安全输血(3)

RHD基因RCR定型
方法和靶 DNA method and Target DNA
说明 Description
第一代检测：First generation RHD genotyping Single-region RCR Test Exon 10 , intro 4. exon7
假阳性和假阴性反应 理论根据：所有的 D 阴性表型人都是缺失完整的 D 基因 （对高加索人的实验结果）
D-negative phenotypes_two major mecharisms_at the genomic level. RHD gene deletion RHDψ(psendogene):37bp insertion and nonsense mutation in RHDgene. All weak D phenotypes-:caused by coding region regions in the RHDgene.
基因工程制备的“无效”抗体一对“功能”活性的母体抗体的阻断 (a McAb-Anti-D engineered by altering in the Fc region to render it incapable
of reacting with effect cells.such a “null” antibody molecule could protect against RhHDN by binding to fetal red cells and blocking the binding of functionally active maternal antibodies.)
2.few partial D phenotypes involve just one amino acid change. 3.RoHar phenotype-small number of D epitopes.
RHCE gene exon 5 is replaced with an RHD equivalent. Recent work has concluded that the terms weak and pmtial D phenotypes should be reploced by the term”ABERRANT-D”,as all weak D phenotypes investigated illustrate a unique D phenotype.Wagner Blood 2000 95:2699-2708.
正反定型不符及原因
实验者操作错误 红细胞标本问题 血清标本
血型检定
《《人类红细胞血型学实用理论与实验技术》(P126表15-1)
实验者操作错误
假阳性： 离心速度时间过↑ 试剂或细胞标本盐水污染 不干净试管
......
假阳性： 未加入抗体↑
不认识溶血-为阳性反应 试剂失效或不合格试剂 抗体与细胞比例少
血型检测:
ABO血型
常规检测 正反定型不符及原因 ABO血型亚型 获得性B、T多凝集
RH血型
检测原则及结果处理 常规方法 试剂
不规则抗体 检测和鉴定:
常规检测
常规要求 基本试验技术
抗体鉴定
一般程序及简单鉴定 复杂抗体鉴定
交叉配血:
盐水交叉配血试验 不完全抗体配血试验
血型检定
《《人类红细胞血型学实用理论与实验技术》(P126表15-1)
第三代检测 Third generation Test
The prevalence of silent RHD alleles in other population
multiplex PCR
groups is only portially resolred.(Del-Japanese)
同时检测RHD 阴性的RHD 缺失和假RHD（RHDψ4） Exon4 PCR product RHD:498bp
Vox Sang 2000;78 (suppl):079-082
Monoclonal Antobodies to RhD-Development and used. Marion L Scott.Donglas Voak. The last work-shop clustered the 103 anti-D monoclonal antibodies studied into 24 specificity (epitope)gwaps. No one anti-D monoclonal antibody has been found that is capable of reacting with all partial D type.
交叉配血
临床有意义抗体和无意义抗体 完全抗体和不完全抗体
3. 检测技术和方法：
对完全抗体的检测 对不完全抗体的检测 （或应用完全抗体的检测、 应用不完全抗体的检测）
血型血清学检测和安全输血
要点
1、ABO血型由Ag-Ab两者决定-不能只检“一半血型” 2、病理和生理情况-ABO血型正反检测结果不一致 3、单抗试剂质量要求和安全输血关系：多凝集-获得性B 4、血型定型只是输血前血型血清学检测程序一部分
红细胞血型免疫分子生物学研究和临床应用：
安全输血
• 红细胞血型ISBT规范分类、命名及表述 • 组织血型和器官血型 • 红细胞ABO血型、基因、表型亚型 • RH血型：基因结构、表型 • 输血前血型检测
抗体筛检和交叉配血试验结果分析
输血前血型血清学检测程序
《《人类红细胞血型学实用理论与实验技术》(P125-163)
ABO血型 血型血清学亚型及抗原变化
分类主要根据:
1. 抗原性弱 2. 正反定型-血清抗体反应强度 3. 红细胞H抗原性强度 4. 唾液中ABH血型抗原量和中和能力 5. 凝集状况：混和凝集或弱凝集 6. 红细胞吸收放散抗A、抗B能力
输血前血型血清学检测
要点
1. 检测程序：
2. 抗体性质：
血型检测 不完全抗体的检测
......
血型检定
《《人类红细胞血型学实用理论与实验技术》(P126表15-1)
红细胞标本问题
相容但不同型输血或骨髓移殖后， 弱抗原性:亚型、恶性肿瘤、老年人 获得性和遗传性多收集T/Tn， 血清标本ABOAg↑-中和抗体试剂， 自身凝集素包被自身红细胞 ......
血型检定
《《人类红细胞血型学实用理论与实验技术》(P126表15-1)
allered D antigen expression (lack some D epitopes) (previous dogma that weak D phenotype individuals have merely quartitative but not qualitative differerces in RhD antigon is incorrect.) Partial D phenotypes-1.majority of partial D phenotypes are “Knockonts” where loss of epitopes.
（RHD.RHC/c genotyping 源自文库ssay）
RHDψ:535bp
RHD exons4 and 7
RHC:320bp intron2
RHCE intro 2 or exon 2
RHc:177bp exton2
Vox Sang 2000;78(suppl 2):083-089
Site Directed Mutagenesis of the Human RhD Antigen: Molecular Basis of D Epitopes. Neil D.Avent.Wendy Liu...Douglas Voak.
(poly or monocloual)is not recommened for patient testing.because of the risk of false positives. 3.Reagents used for routine patient typing should not detedt D Ⅵ_for the reason that DⅥ individuals lack much of the normal D antigen,and therefore readily make potent anti-D when transfused with D positive blood. For REFERENCE laboratorips: panel of monoclonal anti-D with different epitopet specificities are invaluable-samples with aberrant D typing resutls or individual who type as RhD positive but have anti-D in their seaum.
第二代检测：Second Generation Test
multiple SSPs (i.e.sepatate tube PCRs)选择与 RhcE 基因不同的 至少两个 RHD 的外显子 exons.
mulliplex PCR 选择所有的 RHD-特异性外显子 exons
假阳性和假阴性反应多试管中反应（每一引物,一试管） 假阳性反应（在非州人和日本人中高频率）,固 D－人可能 有无功能 RHD 单一试管中反应（多引物,一试管中）
血清标本
纤维蛋白凝块
治疗病人、老人
不规则抗体↑
规则抗体↓:免疫抑制病、免疫抑制
<6月婴儿、老年人
骨髓移植，大量输血浆 ......
ABO 血型血型血清学亚型及抗原变化
分类主要根据 血清学特征：表15.2、P131 新的ABO亚型或变异型B（A） 多凝集红细胞：表14-1、P119 获得性B红细胞
应用抗D单克隆抗体的意义
1、研究和认识RhD抗原的结构 2、高特异性的血型试剂 3、用于细胞流式仪检测胎母出血（FMH） 4、用于ELISA对预防性抗D定量检测 5、用于新生儿溶血病的抗D预防性制剂 BRAD-3（IgG3),BRAD-5(IgG1) 6、engineered-“null”“antibody”－“block” －functional active maternal antibodies.
IN DLAGNOSTICS For DORNOR typing: 1.Type all presentations of RhD that could cause immunization in a D negative individual as D positive. 2.Use afasingle monoclonal auti-D is therefore not acceptable. 3.The most common stuategy is to use ①one high avidity IgM monoclonal anto-D that gives strong reactivity with normal D phenotype,DⅣ and DⅤ but does not react with DⅥ ②alongside a polyclonal or other monoclonal reagent that has been specifically selected for detection of D Ⅵ and very weak D. For PATIENT typing: 1.Weak D and partial D individual are typing as D negative,as they will then safely be given D negative blood. 2.Detection of weak D by antigloblm tests with an IgG anti-D.
血型血清学检测和安全输血
要点
1、D弱型-产生抗D 2、D抗原阳性-献血员和病人为D阳性或阴性？ 3、抗D试剂要求：效价？识别表位？ 4、血型血清学结果和分子生物学结果与安全输血关系？
血型血清学检测和安全输血
要点
结论
1、规范化、标准化检测程序重要性！！ 2、目前临床问题：忽视对不完全抗体的检测 3、血型基础研究成果、新技术促进安全输血