蛋白印迹分析技术(Western Blot)
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♦呈指数增长
理论值： 理论值：一轮一倍
10轮 103=1000倍 轮 倍 20轮 106 轮 30 轮 109
模板扩增30轮 理论 模板扩增 轮 1ng-----------1g 模板扩增30轮 实际 模板扩增 轮 1ng-----------10µg µ
（二）基本要素
1 Taq DNA聚合酶： 聚合酶
外界影响：
EDTA鳌合Mg2+ ∴选较低浓度TE(10mM Tris,1mMEDTA)； DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+ 结合， 降低Mg2+ 有效浓度。 ∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的 如果扩增产物或效率不理想，
Mg2+浓度
6.温度和时间：
（1）变性温度：94-95℃ Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑ （2）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于Tm值：Tm↑退火T↑； Tm↓退火T↓ 若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度 （3）延伸： ≤500nt---1min >500nt－－3min 一般：40－60sec
（5）primer
5’端增加碱基 5 端增加碱基
①内切酶识别点： 内切酶识别点：
（G）GAATTC GCTCCATGACCCAG ↑保护bp 对PCR产物cloning有很大好处 便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同 EcoRI 1 BglII 2-3 XbaI 2-3 HindⅢ >3 BamHI 2-3 PstI >4 XhoI >4 NotI >10 如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆 ∵未切开，连接不上
操作流程
（1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）； （2）靶基因样品的制备；
靶基因的制备：RT-PCR （设实验组和对照组） 标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和Cy5
（3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似
封闭 预杂交 杂交 洗脱
（4）杂交信号的检测与结果的分析
激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析
②ATG起始密码 ③TAA、TAG、TGA终止密码 如： 可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外 区。
3.模板： 3.模板
可选：DNA 可选 mRNA→逆转录→cDNA DNA包括： 质粒 较小 变性较易 模板用量 Plasmid:lng Chromosome:300-500ng 注意： 防止交叉污染 噬菌体 较大 变性较难 染色体DNA ①目的gene是单拷贝 ②非常大，变性难
影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：
1 2 3 4 5
DNA分子的大小 构象 凝胶浓度 电压 缓冲液
琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成
PCR产物的琼脂 糖电泳
聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析
特殊的凝胶电泳
倒转电场凝胶电泳（FIGE）：用于分 离分子量10～2000kb的DNA分子； 钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）：可 分离大于107bp的DNA分子
¤
（2）Primer 本身不要出现内部互补序列 形成loop环，内部二级结构 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （3）注意减少Primer间互补序列 导致2个Primer形成dimer 一般不要超过3个互补bp 如：CCCATGC : : : : GGGTCTA ATGGAGTC : : : : TCAGTAAGC
核酸和蛋白质分析技术
第一节
核酸分析技术
讲述内容： 1、核酸电泳 2、杂交技术 3、PCR技术 4、基因芯片
一、核 酸 电 泳
（一）DNA的凝胶电泳
凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开， 能容纳相对大量的DNA
用于核苷酸多态性的分析
琼脂糖凝胶电泳的基本过程
材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶
液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳 时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。
基本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并 上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时 间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶 成像系统紫外灯下观察并照相保存结果
二 核酸杂交技术
（一）Southern Blot 原理： 原理：
将待检测的DNA分子用 不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖 分子用/不用限制性内切酶消化后 将待检测的 分子用 不用限制性内切酶消化后， 凝胶电泳进行分离， 凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移 到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上， 到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记 物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针 探针进行反应。 物标记的 或 探针进行反应 互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合， 互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针 洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测， 洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检 的片段及其相对大小。 的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的 及其含量， 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态 如是否有 及其含量 了解基因的状态, 点突变、扩增重排等。 点突变、扩增重排等。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（ 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA） ） 及其含量。 及其含量。
操作过程
mRNA提取
甲醛变性电泳 洗膜
印迹转移
预杂交
杂交（变性探针）
放射自显影或化学发光
（三）探针标记技术
1 标记物：放射性和非放射性两种 放射性： 32P、35S和3H 、 和
4.dNTP： 4.dNTP：
四种脱氧核苷酸， 四种脱氧核苷酸，基本原料 终浓度：50µ 终浓度：50µM 注意：不稳定，保存时间长会失效 注意：不稳定，
5.Mg2+
TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+ 不同的酶需不同Mg2+ Taq：较少，Mg2+ 对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度 pfu：Mg2+ 2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍
（三）PCR技术的应用
1. 2. 3. 4. 基因检测： 基因克隆化 DNA突变 DNA序列分析
四、基因芯片
利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究 背景资料
基因芯片（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ）就是利用点样机等机械装置，在玻璃 等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有 可与一种基因杂交的一条ＤＮＡ探针。由于芯片上有序地排列着ＤＮＡ探 针，因此也被称为微阵列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。在芯片上滴加样品 后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（ｃＤＮＡ或ｃＲＮＡ） 就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧 光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的 表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分 析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯 片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。
基因芯片的应用
用于基因转录水平的检测、基因组分析 和后基因组研究
Southern Blot 操作步骤： 操作步骤：
DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 洗膜 预杂交
杂交（变性探针） 杂交（变性探针）
放射自显影或显色
（二）Northern Blot
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼 原理 在变性条件下将待检的 样品进行琼
脂糖凝胶电泳，继而按照同 脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同 相同 的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
pfu DNA 聚合酶
耐热
5’→3’DNA聚合酶活性 → 聚合酶活性
3’→5’外切酶活性 精确度：pfu >Taq 但pfu扩增效率通常比Taq酶略差 文献报道： 文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果
2 .引物
人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃， Tm值要相近，每条10-50pmol /100µl ◆设计原则： （1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同 3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同 正链5'————— 3' ——上游Primer ——下游Primer 负链 3'————— 5' 例如： IL-3正链 5'GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3' 负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT 5' 上游~： 与其相同 下游~： 先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3' 所以负链Primer：5'-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3'
（一）原理： 原理：
双链DNA通过高温变性解离成互补单链 通过高温变性解离成互补单链DNA －－－变性 －－－变性 双链 通过高温变性解离成互补单链 ↓ 与一对寡核苷酸引物（ ， ） 与一对寡核苷酸引物（5’， 3’）降低温度退火 DNA加热变性 引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火 加热变性+引物慢慢冷却使其结合 形象地称为退火 加热变性 引物慢慢冷却使其结合， ↓ 适温延伸5’/3’引物形成新链变成 条链 引物形成新链变成4条链 －－延伸 适温延伸 引物形成新链变成 条链DNA －－延伸 ↓ 第二轮：变性 退火 退火—延伸 第二轮：变性—退火 延伸
注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套 注意：溴化乙锭具有致癌性，
不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
（％，W/ V ) 琼脂糖浓度（％， DNA分子的有效分离范围（kb) 分子的有效分离范围（ 分子的有效分离范围
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
非放射性：生物素 生物素、地高辛素、荧光素 生物素
2、 2、标记方法
（1）切口平移法 （2）随机引物法 （3）末端标记法 （4）单链DNA探针标记 （5）寡核苷酸探针标记法
三 PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作 为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的 多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增 产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增 倍数可达106。 Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学 奖； 目的: 目的 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。
（二）RNA 电 泳
基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是， 因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此 必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所 有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严 RNA 格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外， 因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳 结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常 用的变性剂为甲醛和戊二醛。
水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 水生栖热菌 的 聚合酶 聚合酶活性； ①5’→3’DNA聚合酶活性； → 聚合酶活性 外切酶活性， ②无3’→5’外切酶活性， → 外切酶活性 35轮0.25%错配，与原始模板有差别； 错配， 轮 错配 与原始模板有差别； 温度72℃ 选择72℃ 最适聚合酶 温度 ℃，选择 ℃延伸 半衰期： 半衰期：92.5℃ 130min ℃ 95℃ 40min ℃ 97.5℃ 5—6min ℃ 变性温度： 变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性 ℃
（4）Primer 5’未端可修饰、突变: 修饰
如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果
突变： 突变：
AGCTCCATGACCCAG 5'CGCTCCATGACCCAG 3'
注意：绝不可以在 端进行上述改造 注意：绝不可以在3'端进行上述改造 ∵DNA聚Βιβλιοθήκη Baidu酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸
理论值： 理论值：一轮一倍
10轮 103=1000倍 轮 倍 20轮 106 轮 30 轮 109
模板扩增30轮 理论 模板扩增 轮 1ng-----------1g 模板扩增30轮 实际 模板扩增 轮 1ng-----------10µg µ
（二）基本要素
1 Taq DNA聚合酶： 聚合酶
外界影响：
EDTA鳌合Mg2+ ∴选较低浓度TE(10mM Tris,1mMEDTA)； DNA模板、引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+ 结合， 降低Mg2+ 有效浓度。 ∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的 如果扩增产物或效率不理想，
Mg2+浓度
6.温度和时间：
（1）变性温度：94-95℃ Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑ （2）退火：温度越高，扩增特异性越好 取决于Tm值：Tm↑退火T↑； Tm↓退火T↓ 若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度 （3）延伸： ≤500nt---1min >500nt－－3min 一般：40－60sec
（5）primer
5’端增加碱基 5 端增加碱基
①内切酶识别点： 内切酶识别点：
（G）GAATTC GCTCCATGACCCAG ↑保护bp 对PCR产物cloning有很大好处 便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同 EcoRI 1 BglII 2-3 XbaI 2-3 HindⅢ >3 BamHI 2-3 PstI >4 XhoI >4 NotI >10 如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆 ∵未切开，连接不上
操作流程
（1）探针的设计、合成与芯片的制作（商品化产品）； （2）靶基因样品的制备；
靶基因的制备：RT-PCR （设实验组和对照组） 标记方法：分别进行荧光素标记如：Cy3和Cy5
（3）生化杂交反应；与常规的分子杂交过程基本相似
封闭 预杂交 杂交 洗脱
（4）杂交信号的检测与结果的分析
激光共聚焦荧光检测系统收集荧光信号，计算机分析
②ATG起始密码 ③TAA、TAG、TGA终止密码 如： 可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外 区。
3.模板： 3.模板
可选：DNA 可选 mRNA→逆转录→cDNA DNA包括： 质粒 较小 变性较易 模板用量 Plasmid:lng Chromosome:300-500ng 注意： 防止交叉污染 噬菌体 较大 变性较难 染色体DNA ①目的gene是单拷贝 ②非常大，变性难
影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：
1 2 3 4 5
DNA分子的大小 构象 凝胶浓度 电压 缓冲液
琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中 DNA Ladder的形成
PCR产物的琼脂 糖电泳
聚丙烯凝胶电泳的银染结果分析
特殊的凝胶电泳
倒转电场凝胶电泳（FIGE）：用于分 离分子量10～2000kb的DNA分子； 钳位均匀电场电泳（CHEF电泳）：可 分离大于107bp的DNA分子
¤
（2）Primer 本身不要出现内部互补序列 形成loop环，内部二级结构 如： GGGTCGATTCCTACCCATGC （3）注意减少Primer间互补序列 导致2个Primer形成dimer 一般不要超过3个互补bp 如：CCCATGC : : : : GGGTCTA ATGGAGTC : : : : TCAGTAAGC
核酸和蛋白质分析技术
第一节
核酸分析技术
讲述内容： 1、核酸电泳 2、杂交技术 3、PCR技术 4、基因芯片
一、核 酸 电 泳
（一）DNA的凝胶电泳
凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开， 能容纳相对大量的DNA
用于核苷酸多态性的分析
琼脂糖凝胶电泳的基本过程
材料：电泳缓冲液（常用TAE或TBE）、电泳级琼脂糖、溴化乙锭溶
液（核酸显示剂）、加样缓冲液（保证核酸不在加样孔中扩散和用于电泳 时间的指示系统）、水平凝胶电泳装置及制胶系统、直流电源系统。
基本过程：制胶 放入电泳槽中并加入电泳缓冲液 取出梳子 将适量的核酸样品和上样缓冲液混合并 上样于加样孔中 一定电压条件下电泳 合适的时 间后停止电泳 取出凝胶进行溴化乙锭染色 凝胶 成像系统紫外灯下观察并照相保存结果
二 核酸杂交技术
（一）Southern Blot 原理： 原理：
将待检测的DNA分子用 不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖 分子用/不用限制性内切酶消化后 将待检测的 分子用 不用限制性内切酶消化后， 凝胶电泳进行分离， 凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移 到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上， 到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记 物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针 探针进行反应。 物标记的 或 探针进行反应 互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合， 互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针 洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测， 洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检 的片段及其相对大小。 的片段及其相对大小。 用途：检测样品中的 及其含量， 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态 如是否有 及其含量 了解基因的状态, 点突变、扩增重排等。 点突变、扩增重排等。
用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（ 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA） ） 及其含量。 及其含量。
操作过程
mRNA提取
甲醛变性电泳 洗膜
印迹转移
预杂交
杂交（变性探针）
放射自显影或化学发光
（三）探针标记技术
1 标记物：放射性和非放射性两种 放射性： 32P、35S和3H 、 和
4.dNTP： 4.dNTP：
四种脱氧核苷酸， 四种脱氧核苷酸，基本原料 终浓度：50µ 终浓度：50µM 注意：不稳定，保存时间长会失效 注意：不稳定，
5.Mg2+
TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+ 不同的酶需不同Mg2+ Taq：较少，Mg2+ 对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度 pfu：Mg2+ 2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍
（三）PCR技术的应用
1. 2. 3. 4. 基因检测： 基因克隆化 DNA突变 DNA序列分析
四、基因芯片
利用核酸杂交的原理，应用于DNA、RNA的研究 背景资料
基因芯片（Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐ）就是利用点样机等机械装置，在玻璃 等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”，每个“点”含有 可与一种基因杂交的一条ＤＮＡ探针。由于芯片上有序地排列着ＤＮＡ探 针，因此也被称为微阵列（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）。在芯片上滴加样品 后，在合适的条件下，样品中含有的各种核酸片段（ｃＤＮＡ或ｃＲＮＡ） 就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素，激发后产生的荧 光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比，也就代表该基因的 表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后，所获得的信息经专用软件分 析处理，即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点，基因芯 片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。
基因芯片的应用
用于基因转录水平的检测、基因组分析 和后基因组研究
Southern Blot 操作步骤： 操作步骤：
DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 洗膜 预杂交
杂交（变性探针） 杂交（变性探针）
放射自显影或显色
（二）Northern Blot
原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼 原理 在变性条件下将待检的 样品进行琼
脂糖凝胶电泳，继而按照同 脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同 相同 的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
pfu DNA 聚合酶
耐热
5’→3’DNA聚合酶活性 → 聚合酶活性
3’→5’外切酶活性 精确度：pfu >Taq 但pfu扩增效率通常比Taq酶略差 文献报道： 文献报道：Taq+pfu 会起到较好效果
2 .引物
人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃， Tm值要相近，每条10-50pmol /100µl ◆设计原则： （1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同 3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同 正链5'————— 3' ——上游Primer ——下游Primer 负链 3'————— 5' 例如： IL-3正链 5'GCTCCATGACCCAG----------- GCGATCTTTTGAGTCCAA 3' 负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT 5' 上游~： 与其相同 下游~： 先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3' 所以负链Primer：5'-TTg gAC TCA AAA gAT CgC -3'
（一）原理： 原理：
双链DNA通过高温变性解离成互补单链 通过高温变性解离成互补单链DNA －－－变性 －－－变性 双链 通过高温变性解离成互补单链 ↓ 与一对寡核苷酸引物（ ， ） 与一对寡核苷酸引物（5’， 3’）降低温度退火 DNA加热变性 引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火 加热变性+引物慢慢冷却使其结合 形象地称为退火 加热变性 引物慢慢冷却使其结合， ↓ 适温延伸5’/3’引物形成新链变成 条链 引物形成新链变成4条链 －－延伸 适温延伸 引物形成新链变成 条链DNA －－延伸 ↓ 第二轮：变性 退火 退火—延伸 第二轮：变性—退火 延伸
注意：溴化乙锭具有致癌性，操作时要带手套 注意：溴化乙锭具有致癌性，
不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围
（％，W/ V ) 琼脂糖浓度（％， DNA分子的有效分离范围（kb) 分子的有效分离范围（ 分子的有效分离范围
0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2
非放射性：生物素 生物素、地高辛素、荧光素 生物素
2、 2、标记方法
（1）切口平移法 （2）随机引物法 （3）末端标记法 （4）单链DNA探针标记 （5）寡核苷酸探针标记法
三 PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作 为引物，通过加温变性－退火－DNA合成这一周期的 多次循环，使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增 产物是以指数形式积累的，经25－30个循环后，扩增 倍数可达106。 Dr. Karry Mullis 1985年发明，获1993年度诺贝尔化学 奖； 目的: 目的 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。
（二）RNA 电 泳
基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是， 因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此 必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所 有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严 RNA 格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外， 因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳 结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常 用的变性剂为甲醛和戊二醛。
水生栖热菌(thermus aquaticus,Taq)的DNA聚合酶 水生栖热菌 的 聚合酶 聚合酶活性； ①5’→3’DNA聚合酶活性； → 聚合酶活性 外切酶活性， ②无3’→5’外切酶活性， → 外切酶活性 35轮0.25%错配，与原始模板有差别； 错配， 轮 错配 与原始模板有差别； 温度72℃ 选择72℃ 最适聚合酶 温度 ℃，选择 ℃延伸 半衰期： 半衰期：92.5℃ 130min ℃ 95℃ 40min ℃ 97.5℃ 5—6min ℃ 变性温度： 变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性 ℃
（4）Primer 5’未端可修饰、突变: 修饰
如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果
突变： 突变：
AGCTCCATGACCCAG 5'CGCTCCATGACCCAG 3'
注意：绝不可以在 端进行上述改造 注意：绝不可以在3'端进行上述改造 ∵DNA聚Βιβλιοθήκη Baidu酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸