胃癌胰腺被膜及横结肠系膜前叶转移规律及其临床意义
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资料与方法
一、临床资料 本组 83 例胃癌患者,行开腹手术 78 例，腹腔镜手术 5 例。入选病例不包括术前及术中发现已有远处 转移、腹腔种植、胰腺受侵犯者（图 1）。所有患者术前均经胃镜及病理证实。其中男 56 例，女 27 例，年龄 37 ～ 76 岁，平均年龄 53 岁。浆膜受累 52 例，未受累 31 例。高、中分化癌 26 例，低分化癌 57 例。淋巴结转 移 55 例，无转移 28 例。Ⅰ、Ⅱ期 37 例，Ⅲ、Ⅳ期 46 例。
【关键词】 腹腔镜胃癌根治术； 胰腺被膜； 细胞角蛋白 20
The investigation of capsul of the pancreas dissection in the laparoscopic radical surgery of distal gastric cancer DING Ming-feng， XU Jun， LIU Chang， WANG Zhi-fei. Department of General Surgery， The Fourth Affiliated Hospital of Ha'rbin Medical University， Ha'rbin 150001, China Corresponding author：XU Jun，E-mail:dmf741210@yahoo.com.cn
83 例胃癌患者中，42 例于 256 bp 处可见 CK 20 mRNA 的特异性条带，其中 40 例于 248 bp 处可见 CEA mRNA 的特异性条带；41 例 PCR 检测结果均为阴性。癌肿块是 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 表达的胃 癌细胞株，作为阳性对照分别在 256 bp、248 bp 处可见 CK20 mRNA、CEA mRNA 的特异性条带。各样本 GAPDH 对照均在相应位置出现明显扩增条带，表明提取的 mRNA 质量及 PCR 反应过程良好（图 5 ~ 7 ）。
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中华腔镜外科杂志（电子版）2010 年 8 月第 3 卷第 4 期 Chin J Laparoscopic Surgery（Electronic Edition），August 2010，Vol 3，No.4
· 临床研究 ·
胃癌胰腺被膜及横结肠系膜前叶转移规律 及其临床意义
丁明锋 许军 刘昶 王知非
【Key words】 Laparoscopic resection of gastric cancer； Capsul of the pancrea； Cytokeratin-20
DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6899.2010.04.007 作者单位：150001 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第四医院普外科 通讯作者：许军，E-mail:dmf741210@yahoo.com.cn
图1
二、方法 1. 标本制备。术中探查腹腔后，行胃癌根治术，术中整块切除胰腺被膜及部分癌组织。所有胰腺被膜标 本均分成两部分，一部分置福尔马林液送病理室行免疫组化 SP（streptavidin-perosidase ）法检查，另一部分 及癌组织立即置于－80 ℃ 液氮罐中备用。 2. 免疫组化研究。胃癌根治术后切除胰腺被膜制成两张 5 μm 厚连续石蜡切片，做抗细胞角蛋 白 20（cytokeratin-20，CK20） 抗 体 及 癌 胚 抗 原 （carcino-embryonic antigen ，CEA）的 免 疫 组 化 SP 染色。 鼠抗人单克隆抗体 CEA、CK20 及免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。染色步骤按 SP 试剂盒 说明书进行，显色剂为 DAB。每批设已知胃癌阳性切片做阳性对照，用磷酸盐缓冲液 （phosphate buffer Solution，PBS）代替一抗做阴性对照。根据胞浆棕染再结合细胞形态确定微转移，只要切片中见到一个细胞 染色，就可以确定为 CK20 、CEA 染色阳性，即胰腺被膜转移。 3. 腺被膜 CK20 mRNA、CEA mRNA 的检测。每列存储于液氮中的胰腺被膜做 CK20 mRNA、CEA mRNA 检测，采用 mRNA 抽提试剂盒（B.M 公司）提取胰腺被膜 RNA，采用 PrimeScriptTMRTase, 2 Step PCR 试剂盒 （上海生工生物工程技术服务有限公司）行逆转录。操作步骤按照试剂盒说明书进行。 4. PCR 扩增。CK20 mRNA、CEA mRNA 产物，上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物序列。 CK20 mRNA 巢式 PCR 上游引物（CKP1)A：5′-CCTCCCAGAGCCCTTGAGATAGAAC-3′，下游引物(CKP2)B: 5′ -CTGATAAATAGGATTCCCGCCAC-3′ ， 产 物 长 度 为 256 bp。 CEA Mrnart PCR 上 游 引 物（CEAP1）C: 5 ′ -CACAGAAGGAGGAAGGACAGCAC-3′，下游引物（CEAP2）D：5′-AATCGTGACTTGGGCAGTTGTG-3′，产 物 长度为 248 bp。内对照为甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序 列，上游引物：5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG GG-3′, 下游引物：5′-ATG AGT GAG TTG AAG GTA GTT TCG TGG AT-3′，产物长度为 232 bp。反转录 PRC（reverse transcription-PCR，RT-PCR）按说明书反应分 两步，第一步 RNA 模板反转录为 cDNA，第二步取第一步逆转录产物各 2 μl，CK20 RNA 的引物为 A、B，
5. 阴、阳性对照设置。以胃癌细胞 SGC-7901 相应 mRNA 为阳性对照，阴性对照组采用空白对照，即除 不加模板外，其他各种成分与待测样品相同。各样本以 GAPDH 作为内对照。
6. 电泳。分别取 25 μl PCR 反应产物行 2 ％ 琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳 CK20 mRNA（120 V， 30 min），CEA mRNA（ 120 V，30 min ），紫外灯下鉴定有无 CK20 mRNA、CEA mRNA 特异性条带。
【摘要】 目的 探讨胃癌胰腺被膜及横结肠系膜前叶转移规律，指导腹腔镜胃癌根治术胰腺被 膜及横结肠系膜前叶切除的合理性。方法 回顾分析 2007 年 1 月至 2008 年 7 月收治的 83 例行胃 癌根治术清扫胰腺被膜患者的临床资料，利用免疫组化及聚合酶链式反应（ PCR ）等方法对各期胃癌 胰腺被膜转移进行相关性分析。结 果 细胞角蛋白 20（CK20）、癌胚抗原（CEA）检测阳性率分别为 24.1％（20/83）、26.5％（22/83），CK20 mRNA、CEA mRNA 阳性率分别为 50.6％（42/83）、38.6％（32/83）。胃 癌胰腺被膜癌转移与肿瘤的浸润深度、病理分型、临床分期、淋巴结转移有关 ( P ＜ 0.05 ),而与患者的 年龄、性别无关 ( P ＞ 0.05)。结论 在胃癌根治术中可以选择性清扫胰腺被膜，为腹腔镜胃癌根治术进 行选择性清扫胰腺被膜提供了依据。
中华腔镜外科杂志（电子版）2010 年 8 月第 3 卷第 4 期 Chin J Laparoscopic Surgery（Electronic Edition），August 2010，Vol 3，No.4
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合理的腹腔镜胃癌根治术是既提高胃癌手术效果及患者生存率又兼顾微创理念的重要环节，目前国内 外对于行腹腔镜胃癌根治术是否清扫胰腺被膜及横结肠系膜前叶尚无一致意见 [1-2]。本文回顾分析我院 2007 年 1 月至 2008 年 7 月期间 83 例行胃癌根治术清扫胰腺被膜患者的临床资料，利用免疫组化及聚合 酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）等方法对这一问题作一探讨。
三、统计学处理 采用 SPSS 13.0 软件包进行统计分析，采用 χ2检验，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。
结果
细胞免疫组化检查发现，20 例胃癌患者的胰腺被膜 CK20 免疫组化表达阳性，阳性率为 24.1 ％（20/83）， 22 例 CEA 免疫组化表达阳性，阳性率为 26.5 ％（22/83），而且所有 CK20、CEA 阳性病例的 CK20 mRNA、 CEA mRNA 的 PCR 检测结果均为阳性（图 2 ~ 4）。
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中华腔镜外科杂志（电子版）2010 年 8 月第 3 卷第 4 期 Chin J Laparoscopic Surgery（Electronic Edition），August 2010，Vol 3，No.4
CEA RNA 的引物为 C、D，各 0.5 μl，TAQ 酶 0.5 μl，去离子水 16.5 μl ，共 25 μl 反应体系。反应条件：94 ℃ 变性 30 s,一个循环；94 ℃变性 30 s ，54 ℃退火 30 s ，72 ℃延伸 30 s，共 30 个循环；72 ℃，7 min。
【Abstract】 Objective Investigate the occurrence of gastric cancer micrometastasis of factors and the law, for the establishment of individualized surgical treatment options to provide more reliable basis. Methods From January 2007 to July 2008 during the open radical gastrectomy and laparoscopic resection of gastric cancer pancreatic capsule cleaning clinical data. The use of tissue pathology, immunohistochem来自百度文库stry and PCR methods to confirm whether laparoscopic radical gastrectomy should be selective removal of the pancreas capsule. Results The regular pathology was negative of all the 83 patients, but CK20 and CEA positive cells were found in the capsul of the pancreas of 20 patients ( 24.1 % ) and 22 patients ( 26.5 % ). CK20 mRNA and CEA mRNA positive cells were found in the capsul of the pancreas of 42 patients ( 50.6 % ) and 32 patients ( 38.6 % ). Envelope of pancreatic metastasis of gastric cancer with depth of tumor invasion, pathological type, clinical stage, lymph node metastasis ( P < 0.05 ), and with the patients age, sex ( P > 0.05 ). Conclusions Capsul of the pancreas should be selectively dissected in the surgery of distal gastric cancer, which also provides an evidence for such procedure in laparoscopic radical resection of gastric cancer.
一、临床资料 本组 83 例胃癌患者,行开腹手术 78 例，腹腔镜手术 5 例。入选病例不包括术前及术中发现已有远处 转移、腹腔种植、胰腺受侵犯者（图 1）。所有患者术前均经胃镜及病理证实。其中男 56 例，女 27 例，年龄 37 ～ 76 岁，平均年龄 53 岁。浆膜受累 52 例，未受累 31 例。高、中分化癌 26 例，低分化癌 57 例。淋巴结转 移 55 例，无转移 28 例。Ⅰ、Ⅱ期 37 例，Ⅲ、Ⅳ期 46 例。
【关键词】 腹腔镜胃癌根治术； 胰腺被膜； 细胞角蛋白 20
The investigation of capsul of the pancreas dissection in the laparoscopic radical surgery of distal gastric cancer DING Ming-feng， XU Jun， LIU Chang， WANG Zhi-fei. Department of General Surgery， The Fourth Affiliated Hospital of Ha'rbin Medical University， Ha'rbin 150001, China Corresponding author：XU Jun，E-mail:dmf741210@yahoo.com.cn
83 例胃癌患者中，42 例于 256 bp 处可见 CK 20 mRNA 的特异性条带，其中 40 例于 248 bp 处可见 CEA mRNA 的特异性条带；41 例 PCR 检测结果均为阴性。癌肿块是 CK20 mRNA 和 CEA mRNA 表达的胃 癌细胞株，作为阳性对照分别在 256 bp、248 bp 处可见 CK20 mRNA、CEA mRNA 的特异性条带。各样本 GAPDH 对照均在相应位置出现明显扩增条带，表明提取的 mRNA 质量及 PCR 反应过程良好（图 5 ~ 7 ）。
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中华腔镜外科杂志（电子版）2010 年 8 月第 3 卷第 4 期 Chin J Laparoscopic Surgery（Electronic Edition），August 2010，Vol 3，No.4
· 临床研究 ·
胃癌胰腺被膜及横结肠系膜前叶转移规律 及其临床意义
丁明锋 许军 刘昶 王知非
【Key words】 Laparoscopic resection of gastric cancer； Capsul of the pancrea； Cytokeratin-20
DOI：10.3877/cma.j.issn.1674-6899.2010.04.007 作者单位：150001 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第四医院普外科 通讯作者：许军，E-mail:dmf741210@yahoo.com.cn
图1
二、方法 1. 标本制备。术中探查腹腔后，行胃癌根治术，术中整块切除胰腺被膜及部分癌组织。所有胰腺被膜标 本均分成两部分，一部分置福尔马林液送病理室行免疫组化 SP（streptavidin-perosidase ）法检查，另一部分 及癌组织立即置于－80 ℃ 液氮罐中备用。 2. 免疫组化研究。胃癌根治术后切除胰腺被膜制成两张 5 μm 厚连续石蜡切片，做抗细胞角蛋 白 20（cytokeratin-20，CK20） 抗 体 及 癌 胚 抗 原 （carcino-embryonic antigen ，CEA）的 免 疫 组 化 SP 染色。 鼠抗人单克隆抗体 CEA、CK20 及免疫组化试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。染色步骤按 SP 试剂盒 说明书进行，显色剂为 DAB。每批设已知胃癌阳性切片做阳性对照，用磷酸盐缓冲液 （phosphate buffer Solution，PBS）代替一抗做阴性对照。根据胞浆棕染再结合细胞形态确定微转移，只要切片中见到一个细胞 染色，就可以确定为 CK20 、CEA 染色阳性，即胰腺被膜转移。 3. 腺被膜 CK20 mRNA、CEA mRNA 的检测。每列存储于液氮中的胰腺被膜做 CK20 mRNA、CEA mRNA 检测，采用 mRNA 抽提试剂盒（B.M 公司）提取胰腺被膜 RNA，采用 PrimeScriptTMRTase, 2 Step PCR 试剂盒 （上海生工生物工程技术服务有限公司）行逆转录。操作步骤按照试剂盒说明书进行。 4. PCR 扩增。CK20 mRNA、CEA mRNA 产物，上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物序列。 CK20 mRNA 巢式 PCR 上游引物（CKP1)A：5′-CCTCCCAGAGCCCTTGAGATAGAAC-3′，下游引物(CKP2)B: 5′ -CTGATAAATAGGATTCCCGCCAC-3′ ， 产 物 长 度 为 256 bp。 CEA Mrnart PCR 上 游 引 物（CEAP1）C: 5 ′ -CACAGAAGGAGGAAGGACAGCAC-3′，下游引物（CEAP2）D：5′-AATCGTGACTTGGGCAGTTGTG-3′，产 物 长度为 248 bp。内对照为甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序 列，上游引物：5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG GG-3′, 下游引物：5′-ATG AGT GAG TTG AAG GTA GTT TCG TGG AT-3′，产物长度为 232 bp。反转录 PRC（reverse transcription-PCR，RT-PCR）按说明书反应分 两步，第一步 RNA 模板反转录为 cDNA，第二步取第一步逆转录产物各 2 μl，CK20 RNA 的引物为 A、B，
5. 阴、阳性对照设置。以胃癌细胞 SGC-7901 相应 mRNA 为阳性对照，阴性对照组采用空白对照，即除 不加模板外，其他各种成分与待测样品相同。各样本以 GAPDH 作为内对照。
6. 电泳。分别取 25 μl PCR 反应产物行 2 ％ 琼脂糖凝胶（溴化乙锭染色）电泳 CK20 mRNA（120 V， 30 min），CEA mRNA（ 120 V，30 min ），紫外灯下鉴定有无 CK20 mRNA、CEA mRNA 特异性条带。
【摘要】 目的 探讨胃癌胰腺被膜及横结肠系膜前叶转移规律，指导腹腔镜胃癌根治术胰腺被 膜及横结肠系膜前叶切除的合理性。方法 回顾分析 2007 年 1 月至 2008 年 7 月收治的 83 例行胃 癌根治术清扫胰腺被膜患者的临床资料，利用免疫组化及聚合酶链式反应（ PCR ）等方法对各期胃癌 胰腺被膜转移进行相关性分析。结 果 细胞角蛋白 20（CK20）、癌胚抗原（CEA）检测阳性率分别为 24.1％（20/83）、26.5％（22/83），CK20 mRNA、CEA mRNA 阳性率分别为 50.6％（42/83）、38.6％（32/83）。胃 癌胰腺被膜癌转移与肿瘤的浸润深度、病理分型、临床分期、淋巴结转移有关 ( P ＜ 0.05 ),而与患者的 年龄、性别无关 ( P ＞ 0.05)。结论 在胃癌根治术中可以选择性清扫胰腺被膜，为腹腔镜胃癌根治术进 行选择性清扫胰腺被膜提供了依据。
中华腔镜外科杂志（电子版）2010 年 8 月第 3 卷第 4 期 Chin J Laparoscopic Surgery（Electronic Edition），August 2010，Vol 3，No.4
321
合理的腹腔镜胃癌根治术是既提高胃癌手术效果及患者生存率又兼顾微创理念的重要环节，目前国内 外对于行腹腔镜胃癌根治术是否清扫胰腺被膜及横结肠系膜前叶尚无一致意见 [1-2]。本文回顾分析我院 2007 年 1 月至 2008 年 7 月期间 83 例行胃癌根治术清扫胰腺被膜患者的临床资料，利用免疫组化及聚合 酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）等方法对这一问题作一探讨。
三、统计学处理 采用 SPSS 13.0 软件包进行统计分析，采用 χ2检验，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。
结果
细胞免疫组化检查发现，20 例胃癌患者的胰腺被膜 CK20 免疫组化表达阳性，阳性率为 24.1 ％（20/83）， 22 例 CEA 免疫组化表达阳性，阳性率为 26.5 ％（22/83），而且所有 CK20、CEA 阳性病例的 CK20 mRNA、 CEA mRNA 的 PCR 检测结果均为阳性（图 2 ~ 4）。
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中华腔镜外科杂志（电子版）2010 年 8 月第 3 卷第 4 期 Chin J Laparoscopic Surgery（Electronic Edition），August 2010，Vol 3，No.4
CEA RNA 的引物为 C、D，各 0.5 μl，TAQ 酶 0.5 μl，去离子水 16.5 μl ，共 25 μl 反应体系。反应条件：94 ℃ 变性 30 s,一个循环；94 ℃变性 30 s ，54 ℃退火 30 s ，72 ℃延伸 30 s，共 30 个循环；72 ℃，7 min。
【Abstract】 Objective Investigate the occurrence of gastric cancer micrometastasis of factors and the law, for the establishment of individualized surgical treatment options to provide more reliable basis. Methods From January 2007 to July 2008 during the open radical gastrectomy and laparoscopic resection of gastric cancer pancreatic capsule cleaning clinical data. The use of tissue pathology, immunohistochem来自百度文库stry and PCR methods to confirm whether laparoscopic radical gastrectomy should be selective removal of the pancreas capsule. Results The regular pathology was negative of all the 83 patients, but CK20 and CEA positive cells were found in the capsul of the pancreas of 20 patients ( 24.1 % ) and 22 patients ( 26.5 % ). CK20 mRNA and CEA mRNA positive cells were found in the capsul of the pancreas of 42 patients ( 50.6 % ) and 32 patients ( 38.6 % ). Envelope of pancreatic metastasis of gastric cancer with depth of tumor invasion, pathological type, clinical stage, lymph node metastasis ( P < 0.05 ), and with the patients age, sex ( P > 0.05 ). Conclusions Capsul of the pancreas should be selectively dissected in the surgery of distal gastric cancer, which also provides an evidence for such procedure in laparoscopic radical resection of gastric cancer.