碱性磷酸酶染色
干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法
干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶之一。
1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。
（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。
自来水冲洗数次。
（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。
（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。
【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。
2 偶氮偶联法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。
（六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）【步骤】（1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。
（2）蒸馏水冲洗。
（3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。
（4）流水冲洗，晾干。
（5）甘油明胶封固。
【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。
3 碱性磷酸酶染色试剂盒法：【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。
【作用液配制】取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。
【步骤】（1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。
碱性磷酸酶
碱性磷酸酶中性粒细胞碱性磷酸酶染色碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织,这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。
但它不是单一的酶，而是一组同功酶。
目前已发现有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与 AKP6 六种同功酶。
其中第 1 、 2 、 6 种均来自肝脏，第 3 种来自骨细胞，第 4 种产生于胎盘及癌细胞，而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。
血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。
生长期儿童血清内的大多数来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。
目录生物化学特征碱性磷酸酶偏高的原因碱性磷酸酶高对身体有何影响人体内的来源测定方法正常范围临床意义抑制作用•肝胆疾病引起的ALP升高•碱性磷酸酶偏低的原因生物化学特征碱性磷酸酶名字alkaline phosphatase (ALP 或 AKP)，现多用ALP细菌ALP二级结构(蓝色为N末端红色为C末端)骨软化症。
佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进时，血清碱性磷酸酶亦可升高，应加以鉴别。
研究应用碱性磷酸酶也是目前免疫诊断试剂产品最常用的标记酶之一。
与辣根过氧化物酶（HRP)相比，ALP用作标记酶的优点是，稳定性高、灵敏度高，缺点是成本高，标记困难。
在研究中最常用的ALP如下：◇细菌碱性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase (BAP), 来源：Escherichia coli C4 ；◇ Shrimp alkaline phosphatase (SAP), 来源：一种北极虾 (Pandalus borealis) ;◇ 小牛肠碱性磷酸酶Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP);◇ 胎盘碱性磷酸酶Placental alkaline phosphatase (PALP)和分泌性碱性磷酸酶the secreted alkaline phosphatase (SEAP)，后者是前者的C末端短缺版——与PALP相比，SEAP没有PALP的C末端最后24个氨基酸(这24个氨基酸构成了与糖基化磷脂酰肌醇靶向锚定的区域) ALP主要应用于分子生物学和酶免分析中：★分子生物学中主要用作核酸的去磷酸化。
碱性磷酸酶染色(NAP)
临床义
临床上主要用于鉴别： 临床上主要用于鉴别： 1. 慢性粒细胞白血病与类白血病反应： 慢性粒细胞白血病与类白血病反应： 慢性粒细胞白血病(无继发性感染者 时，NAP积分一般明显下降， 慢性粒细胞白血病 无继发性感染者)时 积分一般明显下降， 无继发性感染者 积分一般明显下降 积分常＜ 分 甚至为零分；类白血病反应时则显著增高， 积分常＜13分，甚至为零分；类白血病反应时则显著增高，积 分常＞ 分常＞200分。 分 2. 阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高， 阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高，病 情好转时， 积分则可逐渐下降。 情好转时，NAP积分则可逐渐下降。 积分则可逐渐下降 3. 急性白血病的细胞类型：ALL增高，AML下降。 急性白血病的细胞类型： 增高， 下降。 增高 下降
方法步骤
新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s 流水轻轻冲洗30 10%甲醛甲醇固定液固定30s， 30～ 1. 新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s，流水轻轻冲洗30～ 60s，待干。 60s，待干。 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10 15min。 10～ 2. 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育10～15min。 3. 流水冲洗1 ～ 2min，加苏木素染色液中复染5～8min，流水冲洗，待 流水冲洗1 2min，加苏木素染色液中复染5 8min，流水冲洗， 干，镜检。 镜检。 胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。判断标准如下： 4. 结果判断 胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。判断标准如下： 0分：胞质中无阳性染色颗粒。 胞质中无阳性染色颗粒。 1分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。 胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。 2分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。 胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。 3分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。 胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。 4分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。 胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。 5 计算阳性率和积分值。 计算阳性率和积分值。
抗凝血对中性粒细胞碱性磷酸酶染色结果的影响
天 津 市 第 三 中心 医 院 检 验 科 （０ １０ ３０７ ）
【 摘要 】 目的
观 察 Ｅ Ｔ Ｋ 抗凝血 标本放 置不 同时 间对 中性 粒细胞碱 性磷 酸 酶（ Ａ ） 色结 果的影 Ｄ Ａ— ＮＰ染
响 。方 法 将 ６ ０例 患 者 的 Ｅ Ｔ Ｄ Ａ—Ｋ 抗 凝 血 标 本 分 别放 置 ５ｒｉ ｎ及 ０ ５ １０ １５ ２ ０ｈ进 行 Ｎ Ｐ染 色 ， 色 结 ａ ． 、． 、． 、． Ａ 染 果 与 新 鲜 血进 行 比 较 分 析 。 结 果 研 究 结 果 显 示 用 Ｅ Ｔ — 凝 血标 本进 行 Ｎ Ｐ染 色 ， 本 采 集 后 立 即 固 定 ＤＡ Ｋ 抗 Ａ 标
广 东 医学
２１ ０ ２年 ６月 第 ３ ３卷 第 １ ２期
Ｇｕ ｎ ｄ ｎ ｅｉａ ｏ ｒ ａ Ｊ ｎ ０２，Ｖ １ ３， ｏ ２ ａ ｇｏ ｇＭ ｄｃｌ ｕｎ ｌ ｕ ．２ １ Ｊ ｏ．３ Ｎ ．１
・
ｌ ７３５ ・
抗 凝 血 对 中性 粒 细胞 碱 性 磷 酸酶 染 色 结 果 的 影 响
基 一 ２甲基 一１３ 二醇 ２ ６ｇ ，丙 ． 溶解 ， 加入 ０ １ Ｃ ３ ．ＮＨ １ ５ ｍ ， 加 蒸馏 水 至 ５０ ｍ ， 匀后 ｐ Ｌ再 ０ Ｌ 混 Ｈ值 调 至 ９ ４～ ． ９６ ． 。基质液 ： 磷酸 萘酚 Ａ ｓ—Ｂ ． ｇ 固 紫 Ｂ盐 ２ Ｉ ５ｍ 、 ２ ０ ｍ 、 冲液 ３ Ｌ 现 用现 配 。染 色 ： 涂 片晾干 后用 ｇ缓 ０ｍ ， 血 固定液 固定 ５Ｓ干燥后 用基质 液染 色 １ ｉ（ ７Ｉ） ， ５ｍ ｎ ３ ｃ ， ＝ 流水 冲洗好晾干 ； 苏木素 复染 １ ｉ ０ｍｎ后水 冲（ ． ％氨 ０５
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液(NAP)
中性粒细胞碱性磷酸酶染色液（NAP）预期用途：供骨髓细胞图片及血液细胞图片染色检查检验原理：本染色方法为偶氮偶联法，在PH9.2-9.8的碱性环境下，细胞中的碱性磷酸酶能将底物磷酸萘酚AS-BI水解，生成α-萘酚，再以稳定的重氮盐与萘酚偶联生成不溶性有色偶氮染料沉淀，定位于细胞浆中主要组成成分：储存条件：本试剂盒应储存于2℃-8℃低温环境。
样本要求：新鲜骨髓细胞涂片及血液细胞涂片（切勿使用抗凝血）检验方法：一、工作液配制（一）、浸染工作液配制（一份浸染工作量是43ml,至少可同时放置8-10张涂片）1、重氮盐溶液的准备：B液1ml与C液1ml彻底混匀，静置2分钟；2、染缸（自备染液缸）内加入蒸馏水40ml；3、将重氮盐溶液倒入染缸内，混匀4、再加D液1ml入染缸内，轻轻混匀（二）滴染工作液配制（一份滴染工作液是2.15ml）使用器材：一次性塑料试管、微量移液器，一次性吸嘴，滴管。
操作：取B液50μl,C液50μL混匀，静置2分钟，再加蒸馏水2ml，D液50μl,混匀，二、染色步骤1、干燥涂片，滴加A液固定剂（用前恢复室温，并充分摇匀）固定约30-60秒，蒸馏水冲洗，甩干；2、滴加或浸入工作液15分钟，蒸馏水冲洗2-3分钟，甩干3、E液(使用前务必摇匀！)复染1-2分钟，蒸馏水冲洗，干后镜检4、计算积分：反应结果以积分值报告，油镜下计数100个中性杆状核、分叶核粒细胞，分别记录其分级情况，所有阳性细胞积分相加即为积分。
如：参考范围：阳性反应主要见于成熟中性粒细胞（杆状及分叶核粒细胞）中，健康成人一般的中性粒细胞碱性磷酸酶积分值为13-130，但各个实验室条件各异，实验室应有自己的参考值。
检验结果的解释NAP阳性颗粒为蓝色检验方法的局限性仅限于形态学染色观察使用注意事项1、5Tests只限滴染使用2、使用前应恢复室温，用前请摇匀试剂；B,C液请充分混匀，所用容器必须洁净，工作液颜色为金黄色3、应采用新鲜涂片作NAP染色,放置过久则酶的活性会降低；使用抗凝血涂片染色阳性结果不稳定4、工作液配制以后应在十分钟以内使用5、需用感染发热病人或正常人外周血涂片作为阳性对照6、每次试剂使用后，请迅速盖好密封保存，以免挥发及影响效果7、本品应由专业人士使用及进行结果的判读7、使用前应详细阅读使用说明书及产品包装标识，在有效期内使用，并做好个人卫生防护8、生产批号、效期见外包装9、用后应按医院或环保部门要求处置废弃物。
碱性磷酸酶显色剂使用方法
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT (四唑硝基蓝)是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下,BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应,形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。
使用方法1. 在膜或组织切片,最后一次洗涤完毕后,加入适量BCIP/NBT染色工作液2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时),直至显色至预期深度.3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应4. 膜标本可干燥后避光保存;组织切片或细胞样品,显色反应终止后,可以用中性红复染染色干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶,同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。
成骨细胞染色方法以ALP为目标物的检测方法:1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下,以镁离子作为激活剂,能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸,磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙,再与硝酸钴作用形成磷酸钴,经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。
【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】(1)将无菌的玻片放入培养皿中,传代时加入适量的细胞悬液,作细胞爬片,呆细胞长满玻片后取出。
(2)PBS冲洗后用冷丙醇固定10min,蒸馏水冲洗数次。
(3)入孵育液中,37℃孵育4-6h。
自来水冲洗数次。
(4)2%硝酸钴中浸3-5min,蒸馏水洗数次。
(5)1%的硫化铵中2min,自来水冲洗,自然干燥,封固。
【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。
2偶氮偶联法:【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液(PH 9.2)50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10,混合后过滤使用。
碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)[发明专利]
![碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/31db71a66aec0975f46527d3240c844769eaa09c.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510631201.6(22)申请日 2015.09.29G01N 1/30(2006.01)(71)申请人上海太阳生物技术有限公司地址201108 上海市闵行区金都路3419号(72)发明人谢永华 朱美萍 许付(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人赵青朵(54)发明名称碱性磷酸酶(NAP)染色液(化学染色法)(57)摘要本发明涉及生物技术领域，公开了一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒以及染色方法。
本发明所述试剂盒包括pH 值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。
本发明以碱性磷酸酶底物替代现有萘酚AS-BI 磷酸钠盐、萘酚AS-MX 磷酸钠盐等进行NAP染色，该底物化学结构中通过引入发色基团联苯基，增强碱性磷酸酶水解底物产生的萘酚与偶氮盐反应的显色强度，从而大大提高了碱性磷酸酶的显色灵敏度和阳性染色。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书7页 附图2页CN 105181423 A 2015.12.23C N 105181423A1.一种中性粒细胞碱性磷酸酶染色试剂盒，其特征在于，包括pH值为9.2-9.8的碱性磷酸酶底物溶液，所述碱性磷酸酶底物为N-(2-甲基-5-甲氧基-4-联苯基)-3-磷酸氧基-2-萘甲酰胺。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶底物溶液中还包括基质缓冲液、稳定剂、防腐剂和无机盐。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述基质缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、2-氨基-2-甲基-1,3丙二醇缓冲液、巴比妥缓冲液、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种。
4.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述无机盐为氯化钠或氯化镁。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色实验条件探讨
中性粒细胞碱性磷酸酶染色实验条件探讨【摘要】目的探讨中性粒细胞碱性磷酸酶染色的实验条件。
方法用40%、60%、80%的丙酮-枸缘酸固定液对中性粒细胞碱性磷酸酶染色固定条件进行测定。
同时用2-氨基-2-甲基-1.3-丙二醇(pH9.4-9.6)缓冲液、巴比妥(pH9.2)缓冲液、Tris(pH9.2)缓冲液配制的基质液分别在10、15、20分钟的染色条件进行测定。
结果是选择60%的丙酮-枸缘酸固定30秒染色结果最好。
三种不同的缓冲液和三个不同的孵育时间的染色结果经多因素方差分析，P<0.05，结果有统计学意义。
结论最佳染色条件为60%的丙酮-枸缘酸固定30秒，用Tris(pH9.2)缓冲液配制的基质液，孵育时间为15分钟。
本方法帮助鉴别慢性粒细胞性白血病和类白血病有较大的实用价值。
【关键词】中性粒细胞;碱性磷酸酶;白血病;类白血病ABSTRACT Objective To discuss the experimental conditions of neutrophil alkaline phosphatase staining. Methods The immobilizing conditions of neutrophil alkaline phosphatase staining were detected by the stationary liquid of 40%， 60% and 80% acetone-citric acid， and at the same time， the staining conditions were detected at 10， 15 and 20 minutes in the matrix liquid prepared respectively with 2-amino-2-methyl-1.3-propylene glycol (PH9.4-9.6) buffer， barbital (PH9.2) buffer and Tris (PH9.2) buffer. Results Fixing in 60% acetone-citric acid for 30 seconds gave out the best staining results; the staining results of the three different buffers and the three different incubating times received the multiple factor variance analysis， the differences among them was of statistical significance (P<0.05). Conclusions The best staining conditions include fixing in 60% acetone-citric acid for 30 seconds， the matrix liquid prepared with Tris (PH9.2) buffer and incubation for 15 minutes; this method is of practical value in helping identify chronic myeloid leukemia and leukemoid reaction.KEYWORDS neutrophil alkaline phosphatase leukemia leukemoid reaction中性粒细胞碱性磷酸酶主要存在于中性成熟粒细胞，在pH9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸奈酚钠底物，释放出奈酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。
碱性磷酸酶染色
碱性磷酸酶染色
1.量45毫升去离子水，调节温度至18–26°C
2.重氮盐溶液的制备：添加1毫升的亚硝酸钠溶液，在碱性溶液 1 mL FBB。
混匀2分钟。
3.添加制备步骤2到步骤1去离子水中的溶液.
4.添加1毫升萘酚AS-BI碱性溶液，稀释的重氮盐溶液（步骤3）。
拌匀后倒入一个染色缸。
5.把柠檬酸盐- 丙酮甲醛固定液至室温（18-26℃）。
样品浸入固定液30秒。
去离子水轻轻冲洗45秒。
不要让样品干燥。
6.添加碱性染料混合物（步骤4）和孵育18–26°C ,15分钟；避光；使用后丢弃碱性染料混合物
7.孵育箱温育15分钟后，取出去离子水冲洗2分钟。
不要让切片干燥。
8.中性红溶液染色2分钟。
9.自来水冲洗和自然彻底，镜下观察。
实验十二常用血细胞化学染色
实验十二常用血细胞化学染色Cytochemistry stain for blood cells一、过氧化物酶染色染色原理粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, POX或MPO),能将底物H202分解，产生新生态氧，新生态氧可氧化四甲基联苯胶成联苯胺蓝。
联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕色的四甲基苯酿二胺，后者与亚硝基铁氧化纳结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，沉淀于细胞质内酶所在的部位。
试剂器材1．1%TMB(3,5,31,5f一四甲基联苯胶)乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88%乙醇溶液中，置棕色瓶内，冰箱保存。
2．亚硝基铁氧化锅饱和溶液在少量蒸馏水中加入亚硝基铁氰晶体，至不再溶解为止，置棕色瓶内，冰箱保存。
3．1%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。
4．稀过氧化氢溶液1%H2021滴，加10 mL蒸馏水稀释(新鲜配制)。
5．瑞氏(Wright)染色液。
6．新鲜涂片(骨髓或血片)、染色架、洗耳球、光学显微镜等。
操作步骤1．取0.1%TMB乙醇溶液1mL，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μL，溶液呈淡棕黄色，染色液应临用前配制。
2．在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上，加0.1%TMB一亚硝基铁氰化钠饱和溶液0.5mL，放置lmin，再加稀H202溶液0.7mL，吹匀，染色6min。
3．自来水冲洗，待干，用瑞氏染液复染15~20 min。
4．自来水冲洗，待干，用油镜镜检。
注意事顶1．血涂片或骨髓涂片应新鲜制作，涂片应厚薄适宜。
2．TMB配制在85%~88%的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90%~95%乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差。
3．H202需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。
涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示H202过浓。
若H202加于血片上不产生气泡，则示无效。
4．染色液pH应为5.5。
碱性磷酸酶染色试剂盒(偶氮偶联法)
产品组成：
规格
名称
3×10ml 3×20ml
Storage
S0100 (A): ALP 固定液
10ml
20ml
RT 避光
S0100 (B): ALP 孵育液 B1: AS-BI 染色液
5ml
10ml
-20℃ 避光
B2: FBB 染色液
5ml
10ml
4℃ 避光
临用前，按 B1:B2=1:1 比例混合，即为 ALP 孵育液，即配即用。
染色结果：
ALP 活性部位 细胞核
蓝色 红色(核固红)或绿色(甲基绿)
血液、骨髓涂片结果判断：
一般以积分报告结果，根据 100 个中性粒细胞阳性颗粒进行 0～4+计分。
细胞分值
染色特点
0
无颗粒
1
稍有颗粒
2
中等程度颗粒
3
多数颗粒
4
充满颗粒
临床意义： 1. 类白血病反应积分明显增高，未经治疗的慢性粒细胞白血病积分明显减低。 2. 急性细菌性感染积分明显增高，病毒性感染积分多正常或减低。 3. 再生障碍性贫血积分常增高，PNH、MDS 积分常减低。
碱性磷酸酶染色试剂盒(偶氮偶联法) 也称中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)染色液，不是采 用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，其原理是在 pH9.2～9.8 的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使 AB-BI 磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚， 后者与偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片、 冰冻切片、梯度入水后的石蜡切片等的碱性磷酸酶染色,碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于 胞桨，结果较金属盐沉淀法可靠。
碱性磷酸酶染色(NAP)
碱性磷酸酶染色（NAP）碱性磷酸酶染色（NAP）在临床的应用基本属于常规筛查的染色法。
（1）原理（偶氮偶联法）：血细胞内的碱性磷酸酶在pH 9.4～9.6的条件下将基质液中的α-磷酸萘酚钠水解，产生α-萘酚与重氮盐偶联形成不溶性灰黑色沉淀，定位于酶活性所在之处。
（2）结果判断：阳性结果为胞质内出现灰褐色至深黑色颗粒状或片状沉淀①（一）灰褐色沉淀，为0分。
②（+）胞质出现灰褐色沉淀，为1分。
③（++）胞质深褐色沉淀，为2分。
④（+++）胞质中已基本充满棕黑色颗粒状沉淀，但密度较低，为3分。
⑤（++++）胞质全被深黑色团块沉淀所充满，密度高，甚至遮盖胞核，为4分。
（3）参考值：成熟中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）的积分值为7～51。
由于各实验室的实验条件不同，正常值也有差异，应建立本实验室的正常值。
这里的正常值仅供参考。
（4）临床意义1）生理变化：①年龄变化：新生儿NAP活性增高，以后下降。
儿童期各年龄大致相似，成年期较儿童期活性减低，老年期更低。
②应激状态下的变化：紧张、恐惧、激烈运动等NAP活性可增高。
③月经周期中的变化：经前期增高，行经后降低，经后期恢复。
④妊娠期的变化：妊娠2～3个月的NAP积分值轻度增高，以后逐月增高，分娩时达高峰，产后则恢复正常。
2）病理性变化：①感染：细菌性感染时NAP积分值增高。
在细菌性感染中球菌性感染较杆菌性感染为高；在球菌性感染中，急性较慢性为高。
病毒性感染时，NAP积分值一般无明显变化。
因此本染色法有时可帮助鉴别细菌性感染和病毒性感染；②血液病：慢性粒细胞白血病的NAP积分值明显减低，常为“0”，缓解时NAP积分值上升到正常。
类白血病反应时的NAP积分值明显增高，中性杆状核粒细胞的碱性磷酸酶活性增强，甚至中性晚幼粒细胞也呈阳性反应。
因此本法常用来鉴别慢粒和类白血病反应及观察慢粒疗效的指标之一；急性粒细胞白血病时NAP积分值减低，急性淋巴细胞白血病时NAP积分值一般增高，因此本法可作为鉴别急粒和急淋的方法之一；急性单核细胞白血病时NAP积分值一般减低，有时可正常；粒细胞白血病合并细菌性感染时NAP积分值可增高，但不如单纯细菌性感染增高的明显；再生障碍性贫血的NAP积分值增高，当病情好转时，NAP积分值可下降，完全缓解时NAP活性可恢复到正常，因此本法对再障的诊断、疗效观察和估计病情均有一定意义；阵发性睡眠性血红蛋白尿的NAP积分值减低，因此本法可作为鉴别阵发性睡眠性血红蛋白尿和再生障碍性贫血的方法之一；真性红细胞增多症的NAP积分值升高，而继发性红细胞增多症的NAP积分值无明显变化。
酵母菌的染色原理
酵母菌的染色原理1. 引言酵母菌是一类单细胞真菌，广泛存在于自然界中，对于食品工业、医药工业、生物燃料等领域具有重要的应用价值。
为了更好地研究和观察酵母菌的生物学特性，科学家们发展了多种染色方法，使得酵母菌在显微镜下能够呈现出特定的颜色和形态，从而方便了对其结构和功能的研究。
染色是一种将染料应用于细胞或组织的技术，通过与细胞或组织中的特定结构或成分相亲和，使其呈现出明暗对比，以便于观察、分类和研究。
酵母菌的染色方法主要包括生理染色和化学染色两种，本文将重点介绍这两种染色方法的基本原理。
2. 生理染色生理染色即以自然存在于酵母菌细胞中的化学物质为染料，通过特定条件下的显现反应，使酵母菌细胞呈现出特定的颜色。
常用的生理染色方法有电子显微镜术(Electron Microscopic Autoradiography)和酶组化术(Enzyme Histochemistry)等。
2.1 电子显微镜术电子显微镜术是一种应用于酵母菌细胞的高分辨率显微镜术，可以观察到细胞内的超微结构。
在电子显微镜术中，常用的生理染色方法有无抑制性DNA合成的放射性核苷酸(3H-thymidine)标记法和过氧化氢酶(Horseradish Peroxidase, HRP)染色法。
2.1.1 3H-thymidine 标记法在3H-thymidine标记法中，向培养酵母菌细胞的培养基中加入3H-thymidine这一放射性核苷酸。
细胞在生长过程中会吸收并利用3H-thymidine合成DNA，而3H-thymidine的放射性可以用于追踪和定位DNA。
具体操作步骤如下：1.培养酵母菌细胞至合适的生长阶段。
2.向细胞培养基中加入一定浓度的3H-thymidine放射性标记物。
3.孵育一段时间，使细胞摄取3H-thymidine并合成DNA。
4.收集细胞，进行固定和封片。
5.利用放射自显影液使3H-thymidine的放射性信号显现。
碱性磷酸酶染色
产品简介： 碱性磷酸酶（简称 ALP 或 AKP）为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内。细胞
中的碱性磷酸酶，在碱性的缓冲液中，催化底物水解，生成物进而与一种稳定的黑色沉淀。 经本试剂盒染色后，阳性者胞浆中出现棕褐色或咖啡色颗粒。
本试剂盒采用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性。此法以天然存在的 beta-甘油磷酸钠 为底物，经酶水解释放出磷酸，磷酸根与钙离子结合为磷酸钙沉淀，再依次被置换为磷酸钴 和硫化钴，最终产物为黑色硫化钴沉淀。
结果分析： 酶活性部位：
黑色沉淀
对照片处理方法： 切片入孵育液前，先经碘、5%硫代硫酸钠溶液各 3 分钟，充分水洗后，用试剂 D 取代
试剂 A，按上述步骤处理即可。
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产品 Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒 Annexin V-EGFP/PI 凋亡试剂盒 MTT 细胞增殖及毒性检测试剂盒 CCK-8 细胞增殖毒性检测试剂盒 WST-1 细胞增殖毒性检测试剂盒 MTS 细胞增殖与毒性检测试剂盒 Hoechst33342/PI 双染试剂盒 DAPI 染色试剂盒 细胞存活率检测试剂盒
试剂盒以外自备试剂和仪器
● 蒸馏水
● 温箱或水浴锅
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咨询邮箱：bestbio@
电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
使用方法： 1、 石蜡切片脱蜡至蒸馏水。 2、 冰冻切片在丙酮-氯仿等量混合液中 4℃固定 2-5 分钟。 3、 切片入试剂 A，37℃孵育。冰冻切片 5-15 分钟，石蜡切片 2-12 小时。 4、 流水冲洗 2 分钟后入蒸馏水。 5、 入试剂 B，37℃，5 分钟。 6、 流水冲洗 5 分钟后入蒸馏水。 7、 试剂 C 用蒸馏水 50 倍稀释，即配即用。 8、 切片入试剂 C 稀释液 2 分钟。 9、 流水冲洗 10 分钟后入蒸馏水。 10. 冰冻切片用甘油明胶封片；石蜡切片常规脱水，透明，树胶封片。
两种常用固定剂碱性磷酸酶染色的灵敏度比较
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两种 常用 固定 剂 碱性 磷 酸 酶染 色 的灵 敏 度 比较
周 建 中
江西省赣州市人 民医院血液科（ ４０ ０ ３ １０ ） 中性粒 细胞碱 性磷酸 酶 （ Ａ 染 Ｎ Ｐ）
色对鉴别 诊 断血 液 病具 有 重 要 价值 。 该 染 色 常 用 １％ 甲醛 甲醇 或 ９ ％ 乙 醇 ０ ５
ｂ ｏ ｒ ｓｒ ｉ ｇｎｔ ａｙｈｐｒ ｎｉ ｔ［ ］ Ａ Ｐ ｙ ｏ ｌ ｄｐ ｓ ｅ ｎ ｅ ｅｃｌ ｙｅ ｅｓ ｅｒ ｓ Ｊ ． ｍ Ｊ ｈｓ ｌ ｏ ｅ ｕ ｉ ｌ ｔ ｖ ａ ｉ
Ｒｅ ａ ｈ ｓｏ ，２ ０ ｎ ｌＰ ｙ ｉｌ ０ ２，２ ２：Ｆ１ ． ８ ９１
表１ １ ５例 患者 骨 髓 片 固蓝 Ｒ 盐 Ｒ 表 ２ ９例 患者 骨 髓 片 固蓝 Ｂ Ｂ盐 Ｎ Ｐ Ａ
Ｎ ＡＰ染色积分情况
染色积 分情况
作 固定 剂…。两 种 固定 剂 分 别 用 于 Ｋ ｐ ｗ偶氮偶联 法 Ｎ Ｐ染 色 ， ａｌ ｏ Ａ 结果 显
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临床意义
1. 鉴别细菌性感染(增高)与病毒性感染(减低) ； 2. 鉴别慢粒(减低)和类白血病反应(显著增高)； 3.慢粒经治疗病情缓解时活性恢复正常，急变
时活性增强，有助于对病情判断； 4. 急粒时活性减低，急淋时活性增高； 5. 再障时活性增强，PNH时活性减低。
其他细胞基本呈阴性反应。
结果判断
阴性：胞浆内无沉淀物（无色） 阳性：胞浆内出现红色沉淀物
阳性率： 积分计算：观察100个成熟中性粒细胞，将每
个细胞的记分相加，即得积分。
正常人的NAP活性正常值：
中性粒细胞阳性率：68~99.5%（ 84.1% ） 阳性积分为： 30~130分
注意事项
1. 涂片应新鲜，染好片即看； 2. 低温固定，细胞不易破坏； 3. 基质液须新鲜配制； 4. 应作阴、阳性对照。
步 骤(固定、显示、复染)
1. 新鲜涂片滴加固定液（4℃）30秒，待干； 2. 将Ⅰ液置入Ⅱ液混合成为基质液。将涂片
置入，37℃温育45分钟，连缸流水冲洗 数分钟，取出待干； 3. 苏木素复AP主要存在于中性成熟粒细胞（中性 杆状核和分叶核细胞），呈阳性反应， 严重的化脓性感染时，晚幼阶段也可见 有阳性反应。
中性粒细胞碱性磷酸酶染色
实验要求：
掌握中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原 理、操作、注意事项、结果判断、正常血 细胞染色反应及临床意义。
原 理：
中性粒细胞内的碱性磷酸酶在碱性环 境下，水解α－磷酸萘酚钠，产生α－萘 酚。后者与重氮剂偶联形成有色沉淀物，沉 淀物的显色深浅与碱性磷酸酶活性成正比。
试剂：
1. NAP 固定液：含甲醇、甲醛等 2. NAP Ⅰ液：含固紫B等 3. NAP Ⅱ液：含丙二醇、磷酸萘酚钠盐等 4. 苏木素复染液：