酶与细胞的固定化 (2)优秀课件
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酶与细胞的固定化 (2)优秀课件
第一节：酶的固定化
一．固定化酶的定义及其特点
酶的固定化:利用一定措施将酶束缚或限 制于一定区域内，仍能进行其特有的催 化反应，并可回收及重复使用的一类技 术。
固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在 的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以 回收使用.(不一定是固体)
固定化酶的应用
1.在工业生产中的应用： 1）氨基酰化酶：1969年，最早工业化应用的固定化酶。
DL－乙酰氨基酸 L－氨基酸 2）葡萄糖异构化酶： 3）天冬氨酸酶：1973日本，延胡索酸－－－－天冬氨酸 4）青霉素酰化酶 5）延胡索酸酶：生产苹果酸 6）B－半乳糖苷酶 2.在酶传感器方面的应用： 1）酶电极：葡萄糖电极；氰霉素电极；
酶失活，酶活回收率低，甚至底物的专一性 等也会发生变化。
1．共价结合法：
结合方法主要有二种： ① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发
生偶联反应； ② 在载体上接上一个双功能基团，然后将酶偶
联上去。
载体
E
直接结合法
双功能 基团
E
通过双功能基团结合 法
1．共价结合法：
所用载体包括： 天然有机载体（如多糖，蛋白质，细胞）、 无机物（玻璃，陶瓷等）和合成聚合物（聚 酯，聚胺，尼龙）
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
固定化酶的缺点：
① 固定化时，酶的活力有损失；
② 只能用于可溶性底物，而且较适用于 小分子底物，对大分子底物不适宜；
合适的载体应具有良好的亲水性和一定的机 械强度.天然高分子亲水性较好,但机械强度 较差,玻璃和尼龙等强度好但亲水性较差.
共价结合的方式
• 有多种方式进行反应,取决于载体上的功能 基团和酶分子上的非必需侧链基团.
结合基团
• 载体上常用的功能基团包括: 芳香氨基,羟基,羧甲基,氨基等
可以与载体结合的酶的功能基团包括： 氨基,羧基,巯基,羟基,咪唑基,酚基等
重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸 处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下与酶 蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。
可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物， 在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N—端氨基或Lys的ε氨基 形成双偶氮化合物。常用载体及其反应如下：
参与共价结合的氨基酸不应是酶的必 需基团
• 常见的结合方法有10种
结合方法：
最常见的方法: 重氮偶联法;溴化氰法
活化基团
重点掌握溴化氰法
结合方法：
一.重氮反应(diazatitation):
适合水不溶性的带芳香氨基的载体.
载体在稀盐酸或亚硝酸钠中进行反 应,成为重氮盐衍生物,然后再在温和 的条件下和酶蛋白分子上相应的基团 如酚羟基,咪唑基或氨基进行共价结合, 得到固定化酶
2. ຫໍສະໝຸດ Baidu散法：
提高水不溶溶剂中酶反应速率的途径：
• 正确的体系和贮存状态使酶粉充分分散 （加入有利于分散的化合物,如PEG）；
• 通过与亲脂化合物的共价连接能增加酶在 有机相中的溶解度，包埋在膜体系中或通 过多相反应来实现酶的固定化；
• 将酶吸附到多孔载体中；
3. 物理吸附法：
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 法。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 变化少，因而酶活力损失很少。
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等。
4. 离子结合法：
酶通过离子键结合于具有离子交换基的水 不溶性载体的固定化方法。（DEAE-纤维素， DEAE-葡萄糖凝胶,CM-纤维素等）
• 优点：操作简单，条件温和，酶活性中心和 高级结构不易受到破坏，酶活回收率比较高。
固定化酶的形状:
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产， 薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大， 主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
三：酶的固定化方法
• 酶的固定化方法很多，但没有 普遍适应的方法，必须根据不 同酶及其不同的用途通过反复 试验选择。
常用的固定化方法有：
(按化学反应的类型分)
分类 固定化方法
固定化方法 分类
非共价结合法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法
化学结合法 包埋法
交联法， 共价结合法
微囊法， 网格法
固定化酶的模式图
（一）非共价结合法
包括：结晶法；分散法；物理吸附法；离子结合法
1. 结晶法：
就是使酶结晶从而实现固定化的方法,它提 供了非常高的酶浓度,从而提高了效率.刚性 强,结构稳定 • 其局限性是:在不断的重复循环中,酶会有所 损耗.
2. 分散法：
就是通过酶分散于水不溶相中 从而实现固定化的方法。关键 是解决酶在水不溶相中的分布 以及酶在有机溶剂中的稳定性.
3. 所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应； 4. 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
问题
• 固定化技术,固定化酶 • 为什么要进行酶的固定化? • 固定化酶有何优劣性? • 固定化酶技术的基本原则有哪些? • 固定化酶就是使酶从游离状态变成固体? • 固定化酶的活力比游离酶高? • 固定化酶更有利于多酶反应? • 固定化酶可以节省成本?
③ 增加了生产的成本，工厂初始投资大；
④ 与完整菌体相比不适宜于多酶反应， 特别是需要辅助因子的反应；
⑤ 胞内酶必须经过酶的分离手续
二：固定化酶的制备原则：
1. 必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶活性中 心不能受到破坏或与载体结合，尽量避免破坏酶 高级结构的条件，固定化的条件要温和。
2. 固定化酶必须结合牢固，从而使固定化酶能回收 贮藏，利于反复使用；
• 缺点：结合力弱，容易脱落，受溶液离子强 度和pH影响较大
（二）化学结合法
包括：共价结合法；交联法
1．共价结合法：
酶与载体以共价健结合的固定化方法，是载 体结合法中最常用的方法。
1．共价结合法：
结合方法优缺点： • 优点：与酶结合牢固，不容易脱落； • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，容易引起
第一节：酶的固定化
一．固定化酶的定义及其特点
酶的固定化:利用一定措施将酶束缚或限 制于一定区域内，仍能进行其特有的催 化反应，并可回收及重复使用的一类技 术。
固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在 的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以 回收使用.(不一定是固体)
固定化酶的应用
1.在工业生产中的应用： 1）氨基酰化酶：1969年，最早工业化应用的固定化酶。
DL－乙酰氨基酸 L－氨基酸 2）葡萄糖异构化酶： 3）天冬氨酸酶：1973日本，延胡索酸－－－－天冬氨酸 4）青霉素酰化酶 5）延胡索酸酶：生产苹果酸 6）B－半乳糖苷酶 2.在酶传感器方面的应用： 1）酶电极：葡萄糖电极；氰霉素电极；
酶失活，酶活回收率低，甚至底物的专一性 等也会发生变化。
1．共价结合法：
结合方法主要有二种： ① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发
生偶联反应； ② 在载体上接上一个双功能基团，然后将酶偶
联上去。
载体
E
直接结合法
双功能 基团
E
通过双功能基团结合 法
1．共价结合法：
所用载体包括： 天然有机载体（如多糖，蛋白质，细胞）、 无机物（玻璃，陶瓷等）和合成聚合物（聚 酯，聚胺，尼龙）
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
固定化酶的缺点：
① 固定化时，酶的活力有损失；
② 只能用于可溶性底物，而且较适用于 小分子底物，对大分子底物不适宜；
合适的载体应具有良好的亲水性和一定的机 械强度.天然高分子亲水性较好,但机械强度 较差,玻璃和尼龙等强度好但亲水性较差.
共价结合的方式
• 有多种方式进行反应,取决于载体上的功能 基团和酶分子上的非必需侧链基团.
结合基团
• 载体上常用的功能基团包括: 芳香氨基,羟基,羧甲基,氨基等
可以与载体结合的酶的功能基团包括： 氨基,羧基,巯基,羟基,咪唑基,酚基等
重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸 处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下与酶 蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。
可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物， 在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N—端氨基或Lys的ε氨基 形成双偶氮化合物。常用载体及其反应如下：
参与共价结合的氨基酸不应是酶的必 需基团
• 常见的结合方法有10种
结合方法：
最常见的方法: 重氮偶联法;溴化氰法
活化基团
重点掌握溴化氰法
结合方法：
一.重氮反应(diazatitation):
适合水不溶性的带芳香氨基的载体.
载体在稀盐酸或亚硝酸钠中进行反 应,成为重氮盐衍生物,然后再在温和 的条件下和酶蛋白分子上相应的基团 如酚羟基,咪唑基或氨基进行共价结合, 得到固定化酶
2. ຫໍສະໝຸດ Baidu散法：
提高水不溶溶剂中酶反应速率的途径：
• 正确的体系和贮存状态使酶粉充分分散 （加入有利于分散的化合物,如PEG）；
• 通过与亲脂化合物的共价连接能增加酶在 有机相中的溶解度，包埋在膜体系中或通 过多相反应来实现酶的固定化；
• 将酶吸附到多孔载体中；
3. 物理吸附法：
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 法。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 变化少，因而酶活力损失很少。
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等。
4. 离子结合法：
酶通过离子键结合于具有离子交换基的水 不溶性载体的固定化方法。（DEAE-纤维素， DEAE-葡萄糖凝胶,CM-纤维素等）
• 优点：操作简单，条件温和，酶活性中心和 高级结构不易受到破坏，酶活回收率比较高。
固定化酶的形状:
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产， 薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大， 主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
三：酶的固定化方法
• 酶的固定化方法很多，但没有 普遍适应的方法，必须根据不 同酶及其不同的用途通过反复 试验选择。
常用的固定化方法有：
(按化学反应的类型分)
分类 固定化方法
固定化方法 分类
非共价结合法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子结合法
化学结合法 包埋法
交联法， 共价结合法
微囊法， 网格法
固定化酶的模式图
（一）非共价结合法
包括：结晶法；分散法；物理吸附法；离子结合法
1. 结晶法：
就是使酶结晶从而实现固定化的方法,它提 供了非常高的酶浓度,从而提高了效率.刚性 强,结构稳定 • 其局限性是:在不断的重复循环中,酶会有所 损耗.
2. 分散法：
就是通过酶分散于水不溶相中 从而实现固定化的方法。关键 是解决酶在水不溶相中的分布 以及酶在有机溶剂中的稳定性.
3. 所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应； 4. 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
问题
• 固定化技术,固定化酶 • 为什么要进行酶的固定化? • 固定化酶有何优劣性? • 固定化酶技术的基本原则有哪些? • 固定化酶就是使酶从游离状态变成固体? • 固定化酶的活力比游离酶高? • 固定化酶更有利于多酶反应? • 固定化酶可以节省成本?
③ 增加了生产的成本，工厂初始投资大；
④ 与完整菌体相比不适宜于多酶反应， 特别是需要辅助因子的反应；
⑤ 胞内酶必须经过酶的分离手续
二：固定化酶的制备原则：
1. 必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶活性中 心不能受到破坏或与载体结合，尽量避免破坏酶 高级结构的条件，固定化的条件要温和。
2. 固定化酶必须结合牢固，从而使固定化酶能回收 贮藏，利于反复使用；
• 缺点：结合力弱，容易脱落，受溶液离子强 度和pH影响较大
（二）化学结合法
包括：共价结合法；交联法
1．共价结合法：
酶与载体以共价健结合的固定化方法，是载 体结合法中最常用的方法。
1．共价结合法：
结合方法优缺点： • 优点：与酶结合牢固，不容易脱落； • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，容易引起