林木遗传育种资料

实验一、植物细胞减数分裂的观察

1. 原理

（1）植物细胞减数分裂是在性母细胞成熟时，配子形成过程中发生的一种特殊方式的细胞分裂。

（2）特点：各对同源染色体在细胞分裂前期配对（联会），细胞进行两次连续分裂，染色体只复制一次，形成4个配子为母细胞染色体数的一半，雌雄配子受精结合，又恢复全数染色体（2n）。

（3）通常以植物的花粉母细胞或大孢子母细胞（胚囊）为材料。（4）间期：染色体复制。

前期I 细线期

（2n个染色体）　偶线期：配对（联会）

粗线期：非姐妹染色单体交换

双线期

第I次分裂 终变期

中期I（2n）：同源染色体上的着丝点分别移向赤道面两侧。

非姐妹染色单体的交叉点排在赤道面上。

后期I（2n→n）：同源染色体分开，染色体减半。

末期I（n）

前期II

第II次分裂中期II

n 后期II

末期II

2. 方法步骤：取材、固定、保存、染色、压片、观察

（1）取材：雄蕊数量多，方便取材，易于观察。

（2）固定：卡诺固定液：无水乙醇：冰醋酸＝3：1；固定液体积至少为材料体积的15倍以

上，材料：固定液＝1：20；固定24～48 h，中间更换1次固定液。

（3）保存：70%酒精，长期保存用1份70%酒精和一份甘油的混合液。（4） 染色：卡宝品红染液：碱性染色剂→细胞核，酸性染色剂→细胞质5～10min。

（5）压片：盖玻片与载玻片夹成45°角，缓缓盖上，防止产生气泡。在盖玻片上垫一张滤

纸条，轻轻按压，吸去多余的染料。压片时不要过分用力，以免破坏细胞内特殊

结构。

倍镜40×，挑选具有

典型特征的各时期细胞进行观察。

实验二、植物细胞有丝分裂的观察

1. 原理

（1）只要能够进行细胞分裂的植物组织或细胞都可以作为观察染色体的材料。如植物的顶端分生组织（根尖和茎尖）、居间分生组织（禾本科植物的幼茎及叶壳）、愈伤组织和胚乳、萌发的花粉管等。

（2）根尖取材，处理方便，常用。

（3）有丝分裂是高等生物体细胞繁殖主要方式。分间期、分裂期。分裂期：核分裂、胞质分裂。

（4） G1期：DNA合成前期。

间期 S期：DNA合成期。

G2期：DNA合成后期。

前期

中期：染色体着丝点排列在赤道面上。

分裂期　后期

末期

2. 方法步骤

取材、预处理、固定、解离、染色、压片、观察

（1）取材：8～9时根尖

（2）预处理：

①目的：借助化学药剂的作用，把正在分裂的细胞杀死，使其结构和内含物（如Pr、脂肪、糖类、核物质、细胞器等）在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚地显现细胞在生活时不易看清的结构。

②卡诺固定液固定后转入70％酒精中保存，FAA固定液固定后可在其中保存。

（4）解离：

①作用：去掉细胞之间的果胶层，软化细胞壁，使细胞彼此分离，便于压片观察。

②解离液：1mol/L HCl，解离10min。

③解离后用清水冲洗，洗去酸，利于染色。

（5）染色：卡宝品红染色液染色5～10min 。

（6）压片：盖玻片与载玻片夹成45°角，缓缓盖上，防止产生气泡。在盖玻片上垫一张滤纸条，轻轻按压，吸去多余的染料。压片时不要过分用力，以免破坏细胞内特殊结构。

倍镜40×，挑选具有典型特征的各时期细胞进行观察。

实验三、植物多倍体诱导及细胞学观察

1. 原理

（1）植物多倍体是指体内细胞中含有3个或3个以上染色体组的个体。（2）多倍体的来源：自然发生、人工诱导和化学合成三种，其中人工诱导分物理方法和化学方法两种。多倍体因其染色体组的来源不同可分为同源多倍体和异源多倍体。

（3）秋水仙素诱导植物多倍体原理：抑制细胞分裂中期纺锤体的形成，从而阻止染色体向两极移动，使染色体停留在分裂中期的细胞内。因此染色体虽经复制，但不能分向两极，造成染色体数目加倍而成多倍体细胞。

（4）多倍体的主要特征：

①植物器官、组织或细胞的巨大性。

②营养成分含量显著提高。

③花粉粒大，萌发孔数目多，花粉粒形状变化明显。

④适应性强、抗性强。

⑤育性降低或不育。

（5）多倍体在育种上的应用：三倍体西瓜、三倍体甜菜、八倍体小黑麦。

（6）秋水仙素有毒，见光易分解，放入棕色瓶避光保存，秋水仙素废液处理后再倒掉。

2. 方法步骤

材料准备、固定、解离、染色及压片、观察

（1）材料准备：秋水仙素处理，浓度为0.2%～0.4%。

（2）固定：卡诺固定液。固定液用量是材料体积的20倍以上，对照根尖径0.05％秋水仙素处理。

（3）解离：1mol/L HCl，解离7～10min。

（4）染色5～10min。

实验四、植物总DNA的提取

1. 原理

（1） DNA与Pr以DNP（脱氧核糖核蛋白）形式存在。

（2）CTAB可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）可溶，降低溶液盐浓度（0.3 mol/L NaCl），CTAB与核酸的复合物从溶液中沉淀，经离心，将复合物同蛋白质、多糖类物质分开。然后将CTAB溶于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB溶于乙醇，这样就将DNA分离出来。

（3） CTAB提取缓冲液成分、作用

①CTAB：溶解细胞膜，结合核酸，使核酸便于分离。

②Nacl：提供高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中。

③EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性。

④Tris-HCl (pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。

⑤β-巯基乙醇（使用前加）：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

（4）分离、提纯DNA的原则

I保证DNA分子一级结构完整性：

①温度不宜过高；②控制一定的pH值范围（pH5～9）；③保持一定的离子强度；④减少物理因素对DNA的机械剪切。

II防止DNA的生物降解：

①纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质；②排除有机溶剂和金属离子的污染；③将蛋白质、多糖、脂类降到最低程度；④排除其他核酸分子的污染。

（5）氯仿/异戊醇（24﹕1）：抽取蛋白质。

异丙醇：沉淀核酸。

75%乙醇：洗沉淀，溶解CTAB。

2. 方法步骤

破碎细胞（液N）、结合成DNP（CTAB）、抽取蛋白质（重复抽取）、沉淀核酸、洗沉淀、溶解DNA、检测。

实验五、大肠杆菌质粒DNA的提取

1. 质粒DNA的构型：①SC构型：共价闭合环形DNA，质粒的两条多

核苷酸链均保持着完整的环形结构；②OC构型：开环DNA，质粒的两条多核苷酸链中一条保持着完整的环形结构，另一条链存在一处至多处断裂；③L构型：线性DNA，质粒DNA发生双链断裂而形成线性分子。

在琼脂糖凝胶电泳中的电泳迁移率由快至慢依次为：超螺旋质粒（SC）、线性质粒（L）、开环质粒（OC）。

2. 碱裂解法原理：利用共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA

片段在拓扑学上的差异进行分离。SDS使细胞崩解，释放内含物，蛋白质变性形成蛋白质-SDS复合物。同时，在pH12.0~12.5的碱性条件下，线状的染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA虽然氢键断裂，但两条互补链仍然相互盘绕而紧密结合在一起。加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，质粒DNA的两条互补链由于彼此靠近而迅速准确地复性，而线状的染色体DNA由于核苷酸链较长且两条互补链彼此已完全分开，不能迅速复性，它们相互聚集形成