低温冷冻保藏、真菌与酵母菌的干燥保藏以及冷冻干燥保藏。
这些方法都能够有效地延长微生物的保存时间，并保持其活力和遗传特性，在科学研究和实际应用中起到重要的作用。
微生物的保藏技术
法国标准生物保藏中心
法国国家历史自然博物馆——Algotheque du实验室 菌种保藏中心 Algotheque du Laboratoire de Cryptogamie, Museum National d'Histoire Naturelle（ALCP）
ALCP隶属于法国国家历史自然博物馆，主要从事于工 业微生物学，应用微生物学，微生物系统分类学，培养和 保藏方法等方面的研究，以及藻类等微生物的分离，鉴定， 保藏工作。保藏有藻类600种、细菌200种。该中心保藏 的菌种可出售。
日本生物技术研究所微生物菌种保藏中心 Marine Biotechnology Institute Culture Collection, Marine Biotechnology Instituten(MBIC)
传代培养保藏
一、传代培养保藏
1 原理 2 优缺点 3 注意事项
传代培养的原理
有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时， 会很快死亡，因此在这种情况下，只能求 助于传代培养保存法。传代培养就是要定 期地进行菌种转接、培养后再保存，它是 最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用 生产菌种的保存。
德国与韩国标准生物保藏中心
德国微生物菌物保藏中心(DSMZ)，保藏有 9400种细菌、2400种真菌、500种酵母菌、300 种质粒、500种动物细胞、500种植物细胞、170 种动物杂肿瘤、600种植物病毒、90种细菌病毒 等（德文，英文）。
韩国国家农业生物技术研究所——农业微生 物菌种保藏（KACC），保藏有细菌890种、真菌 1581种、酵母菌62种、cDNA 600种（英文）。
二、保藏方法 将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷
冻保存。
菌种保藏的共同注意点：
菌种保藏操作规程
文件制修订记录目的：规范微生物学标准菌种和野生菌种的保藏。
职责：微生物检验员负责菌种的保藏、确认、传代、使用等。
范围：本规程适用于标准菌种的管理和实验过程中分离纯化的野生菌种。
编制依据：1.实验室生物安全通用要求（GB19489-2008）2.实验室质量控制规范食品微生物检测（GB/T 27405-2008）；3.中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供的菌种保藏方法；4.《微生物学实验（第四版）》沈萍、陈向东主编，高等教育出版社；5.《食品微生物实验技术》，牛天贵主编，中国农业大学出版社；本中心主要采用斜面定期移植法、液体石蜡法、甘油冷冻保藏法、瓷珠保藏法四种方法对各类型标准菌种或野生菌种进行保藏，其详细操作如下：1斜面定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4-6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1.1试剂、培养基种类a.营养肉汤或BHI培养基适用于所有细菌（除真菌外）的増菌；b.营养琼脂平板适用大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌等的培养；c.沙氏葡萄糖液体培养基适用于酵母、霉菌的增菌。
沙氏葡萄糖琼脂培养基适用于酵母、霉菌的培养。
1.2试剂、培养基制备a.按照说明书要求溶解培养基并调pH值。
b.将配好的培养基趁热分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4-5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
c.将试管加硅胶塞，外面包扎一层牛皮纸并注明培养基名称及配制日期。
根据要求将培养基灭菌，高压蒸汽灭菌121℃，15-20min。
d.斜面摆放：灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
e.无菌检查：将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1-3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
1.3接种a.点接：把菌种点接在斜面中部偏下方处。
第二节 工业微生物菌种选育
1.选择出发菌株
• 出发菌株是指用于诱变的原始菌种。 • 选择原则：菌种对诱变剂的敏感性强、变 异幅度大、产量高。 • 获得途径： （1）从自然界的土样或水样中分离出来的野 生型菌种； （2）生产中正在使用的菌种； （3）从菌种保藏机构购买
2.同步培养
• 培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们 的生理状态和代谢活动也不完全一样。 • 同步培养法：使培养的微生物比较一致， 生长发育在同一阶段上的培养方法。 • 在诱变育种前，最好选用生理状态一致的 单细胞或单孢界直接分离筛选菌种的步骤
• 1.采样： （1）选择采样地点 中性偏碱：细菌和放线菌多 酸性红土壤及森林土壤：霉菌多 果园、菜园、野果生长区（富含碳水化合物）和沼泽池：酵母和霉 菌多。 （2）确定采样时间 秋初好：温度适中，雨量不多。 夏季或冬季土壤微生物存活量少，暴雨后显著减少。 （3）采样 5cm~15cm处取土。放在牛皮纸袋或玻璃屏或聚乙烯袋中，标明 样品种类、采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等 采集的样品应及时处理，暂不处理应放在4℃保存。
机械法 （选择法） 离心沉降分离法
同步培养方法 诱导法 温度调整法
膜洗脱法
营养条件调整法
特点：同步生长只能维持几代
机械法
膜洗脱法
通过大小不同 的微孔过滤器
离心沉降分离法
小细胞 沉淀慢
• 主要通过控制环境条件：如温度、营养物质等来诱导同步生 长。 • （1）温度调整法 • 将温度控制在接近最适温度条件下一段时间，缓慢进行新陈 代谢，但不进行分裂。然后再将温度提高到最适生长温度， 大多数细胞进行同步分裂。 • （2）营养条件调整法 • 控制培养基的浓度或培养基的组成以达到同步生长。例如限 制碳源或其他营养物，使细胞只能进行一次分裂而不能继续 生长，从而获得刚分裂的细胞群体，然后转入适宜的培养基 中，它们便进入了同步生长。 • 另外有在培养基中加入某种抑制蛋白质合成的物质（如氯霉 素）诱导一定时间后再转到另一种完全培养基中培养；或用 紫外线处理；对光合行微生物的菌体可采用光照与黑暗交替 处理法等。 • 总之：不管采用哪种诱导因子，都必须具有以下特性：不影 响生物的生长，但可特异性地抑制细胞分裂，当移去（或消 除）该抑制条件后，微生物又可立即同时出现分裂。
中国工业微生物菌种保藏管理中心获得CNAS国家实验室认可
Ｆ ｏ ｒ ｉ ｔ ｓ ａ ｂ ｕ ｎ ｄ ａ ｎ ｔ ｏ ｃ ｃ ｕ ｒ ｒ ｅ ｎ ｃ ｅ ｉ ｎ Ｅ ｕ ｒ ｏ ｐ ｅ ．欧洲木｜ － ｝
（ 中国工业微 生物菌种保 藏管理 中心
刘洋
梁寒． １ １ ｆ 白飞荣）
注 ：近年 来 ，微 生物 系统分类学研 究迅猛发展 ，许 多微生物的分类学地位发 生变化和迁移 ，每年也会出现大量新的菌种
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国内外菌种保藏机构名称与缩写
国内外菌种保藏机构名称与缩写国际保藏单位名单（截至2009年8月）国外主要菌种保藏机构：1.澳大利亚NMI2.比利时BCCM(Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms)3.保加利亚NBIMCC(National Bank for Industrial Microorganisms and Cell Cultures)4.加拿大NMLHC(National Microbiology Laboratory)TCC 中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，简称CCTCC):CCTCC保藏的微生物包括细菌、放线菌、酵母菌、真菌、单细胞藻类、人和动物细胞系、转基因细胞、杂交瘤、原生动物，地衣，植物组织培养、植物种子、动植物病毒、噬菌体、质粒和基因文库等各类微生物（生物材料/菌种）。
6.CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC的宗旨是广泛收集国内外的微生物资源，妥善保存，以公开的保藏机构的名义为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供标准化的实验材料,在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为第三者能够自由地利用各种微生物材料提供服务，最大限度的实现微生物资源的保护、共享和持续利用。
7.捷克CCM(Czech Collection of Microorganisms)8.法国CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)9 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen ) 德国微生物菌种保藏中心DSMZ成立于1969年，是德国的国家菌种保藏中心。
该中心一直致力于细菌、真菌、质粒、抗菌素、人体和动物细胞、植物病毒等的分类、鉴定和保藏工作。
中国微生物菌种保藏管理条例
中国微生物菌种保藏管理条例第一章总则第一条微生物学的研究在现代生物学中占有重要地位，随着我国社会主义建设的发展，在农业、林业、畜牧业、渔业、轻工、化工、采矿、环保、医药卫生和国防等方面起着越来越重要的作用。
菌种是进行微生物学研究和应用的基本材料，是发展生物工程的重要基础条件之一，是国家的重要生物资源。
为了进一步做好菌种的分离筛选、收集保藏、鉴定编目、供应交流，以便使其更好地为四个现代化服务，特制订本管理条例。
第二条本条例所指的菌种，包括可以培养的有一定科学意义或实用价值的细菌、真菌、病毒、细胞等代表株。
第三条中国微生物菌种保藏管理委员会现设普通、农业、林业、工业、抗生素、医学、兽医微生物等菌种保藏管理中心。
第二章收集与保藏第四条收集（一）各保藏管理中心有权向国内有关单位收集和索取有一定价值的菌种。
（二）凡单位或个人分离，选育或引进具有一定价值的菌种，应及时将该菌种的复制培养物及详细资料，送交有关保藏管理中心。
确认有保存价值者，方可入藏。
（三）下述菌种均为国家重要的生物资源，均需向有关中心办理入藏手续。
１．申请专利的菌种；２．报部和省、自治区、直辖市级科研成果所涉及的菌种；３．新种、新型菌种。
第五条保藏（一）各保藏管理中心所保藏的菌种，必须具有该菌种的详细历史及有关实验资料。
（二）各保藏管理中心对其所负责保藏的菌种均应采取妥善、可靠的方法保藏，避免菌种的污染或死亡。
（三）各保藏管理中心应制定安全、严密的保管制度，并指定专人负责。
（四）各保藏管理中心应尊重申请保藏单位或个人的劳动成果，并为共作证，维护其合法权益，不得擅自扩散。
第三章命名与编目第六条命名有关分类命名及统一译名等事宜，由委员会的学术组协同有关方面负责。
第七条编目（一）菌种目录是国家掌握生物资源的主要依据，为此在委员会的领导下，组织有关人员，编制或修订以下几种目录：１．中国菌种目录；２．各保藏管理中心的菌种目录；３．国家专利或保密的菌种目录；４．必要的其它菌种目录。
工业用微生物菌种保藏的目的、原理及方法详解
工业用微生物菌种保藏的目的、原理及方法详解1、菌种保藏的目的微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。
菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。
2、菌种保藏的原理无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。
其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。
3、菌种保藏的方法（1）斜面低温保藏法将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。
此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。
放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。
如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。
这一改进可使菌种的保藏期延长。
该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。
其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。
（2）石蜡油封藏法此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。
使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。
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一、菌种的衰退与复壮
（一）衰退
1. 定义 衰退（degeneration）是指由于自发突变的
结果，而是某物种原有一系列生物学性状发生量 变或质变的现象。
菌种的衰退是发生 在微生物细胞群中的一个由量变到质变的逐步演化过程。
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菌种原有的典型性状变得不典型时就称菌种退化，
例如，构巢曲霉如用分生孢子接种易退化； 如用子囊孢子接种则不易退化。
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（5）采用有效的菌种保藏方法
菌种保藏的温度、所用的培养基等可影响自发突变。
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（二）菌种的复壮（的复壮：
是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典
型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选 出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性 状的相应措施。
保藏菌种或原种（stoch culture）。
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国家设立专门的菌种保藏机构 任务：
广泛收集实验室和生产用菌种、菌株、病毒毒株 （有时还包括动、植物的细胞株和微生物质粒等）， 并将它们妥善保藏，使之不死、不衰、不乱， 便于研究、交换和使用。
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1. 菌种保藏的原理
首先，要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用 它们的休眠体进行保藏。 其次，创造一个使微生物代谢不活泼、生长受 抑制的环境条件。
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优点：低温、干燥、无氧、有保护剂，可保藏 各大类微生物，保藏时间可达几十年，是目前 使用最广、最有效的保藏方法。一般专业机构 大都使用此法保藏。 缺点：不能保藏真菌菌丝。
相应的昆虫或动、植物宿主体内
多次选择
从典型的病灶部分分离到恢复原始独立的复壮菌株
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（3）淘汰已衰退的个体
S. microflavus“5406”农用抗生菌的分生孢 子，采用－10～－30℃的低温处理5～7天，退 化的个体死亡，留下的10％～20％个体是未退 化的。
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二、菌种的保藏
菌种（culture，stock culture）
是一种极其重要和珍贵的生物资源。
菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）
是一项十分重要的基础性工作。
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基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱 用于长期保藏的原始菌种称为
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纯种分离的方法
粗放
“菌落纯”水平（pure culture in colony lever）
“菌株纯”水平（pure culture in strain lever） 精细
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（2）通过宿主体复壮
针对病原菌
衰退的病原菌
接种
活的 “选择性培养基
”
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低温可减缓生长速度，单细胞仍有一定的活动条件， 一般4～6个月必须传代一次。
优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。 缺点：时间短、传代多、易退化。
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（2）液体石蜡法 操作方法：
生长完全的斜面上覆盖无菌的液体石蜡， 液面高于斜面1cm，普通冰箱保藏。
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这种变异也称负变（minus mutation）。 影响微生物菌种稳定性的因素：
a）变异； b）污染； c）死亡；
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例如， 微生物菌落形态或个体形态的变化； 生长速度缓慢，产孢子量减少； 色素产生情况的变化； 研究菌种遗传标记的丢失， 生产菌种生产性状的劣化等。
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2. 衰退的原因 造成菌种退化的主要原因是基因突变。
加上石蜡可防止培养基水分蒸发，也可隔氧， 保藏时间1～2年，除石油发酵微生物外，各类 微生物均可使用。
注意：石蜡的纯度
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（3）砂土保藏法 操作方法：
沙和土用酸浸泡去除其中的有机质，洗涤中和， 干燥，分装于安瓶管内，加塞灭菌，把健壮的孢 子悬液滴于砂土中搅拌均匀，真空干燥后封口， 置于冰箱或干燥器中。
再次，添加保护剂或酸碱中和剂，避免保藏过 程中细胞受伤。
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2. 菌种保藏的方法
一种良好的菌种保藏方法
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保持原菌的优良性状长期稳定 方法的通用性 操作的简便性 设备的普及性
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（1）定期移植保藏法 操作方法：
将菌种接种在斜面、液体或穿刺培养基上，待生 长完全后，置普通冰箱4℃保藏，湿度50％～70％ 以下，棉塞换成不通气橡皮塞更好。
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优点：低温、干燥、无氧、无营养，保藏效果好， 时间可达几年至数十年。 缺点：只适用于产孢子的微生物，不能用于保藏营 养细胞。
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（4）冷冻干燥保藏法 操作方法：
是将液体样品（含保护剂的菌悬液）在冻结状态 下升华其中水分，最后达到干燥。培养物用无菌 脱脂牛奶—保护剂制成菌悬液，加入安瓶中，冷 冻、抽真空、封口。
是一种消极的措施
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广义的复壮：
在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经
常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作， 以期从中选择到自发的正变个体。
是一项积极的措施
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1. 复壮的方法 （1）纯种分离法（pure culture isolation）
通过纯种分离把退化菌种的细胞群中仍保持 原有典型性状的单细胞分离出来，扩大培养，就 可恢复正常。
（3）创造良好的培养条件
创造一个适合原种的生长条件，就可在一定程度 上防止菌种衰退 ； 例如，给予营养缺陷型适当的营养必需成分，可 降低回复突变频率。
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（4）利用不同类型的细胞进行接种传代 放线菌和霉菌一般用单核的孢子接种的，菌
丝细胞常含有几个细胞核，甚至是由异核体组成的 ，用于接种就易出现离异（dissociation）或衰退。
生产工艺条件控制不当
误区
杂菌污染
造成生产性能 下降
饰变
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3. 衰退的防止
（1）选育生产性能稳定的菌株作为生产菌株
经诱变等处理后的菌种要连续传代、分离纯化， 防止分离回复。
（2）控制传代次数
尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代 降低到最低限度，以减少自发突变的几率。
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