鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames)
Ames试验
• 突变型菌株的某些特征有可能会在贮存过程中丢失或变异，所以 在Ames试验前必须对所有菌株进行基因型鉴定、自发回变数鉴 定及对鉴别性致突变物的反应鉴定。鉴定合格后才能用于试验， 否则应重新挑选菌种。
• Ames试验的方法分为点试验法、平板掺入法及预培养平板掺入
法。
B
8
应用
• 例如：用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌
B
5
Ames试验原理
B
S9是什么
6
• 因为许多外源化学物是间接诱变剂，需经过代谢活化转变为亲电
子的终致突变物才能与DNA反应，引起突变。鼠伤寒沙门氏菌缺
乏哺乳动物的代谢酶，微量检测直接及间接诱变剂，在进行
Ames试验时，应分别进行不加及加代谢活化系统的检测。而在
生物体内参与代谢活化的主要酶系是混合功能氧化酶系，所以，
• 为使受试物在体外测试中受到同活体类似
的代谢活化作用，在试验中采用将哺乳动
物的肝细胞微粒体（微粒体酶）及受氢系
统一并加入培养基中，进一步提高实验方
法的灵敏度。
B
4
• 标准试验菌株（配套菌株）：有四种 • TA98 、TA97：检测移码突变 • TA100：检测碱基置换突变 • TA102：对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感 • 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。 • 只有在四种试验菌株得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
• 该法适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。是应用最
广泛的检测基因突变的体外试验。
B
3
实验原理
• 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his－）菌 株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只 能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细 胞发生回复突变成野生型微生物，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。 据此来检定受试物是否具有致突变作用。
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames）
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames）
实验原理
1 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。
假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备S9混合液。
10％s9混合液的配制：每10mL由以下成分组成，临用时配制。
活化系统（s-9和s-9混合液）的制备
用哺乳动物如大鼠，经诱导剂处理，取肝组织制备匀浆，9000g 离心，上清液为s-9组分，与辅助成分以适当比例组成s-9混合液，用作试验中的代谢活化系统。
磷酸盐缓冲液（0．2mol/L，pH7．4） 6．0mL
氯化钾溶液（1．65mol/L） 0．2mL
氯化镁溶液（0．4mo1／L） 0．2mL
葡萄糖-6．磷酸盐溶液（0．05mol/L） 1．0mL
辅酶-Ⅱ溶液（0．025mol/L） 1．6mL
肝s-9液 1．0mL
混匀，置冰浴中待用。
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
五菌株鉴定和保存
四种标准试验菌株必须进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物的反
应鉴定，合格后才能用于致突变试验。
1.菌株基因型鉴定
}I)组氨酸营养缺陷鉴定(组氨酸需求试验):
取两个底层培养基、其中一组于培养基表面涂加0. 1毫升0.
培养基成分或试剂除说明外，应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当
保存温度和期限。
2.培养基制备_
C1)营养肉汤培养基
牛肉膏2. 5g
胰陈(或混合蛋白膝)5. 0g
氯化钠2. 5g
磷酸氢二钾(KZHPO}.3H20 ) }. . 3 g
蒸馏水至500mL
加热溶解，调pH至7. 4，分装后0. 103MPa 20min灭菌，4℃保存备用。C2}?营养肉汤琼脂培养基:
迅速混匀，倒在底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，37艺培养拐介时观察结果。
二，点试法
在攻层培养平皿上写上记号。取已融化并在45℃水浴中保温的顶层培养基一管(2m } )，加
人是试菌菌涛}_ }h-(_pmt }}}}(} }3}r,，、。"} } }}二_;、}1} .,e} \}
肝S9液1. 0 mL
混匀，置冰浴待用。菌株及增菌培养
试验菌株
四
采用四株鼠伤寒沙门氏突变型菌株TA97, TA98, TA100和TA102 o TA97, TA98可检侧
移码型诱变剂:TA100可检测碱基置换型诱变剂;TAZOZ检出移码型和碱基置换型诱变剂。
这4种标准菌株除均有组氨酸突变(his)外还有一些附加突变，可以提高试验菌株对致突
鼠伤寒沙门氏菌试验(Ames试验)文献综述
文献综述：鼠伤寒沙门氏菌试验（Ames试验）摘要：食品安全无论如何怎样强调都不会过分，迅速而准确地检测致癌物质是食品安全问题的重要方面。
美国科学家Dr. Bruce Ames及其同事创立了一种方法，叫鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ames试验），它是利用一组组氨酸营养缺陷型菌株加入待测物在有或没有微粒体活化系统条件下，发生回复突变的特征鉴定化学物质的诱变活性，现已成为初步筛选化学物潜在致突变的首选方法。
关键词：鼠伤寒沙门氏菌试验；基本原理；一般步骤；应用及其研究进展；1 前言污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。
世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。
美国科学家Dr. Bruce Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。
该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。
众多学者有的用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌性；有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames 试验），探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施；或检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames 试验研究化合物结构与致变性的关系，为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新的抗癌药等等[1]。
2 定义2.1 回复突变（Reverse mutation）细菌在化学致突变物作用下由营养缺陷型回变到原养型(prototroph)。
简述 ames 实验的步骤及可能产生的结果？本实验中还应注意哪些方面？
简述 ames 实验的步骤及可能产生的结果？本实验中还应注意哪些方面？
1. 实验步骤：
- 制备测试菌株：使用经过基因突变处理的鼠伤寒沙门氏菌作为测试菌株。
- 制备测试物质：将待测化学物质进行适当的溶解和稀释。
- 平板涂布：将测试菌株和测试物质分别涂布在含有营养物质的琼脂平板上。
- 培养平板：将涂布好的平板放置在适宜的温度下进行培养，通常为 37°C。
- 观察结果：培养一段时间后，观察平板上的菌落数量和形态。
2. 可能产生的结果：
- 阳性结果：如果平板上出现了大量的回变菌落，说明测试物质具有致突变性。
- 阴性结果：如果平板上的回变菌落数量很少或没有，说明测试物质不具有致突变性。
- 可疑结果：如果平板上的回变菌落数量介于阳性和阴性之间，需要进一步的实验验证。
在进行 Ames 实验时，还应注意以下方面：
1. 质量控制：使用标准阳性和阴性对照物质进行质量控制，确保实验结果的准确性。
2. 剂量效应：确定合适的测试物质浓度范围，观察剂量效应关系。
3. 重复性：进行多次重复实验，确保结果的可重复性。
4. 安全性：遵循实验室安全操作规程，确保实验人员的安全。
Ames 实验是一种初步的致突变性检测方法，对于检测化学物质的潜在致癌性具有重要意义。
但需要注意的是，Ames 实验结果仅提供初步的筛选信息，不能确定化学物质对人体的致癌风险，需要进一步的研究和评估。
Ames试验
Ames试验原理
S9是什么
• 因为许多外源化学物是间接诱变剂，需经过代谢活化转变为亲电子的终致突 变物才能与DNA反应，引起突变。鼠伤寒沙门氏菌缺乏哺乳动物的代谢酶， 微量检测直接及间接诱变剂，在进行Ames试验时，应分别进行不加及加代 谢活化系统的检测。而在生物体内参与代谢活化的主要酶系是混合功能氧化 酶系，所以，在Ames试验中加入的代谢活化系统应主要是混合功能氧化酶 系，一般是加入S9混合液。S9即经多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆，经 9000r/min离心得到的上清液。在S9中再加入一些辅助因子，如辅酶Ⅱ （NADP+）、葡萄糖-6-磷酸，K+、Mg2+及缓冲液等组成S9混合液（S9mix）
• 为使受试物在体外测试中受到同活体类似 的代谢活化作用，在试验中采用将哺乳动 物的肝细胞微粒体（微粒体酶）及受氢系 统一并加入培养基中，进一步提高实验方 法的灵敏度。
• 标准试验菌株（配套菌株）：有四种 • TA98 、TA97：检测移码突变 • TA100：检测碱基置换突变 • TA102：对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感 • 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。 • 只有在四种试验菌株得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
• 不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。 • 加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。 • 突变型菌株的某些特征有可能会在贮存过程中丢失或变异，所以在Ames试
验前必须对所有菌株进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物 的反应鉴定。鉴定合格后才能用于试验，否则应重新挑选菌种。 • Ames试验的方法分为点试验法、平板掺入法及预培养平板掺入法。
• 不足之处 • 微生物的遗传信息仅为哺乳动物的1/6； • 微生物的DNA修复系统没有哺乳动物复杂而精巧； • 微生物无免疫功能，而哺乳动物则具有复杂的免疫监视机能。 • 少数不在肝脏中进行代谢转化的外来化合物，本法不能检出其突变性，如苏
ames试验的基本原理
ames试验的基本原理一、引言Ames试验是一种常用的基因毒性测试方法，被广泛应用于药物、化学品、食品等领域。
该试验的基本原理是通过检测某种物质对细菌的致突变作用来评估其对人类健康的潜在危害性。
本文将详细介绍Ames试验的基本原理。
二、Ames试验的背景Ames试验最早由美国加州大学伯克利分校的Bruce Ames教授于1975年提出，其初衷是为了寻找一种简单快捷、灵敏可靠的方法来筛选化学物质是否具有致癌作用。
随着科技发展和实验方法改进，Ames 试验逐渐成为了一种广泛应用于基因毒性测试中的标准方法。
三、Ames试验原理Ames试验使用Salmonella鼠伤寒杆菌（Salmonella typhimurium）作为实验生物，利用它们对组氨酸（histidine）生长需要这一特点进行检测。
实验过程中将待测化合物与Salmonella鼠伤寒杆菌接触，观察是否会引起它们突变从而使其不再需要组氨酸即可生长。
如果待测化合物能够引起突变，使Salmonella鼠伤寒杆菌从无法生长转变为可以生长，则说明该化合物具有致突变作用。
四、Ames试验的步骤1. 选取适当的Salmonella菌株：选择对组氨酸敏感的Salmonella菌株（如TA98、TA100等）。
2. 制备试验培养基：制备含有必需营养成分和组氨酸的培养基。
3. 预处理细胞：将细胞培养在无组氨酸的培养基中，使其处于低代谢状态。
4. 处理细胞：将待测化合物加入到培养基中，与Salmonella菌株接触一定时间。
5. 涂布平板：将处理后的细胞涂布在含有少量组氨酸和其他必需营养成分的平板上，进行孵育。
6. 计数突变菌落数：观察是否有突变菌落出现，并计数其数量。
若突变菌落数量显著高于对照组，则说明待测化合物具有致突变作用。
五、Ames试验的优缺点1. 优点：Ames试验具有灵敏度高、可重复性好、操作简单等优点，可以快速筛选出具有致突变作用的化合物。
2. 缺点：Ames试验只能检测化合物对细菌的致突变作用，而不能直接评估其对人体健康的潜在危害性。
鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验
现性即可认为该受试物
为诱变阳性。
S-9混合液的制备过程
暴露肝脏，KCL灌注
2
断头处死大鼠、放血、去皮
1
毒理学基础实验课 3 取出肝脏，加入KCL剪碎
取上清、分装、冻存
5
4 制成匀浆，9000g离心
S-9混合液的组成成分
毒理学基础实验课
肝匀浆S-9
100 μl
0.4mol/L MgCl2
设立阳性对照和阴性（溶剂）对照
Ames试验方法及结果评价
毒理学基础实验课
点试法
点样纸片周围长出一 圈密集的His+回变菌 将顶层培养基倒入底层培养基中，落凝者，受试物即为阳 固后放入滤纸片，将受试物点在纸性片致突变物质。
上放入底层，37℃培养48h观察结果
掺入法
将受试物0.1ml、菌液0.1ml分别加背入景菌生长良好受试物 顶层培养基中，倒入底层培养基中每，皿回变菌落数增加一 凝固后37℃培养48h观察结果 倍以上并有剂量-反应
TA97
+
+
+
-
+
自发回变 （-S9）
90-180
TA98
+
+
+
-
+
30-50
TA100
++Fra bibliotek+
-
+
120-200
TA102
+
+
+
-
+
240-320
Ames试验设计
毒理学基础实验课
受试物最低剂量为每皿0.1μg 受试物最高剂量为每皿5mg
艾姆斯试验法
❖ Salmonellatyphimurium(鼠伤寒沙门氏菌的组 氨酸缺陷型(hisˉ)菌株在基本培养基[-]的平板 上不能生长，如发生回复突变则能生长。含 可疑“三致”物例如黄曲霉毒素、二甲氨基 偶氮苯(奶油黄)或“反应停”的试样，加入鼠 肝匀浆，保温一段时间后，吸入滤纸片中， 然后将滤纸片放置于上述平板中央 。
Ames试验（Amesห้องสมุดไป่ตู้test)
❖ Ames试验全称污染物致突变性检测。 ❖ 一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测
环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便方 法。
Ames试验原理
❖ 用遗传学方法培植一种不能自行制造组氨酸的鼠伤 寒沙门氏菌的变异体，这种菌株在无组氨酸的培养 基中不能生长。如果将这种菌株与化学致癌物一起 培养，则可使其DNA（脱氧核糖核酸）再次突变， 恢复到能制造组氨酸的原型（野生型），即在无组 氨酸的培养基中也能生长。利用这一特征性变化来 测试化学物质有无致突变作用，也即致癌性，并根 据生长的菌落数目还可以判定其致癌性的强弱。
❖ 经培养后，出现三种情况：如在平板上无大 量菌落产生，说明试样中不含诱变剂；如在 纸片周围有一抑制圈，其外才是大量菌落， 说明试样中某诱变剂的浓度很高；如在纸片 周围即长大量菌落，说明诱变剂的浓度合适。
❖ 艾姆斯试验是较受重视的快速初筛化学致癌 物的试验方法。艾姆斯试验是快速地鉴别化 学品、新农药和新食品添加剂的致癌性，作 为致癌物质的筛选法而被广泛应用,可以检测 许多物质的致癌性。
Ames
点试法
掺入法
背景菌生长良好受试物 将受试物0.1ml、菌液0.1ml分别加入 每皿回变菌落数增加一 顶层培养基中，倒入底层培养基中， 倍以上并有剂量-反应 凝固后37℃培养48h观察结果 关系，试验结果具有重 现性即可认为该受试物 为诱变阳性。
毒理学基础实验课
七、溶剂的选择 如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂； 如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突 变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO）、
丙酮、95%乙醇。
一般操作中，为了减少误差和溶剂的影响，常按
每皿使用剂量用同一溶剂配成不同的浓度，固定
加入量为100l。
滤纸片（有结晶紫） 抑菌环
0.1ml菌液
37℃24h
顶层
普通培养基
毒理学基础实验课
3、紫外线敏感特性
原理：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，当受到紫外线照射后，不能生长， 而具有野生型切除修复酶的菌株，则能照常生长。 鉴定方法：用灭菌牙签分别将菌株划线接种于普通培养基上，打开平皿盖，用 灭菌黑布盖住一半培养基，用15W紫外灯在距离33cm处照射8s，37℃温箱培养 18h~24h。 结果判断：具有△uvrB突变的菌株对紫外线敏感，经辐射后细菌不生长，而具 有完整的切除修复系统的菌株，则照常生长。
诱导 －最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯 联苯（PCB混合物），
－选择健康雄性大鼠体重200g左右，
－一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg体重。
诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。
6-4 化学致突变物的检测
第四节化学致突变物的检测一、致突变试验(一) 基因突变试验1.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验又称Ames试验，检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。
试验菌株都有组氨酸突变(his-)，不能自行合成组氨酸，在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长，回复突变成野生型后能自行合成组氨酸，可在最低营养平皿上生长成可见菌落。
计数最低营养平皿上的回变菌落数来判定受试物是否有致突变性。
标准试验菌株有四种：TA97和TA98检测移码突变、TA100检测硷基置换突变、TA102对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感。
这四个试验菌株除了含有his-突变，还有一些附加突变，以提高敏感性。
试验方法有点试验(预试验)和掺入试验(标准试验)两种。
在掺入试验中，受试物最高剂量为5mg/皿或出现毒性及沉降的剂量，至少有五个剂量点，并有阴性(溶剂)对照和阳性对照。
将受试物、试验菌株培养物和S9混合液加到顶层培养基中，混匀后铺在最低营养平皿上，37℃培养48小时，计数可见菌落数。
判断阳性结果的标准是，如每皿回变菌落数为阴性对照的每皿回变菌落数的两倍以上，并有剂量－反应关系，即认为此受试物为鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。
S9混合液是用多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆9000Xg上清液(S9)加上NADP及葡萄糖－6－磷酸等辅助因子，作为代谢活化系统。
如不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物；加S9混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物。
只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物；仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
2.哺乳动物细胞基因突变试验哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验常用的测试系统有小鼠淋巴瘤L5178Y细胞，中国仓鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的三个基因位点的突变，即次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+／K+ATP酶(OUA)位点。
Ames试验
应用
• 例如：用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性，由此推测其致癌
性；用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性，探索较现行方法更加卫生
安全的消毒措施；检测城市污水和工业废水的致突变性，结合化学分析，追踪
污染源，为研究防治对策提供依据；检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰 烬的致突变性，以防止维系生命的土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人 类；检测气态污染物的致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生 潜在危害；检测农药在微生物降解前后的致突变性，了解农药在施用后代谢过
• 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。
• 只有在四种试验菌株得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
S9是什么
Ames试验原理
• 因为许多外源化学物是间接诱变剂，需经过代谢活化转变为亲电子的终致突
变物才能与DNA反应，引起突变。鼠伤寒沙门氏菌缺乏哺乳动物的代谢酶， 微量检测直接及间接诱变剂，在进行Ames试验时，应分别进行不加及加代 谢活化系统的检测。而在生物体内参与代谢活化的主要酶系是混合功能氧化 酶系，所以，在Ames试验中加入的代谢活化系统应主要是混合功能氧化酶
鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验法
Ames试验
杨灿
• 概述 • 实验原理 • 应用 • 缺点
目录
• Ames试验，全称污染物致突变性检测，也称为鼠伤寒沙门氏菌回复突变试 验。 • 它是一种利用微生物进行基因突变的体外致突变实验法。利用一种突变型微 生物菌株与被检化学物质接触，如果该化学物具有致突变性，则可使突变性 微生物发生回复突变，重新成为野生型微生物。 • 该法适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。是应用最广泛的检测 基因突变的体外试验。
(AMES)细菌回复突变试验中采用的基本菌株——上海宝录
(AMES)细菌回复突变试验中采用的基本菌株——上海宝录在(AMES)细菌回复突变试验中至少应采用5种菌株，包括用于检测组氨酸靶基因中鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C）位点碱基置换或移码突变的4种鼠伤寒沙门氏菌（TA1535；TA1537/TA97/ TA97a；TA98和TA100），以及用于检测组氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位点碱基置换或移码突变的鼠伤寒沙门氏菌TA102或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA（注释1）。
由于检测G-C位点突变的4种菌株无法检测交联剂，因此检测交联剂时最好采用TA102菌株或增加埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA，要注意这类化合物在检测染色体损伤的试验中可被检测出。
因此，推荐的标准菌株组合如下（除特殊注明外，均为鼠伤寒沙门氏菌）：1．TA982．TA1003．TA15354．TA1537或TA97或TA97a（注释2）5．TA102或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA或埃希氏大肠杆菌WP2 uvrA（pKM101）。
注释1：有将A-T靶位点突变的菌株包括在测试组合中检测一些遗传毒性致癌剂的相关文献报道（如Levin等，1983；Wilcox等，1990）。
日本劳务省对5525种化合物的数据库进行分析（以及由各个制药公司对较小的数据库进行分析）的结果表明，约7.5%的细菌诱变剂是由大肠杆菌WP2 uvrA而非4种鼠伤寒沙门菌株标准组合检出。
尽管尚未获得这些化合物对动物致癌性的资料，但很可能它们具有与诱导鼠伤寒沙门菌株标准组合变化的诱变剂同样的潜在致癌性。
注释2：TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重复序列，其位于相应的组氨酸靶位点内的突变敏感部位，它们对导致这些移码热点中碱基缺失的移码诱变剂的敏感性相似，因此该三种菌株可相互代替。
Ames实验
❑ Ames试验
应用 1．斑点试验只局限于能在琼脂上扩散的化学物 质，大多数多环芳烃和难溶于水的化学物质均 不适宜用此法。此法敏感性较差，主要是一种 定性试验，适用于快速筛选大量受试化合物。 2．平板掺入试验可定量测试样品致突变性的强 弱。此法较斑点试验敏感，获阳性结果所需的 剂量较低。点试获阳性结果的浓度用于掺入试 验（每皿0.1ml），往往出现抑（杀）菌作用。 3．致变作用迟缓或有抑菌作用的试样，培养时 间延长至72h。
Ames试验
Ames试验，即污染物致突变性检测，也称 为鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 污染物对人体的潜在危害，引起人们的普 遍关注。世界上已发展了百余种短期快速 测试法，检测污染物的遗传毒性效应。 B.N.Ames等经十余年努力，于1975年建立 并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验 （亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。
鼠伤寒沙门氏菌 野生型（his＋）
正向突变
回复突变
鼠伤寒沙门氏菌 突变型（his－） 试验菌种 (his-) S9
受试物 试验菌种 (his-) S9
Ames试验原理
❑ Ames试验 结果判断:
➢ 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为
受试物是致突变物
➢ 仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为 受试物是非致突变物
❑ Ames试验
❖原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营 养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能 力。即组氨酸突变菌(his-) 在不含组氨酸的最低营 养平皿上不能生长；回复突变成野生型(his+)，可 在不含组氨酸的最低营养平皿上生长。 ❖是应用最广泛的检测基因突变的体外试验。
❖加S9 混合液才得到阳性结果，说明该受试物
三氯乙烯对鼠伤寒沙门氏菌的致突变实验
(2).脂多糖屏障缺陷的鉴定
• 加热融化营养肉汤琼脂培养基。接种：取菌液 0.1mL移入平皿，迅速将营养肉汤琼脂培养基(冷 却至50℃左右)适量倒入平皿，混匀，平放凝固。 将无菌滤纸片一片放入已凝固的培养基平皿中央， 用移液器在滤纸片上滴加0.1%结晶紫溶液(鉴定菌 株用) 10μL，37℃培养24h，每个菌做一个平皿。 结果：阳性者在纸片周围出现一个透明的抑制带， 说明存在rfa(深粗型)突变。这种变化允许某些大 分子物质进入细菌体内并抑制其生长。TA97、 TA98、TA100和TA102均有抑制带，野生型鼠伤寒 沙门氏菌没有抑制带。
三氯乙烯对鼠伤寒沙门氏菌 的致突变试验
一、实验目的
1、掌握Ames试验的基本原理及应用 2、了解Ames试验的基本步骤 3、通过该实验，了解三氯乙烯的致突变作用
二、实验原理
• 原理：是一种利用微生物进行基因突变的体外 致突变试验方法。基本原理是利用同一种微生 物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接触，若 此化学物质具有致突变性，可使突变型微生物 再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这 种突变叫做回复突变。
变性。
1 材料与方法
• • 1.1 样品 复方生物黄酮的商品名称为圣安泰牌百力康
片，由哈尔滨圣安泰生物 科技 有限公司提供。样品以枸 杞、黄芪、银杏叶为主要原料，辅以其他辅料制成，功效 成分为总黄酮。 • • 1.2 材料 昆明种小白鼠（批准证号：医动字第09-2-7 号），购自黑龙江省肿瘤研究所实验动物中心。TA97a、 TA98、TA100和TA102四种菌株引自美国加州大学Ames 实验室。 • •
1.3 方法
• TA97a、TA98、TA100和TA102 四种菌株引自美国加州大学Ames实验 室。经菌株特性鉴定均符合实验要求。活化系统为PCB-五氯诱导的雄性 Wistar大鼠肝s-9液。按1：9加入辅助因子（Ames 1983年配方）配成10 ％ s-9混合液，经阳性诱变剂活性鉴定符合实验要求。实验样品经XAD11树脂柱过滤及洗脱预处理，最后以DMSO为溶剂，剂量设计分别为5mg/ 皿、1mg/皿、0.2mg/皿、0.04mg/皿和0.008mg/皿受试物。除上述5个剂 量组外，又设未处理对照组、溶剂对照组（DMSO）和阳性对照组［加s9用2-AF（TA102用1，8-二羟蒽醌），不加s-9用DEXON（TA100用叠氮 钠）］。采用平板渗入法进行实验。在保温的顶层培养基中依次加入测试 菌株新鲜增菌液0.1ml，混匀；加受试物或对照物0.1ml［需活化时加入10 ％ s-9混合液0.5ml（含s-9 5μl）］，论文联盟整理再混匀，迅速倾入 底层培养基上，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化， 37℃培养48h观察结果。每个剂量平行做了3皿，并重复一次，最后以3皿 平均值报告实验结果.
鼠伤寒沙门氏菌哺乳动物微粒体酶试验
鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验1 主题内容与适用范围本标准规定了Ames试验的基本技术要求。
本标准适用于检测环境有害物质的致突变作用。
2 原理鼠伤寒沙门氏菌的突变型(即组氨酸缺陷型)菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。
但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型(表现型)，因而在无组氨酸培养基上也能生长，故可根据菌落形成数量，检查受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联苯(PCB)诱导的大鼠肝匀浆(S－9)制备的S－9混合液。
3 仪器3.1 实验室常用设备。
3.2 低温高速离心机，低温冰箱(－80℃)或液氮罐，洁净工作台，恒温培养箱，恒温水浴，蒸气压力锅，匀浆器等。
4 培养基制备及试剂的配制培养基成分或试剂除说明外至少应是化学纯，无诱变性。
避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限，如肉汤保存于4℃不超过六个月，其他详见下述各培养基及溶液说明。
4.1 营养肉汤培养基牛肉膏 2.5g胰胨(或混合蛋白胨) 5.0g氯化钠 2.5g磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)1.3g蒸馏水500mL加热溶解，调PH至7.4，分装后0.103MPa20min灭菌，普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。
4.2 营养肉汤琼脂培养基：用作a.基因型鉴定的结晶紫敏感试验，抗氨节青霉素和四环素试验，紫外线敏感性试验。
b.细菌活力鉴定。
琼脂粉 1.5g营养肉汤培养基100mL加热融化后调pH为7.4，0.103MPa 20 min灭菌。
4.3 底层培养基所需试剂及配制方法如下：4.3.1 磷酸盐贮备液磷酸氢钠铵(NaNH4HPO4·4H2O) 17.5g柠檬酸(C6H8O7·H2O) 10.0g磷酸氢二钾(K2HPO4) 50.0g硫酸镁1)(MgSO4·7H2O) 1.0g加蒸馏水至100mL，0.103MPa 20min灭菌。
ames试验实验方法
ames试验实验方法
Ames试验是一种检测化学物质是否存在致突变作用的试验，其全称是污染物致突变性检测试验。
以下是Ames试验的实验方法：
1. 准备细菌：选用具有回复突变特性的鼠伤寒沙门氏菌，通常使用组氨酸缺陷型或乳糖发酵缺陷型等菌株。
2. 制备平板：将细菌培养至一定数量，将其均匀涂布在不含抗生素的基本培养基上，制成细菌平板。
3. 添加诱变剂：将待测物质加入细菌平板，使诱变剂与细菌作用一定时间。
4. 培养细菌：将细菌平板在37℃培养一定时间，使细菌进行增殖。
5. 挑选突变菌落：观察细菌平板，挑选出与背景菌落不同的突变菌落。
6. 验证突变：通过生化反应或基因测序等方法，验证突变菌落中的基因是否发生了突变。
以上是Ames试验的实验步骤，建议查阅专业书籍或咨询专业人士获取更多信息。
Ames试验步骤及报告范文模板
Ames试验步骤及报告范文模板鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验（Ame试验）－鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）的组氨酸营养缺陷型（hi）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。
受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。
某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶①，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。
鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。
鼠伤寒沙门氏菌的突变型（即组氨酸缺陷型）菌株在无组氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸的培养基上可以正常生长。
但如在无组氨酸的培养基中有致突变物存在时，则沙门氏菌突变型可回复突变为野生型（表现型），因而在无组氨酸培养基上也能生长，故可根据菌落形成数量，检查受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能使沙门氏菌突变型产生回复突变，代谢活化系统可以用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆（S-9）制备的S-9混合液。
（一）主要培养基与试剂1.培养基（1）营养肉汤培养基取5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨和5.0g氯化钠，加1000mL蒸馏水并加热溶解，调pH至7.2，分装后经灭菌，置普通冰箱保存备用，保存期不超过半年。
营养肉汤培养基成分：牛肉膏蛋白胨NaCl加蒸馏水至（2）营养肉汤琼脂培养基取2.0g琼脂粉加上述营养肉汤培养基100mL，加热融化后调pH为7.4，103kPa，20min灭菌，制备平板时，每皿20-25ml。
营养肉汤琼脂培养基用作基因型鉴定的结晶紫敏感试验、抗氨苄青霉素和四环素试验、紫外线敏感性试验以及细菌活力鉴定等。
（3）底层琼脂培养基成分：琼脂粉蒸馏水V-B培养基E40%葡萄糖溶液15g930mL20mL50mL2.5g5.0g2.5g500mL配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。
鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
应用
4．挥发性的液体和气体试样，可用干燥 器内试验法进行测试。
5．目前，Ames试验作为检测环境诱变剂 的一组试验中的首选试验，广泛应用于致 突变化学物的初筛。但是，与今天快信息、 高效率的社会要求相比，该试验程序还嫌 繁琐，方法不够简便，有待于创建新的更 为快速灵敏、简单易行的环境诱变剂短期 生物测试法。
❖加S9 混合液才得到阳性结果，说明该受试物 是间接致突变物
常规方法：
➢斑点试验 ➢平板掺入试验
斑点试验： 1、吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml，注入
融化并保温45℃左右的上层软琼脂中，需S9活 化的再加0.3ml－0.4mlS9混合液，立即混匀， 倾于底平板上，铺平冷凝。 2、用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸 湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于 上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对 照，分别贴放于平板上相应位置。 3、平皿倒置于37℃温箱培养48h。在纸片外围 长出密集菌落圈，为阳性；菌落散布，密度与 自发回变相似，为阴性。
❑ Ames试验
❖原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营 养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能 力。即组氨酸突变菌(his-) 在不含组氨酸的最低营养 平皿上不能生长；回复突变成野生型(his+)，可在不 含组氨酸的最低营养平皿上生长。 ❖是应用最广泛的检测基因突变的体外试验。
鼠伤寒沙门氏菌 野生型（his＋）
受试物 试验菌种
(his-) S9
正向突变 回复突变
鼠伤寒沙门氏菌 突变型（his－）
试验菌种 (his-) S9
Ames试验原理
❑ Ames试验
结果判断: ➢ 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为
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实验原理
1 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验
鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。
假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。
某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备S9混合液。
10％s9混合液的配制：每10mL由以下成分组成，临用时配制。
活化系统（s-9和s-9混合液）的制备
用哺乳动物如大鼠，经诱导剂处理，取肝组织制备匀浆，9000g离心，上清液为s-9组分，与辅助成分以适当比例组成s-9混合液，用作试验中的代谢活化系统。
磷酸盐缓冲液（0．2mol/L，pH7．4） 6．0mL
氯化钾溶液（1．65mol/L） 0．2mL
氯化镁溶液（0．4mo1／L） 0．2mL
葡萄糖-6．磷酸盐溶液（0．05mol/L） 1．0mL
辅酶-Ⅱ溶液（0．025mol/L） 1．6mL
肝s-9液 1．0mL
混匀，置冰浴中待用。