酶与细胞的固定化 (2)优秀课件
合集下载
酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
《酶的固定化》PPT课件
第一节 酶固定化
定义 酶的固定化:将酶和菌体与不溶性载体结合的过程; 固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续 进行反应，反应后的酶可回收重复使用; 概念发展
“水不溶酶”（water insoluble enzyme) “固相酶”（solid phase enzyme)
1971年第一届国际酶工程会议正式采用“固定化酶（immobi lized enzyme)”
• 1、吸附法(link) • 2、包埋法(link) • 3、结合法(link) • 4、交联法(link) • 5、热处理法(link)
酶固定化方法示意图
吸附法 用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使其固定的方法; 固体吸附剂:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等; (1)操作简单，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用; (2)物理吸附结合能力弱，酶与载体结合不牢固易脱落.
(2)产物酸碱性对最适pH值的影响
酸性:固定化酶的最适pH值比游离酶的高 碱性:固定化酶的最适pH值比游离酶的低 中性:固定化酶的最适pH值一般不变 原因:载体障碍产物的扩散
(back)
底物的特异性
与底物分子量的大小有关; 作用于低分子量底物的酶，没有明显变化，如氨基 酰化酶、葡聚糖氧化酶等; 既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的 酶，往往会发生变化。如，固定在羧甲基纤维素上 的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对 酶蛋白的作用仅为游离酶的3%左右 原因:载体的空间位阻作用
Relative activity (%)
100
80
60
A
B 40
20
0 30 40 50 60 70 80 90 Temperature ( 篊 )
第五章酶的固定化ppt课件
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定的 空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既 保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不 足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使 用以及易于和反应产物分开等显著特点。直 接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体 或固定化死细胞。
（2）半透膜包埋法 将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小
球内，制成固定化酶. 制备方法： 酶， 水， 乙二胺
癸二酰氯+氯仿
包埋法 优点：结合力牢、活力回收高、底物专一性不变。
缺点：制备较难，载体无法回收、扩散限制。
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
三 固定化酶的性质
“雪亮工程"是以区（县）、乡（镇） 、村（ 社区） 三级综 治中心 为指挥 平台、 以综治 信息化 为支撑 、以网 格化管 理为基 础、以 公共安 全视频 监控联 网应用 为重点 的“群 众性治 安防控 工程” 。
酶与细胞的固定化
12
（二）包埋法
原理
– 将酶包埋于格子(Lattice)内，格子的结构可以防止蛋白质 渗出于周围基质中，但是底物仍能渗入格子内与酶相接 触
优缺点
– 优点：酶分子本身不参加水不溶性格子的形成、方法较 为简便、酶分子未受到化学作用、活力较高
– 缺点：不适用于大分子底物
根据使用包埋剂分类
– 聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法、 大豆蛋白质包埋法、微囊法等
– 利用聚丙烯酰胺凝胶或胶原膜包埋谷氨酸棒杆菌，用分批法或装柱 法连续由葡萄糖合成
L-苹果酸
– 利用聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌
35
（五）生产 a-淀粉酶
方法
– 利用聚丙烯酰胺凝胶包埋枯草杆菌
特点
– 凝胶中的细菌在保温过程中仍在生长
36
二、固定化技术需要考虑的重要因素
本征速率和动力学参数
– 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂凝胶、骨胶原、海藻酸钙 凝胶，K-角叉菜聚糖等
26
常用包埋剂的优缺点
K-角叉菜聚糖
– 制法简单，机械强度好，稳定性高，不影响细胞的代谢 活力
– 国内来源困难
海藻酸钙
– 钙离子容易被培养基中的磷酸根离子夺走而使凝胶解体
聚丙烯酰胺凝胶
– 孔径控制容易，机械强度好，富有弹性，细胞的活性高
抗生素
– 利用固定化细胞可以由单一营养物生成杆菌肽， 比传统发酵法（用淀粉-肉汤培养基）优越
33
（三）生产酒精和啤酒
酒精
– 传统酒精发酵需要大型发酵罐，不但设备繁杂， 操作困难，而且耗费一部分糖以供酵母生长之用 – 应用固定化细胞进行连续发酵后，酒精发酵时间 由传统方法的36h缩短至3h以下，乙醇生产能力 每小时为20～50g/L，而传统方法仅为2g/L – 细菌固定化的研究也颇为活跃
（二）包埋法
原理
– 将酶包埋于格子(Lattice)内，格子的结构可以防止蛋白质 渗出于周围基质中，但是底物仍能渗入格子内与酶相接 触
优缺点
– 优点：酶分子本身不参加水不溶性格子的形成、方法较 为简便、酶分子未受到化学作用、活力较高
– 缺点：不适用于大分子底物
根据使用包埋剂分类
– 聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法、 大豆蛋白质包埋法、微囊法等
– 利用聚丙烯酰胺凝胶或胶原膜包埋谷氨酸棒杆菌，用分批法或装柱 法连续由葡萄糖合成
L-苹果酸
– 利用聚丙烯酰胺凝胶包埋含有延胡索酸酶的产氨短杆菌
35
（五）生产 a-淀粉酶
方法
– 利用聚丙烯酰胺凝胶包埋枯草杆菌
特点
– 凝胶中的细菌在保温过程中仍在生长
36
二、固定化技术需要考虑的重要因素
本征速率和动力学参数
– 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂凝胶、骨胶原、海藻酸钙 凝胶，K-角叉菜聚糖等
26
常用包埋剂的优缺点
K-角叉菜聚糖
– 制法简单，机械强度好，稳定性高，不影响细胞的代谢 活力
– 国内来源困难
海藻酸钙
– 钙离子容易被培养基中的磷酸根离子夺走而使凝胶解体
聚丙烯酰胺凝胶
– 孔径控制容易，机械强度好，富有弹性，细胞的活性高
抗生素
– 利用固定化细胞可以由单一营养物生成杆菌肽， 比传统发酵法（用淀粉-肉汤培养基）优越
33
（三）生产酒精和啤酒
酒精
– 传统酒精发酵需要大型发酵罐，不但设备繁杂， 操作困难，而且耗费一部分糖以供酵母生长之用 – 应用固定化细胞进行连续发酵后，酒精发酵时间 由传统方法的36h缩短至3h以下，乙醇生产能力 每小时为20～50g/L，而传统方法仅为2g/L – 细菌固定化的研究也颇为活跃
第五章酶的固定化
纯化倍数 Purification
收率 Yield (%)
(fold)
2736.9
13080.2 23314.100
30 10 9
Sepharos
e柱层析 HiTrap19 42218 0.3
Q柱层析
实验 木瓜蛋白酶的固定化
实验原理：
载体：尼龙
固定化方法：共价结合法
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺
引发剂－－inactiation
2）半透膜包埋法（微囊型）
将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方
法。
界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和
疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体
而将酶包裹起来。
（3）结合法
1）共价结合法 ☆ 通过共价键将酶与载体结合的方法。 ① 结合方法
化的方法称为包埋法。
凝胶包埋法（网格型） 包埋法 半透膜包埋法（微囊型）
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
1）凝胶包埋法（网格型）
将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制
成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称
为凝胶包埋法。
首先被采用的网格包埋法是：
固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 －淀粉酶
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为 1个酶单位(U)(以下同)。
实验 木瓜蛋白酶的固定化
酶活力测定：
（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶， 加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。
收率 Yield (%)
(fold)
2736.9
13080.2 23314.100
30 10 9
Sepharos
e柱层析 HiTrap19 42218 0.3
Q柱层析
实验 木瓜蛋白酶的固定化
实验原理：
载体：尼龙
固定化方法：共价结合法
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺
引发剂－－inactiation
2）半透膜包埋法（微囊型）
将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方
法。
界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和
疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体
而将酶包裹起来。
（3）结合法
1）共价结合法 ☆ 通过共价键将酶与载体结合的方法。 ① 结合方法
化的方法称为包埋法。
凝胶包埋法（网格型） 包埋法 半透膜包埋法（微囊型）
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
1）凝胶包埋法（网格型）
将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制
成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称
为凝胶包埋法。
首先被采用的网格包埋法是：
固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 －淀粉酶
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为 1个酶单位(U)(以下同)。
实验 木瓜蛋白酶的固定化
酶活力测定：
（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶， 加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。
第五章固定化酶及固定化技术 ppt课件
能对底物产生立体影响的 扩散层以及静电的相互作用等引起的变化。
载体与酶的相互作用：
载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结 构、封闭酶活性部位等。
改变之一：构象改变、立体屏蔽
构象改变： 酶分子构象发生某种扭曲，导致
酶与底物结合能力或催化能力下降
4.包埋法
是指将酶或含酶微生物包裹在多孔的载体中。 网格型； 微囊型。
网格法
——将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。 天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等 合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。
网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。
微囊型
半透膜包埋法（微囊化法）： 将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，
固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题 ：
酶的活性中心发生物理化学变化导致酶活力降低 酶固定化后多了空间屏障,增加了传质阻力 酶和载体结合不牢固,容易脱落,酶活力损失大 固定化颗粒成型困难
固定化技术的改进
定点固定化技术 抗体偶联、生物素－亲和素亲和、氨基酸置换（Cys）
质量转移效应:
分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给 出了游离酶在合适反应条件下的效率。
稳定性:
操作稳定性(表示为工作条件下的活性降低)，贮藏稳定性
效能:
生产力（产品量/单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/公斤产品）
包括：
酶本身的变化:
主要由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生变化;
但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种 类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应 时，酶往往会从载体上脱落。
共价结合法
载体与酶的相互作用：
载体与酶的直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结 构、封闭酶活性部位等。
改变之一：构象改变、立体屏蔽
构象改变： 酶分子构象发生某种扭曲，导致
酶与底物结合能力或催化能力下降
4.包埋法
是指将酶或含酶微生物包裹在多孔的载体中。 网格型； 微囊型。
网格法
——将酶分子或微生物包埋在凝胶格子里。 天然凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等 合成材料：聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等。
网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。
微囊型
半透膜包埋法（微囊化法）： 将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，
固定化酶的过程中还存在几个亟待解决解决的难题 ：
酶的活性中心发生物理化学变化导致酶活力降低 酶固定化后多了空间屏障,增加了传质阻力 酶和载体结合不牢固,容易脱落,酶活力损失大 固定化颗粒成型困难
固定化技术的改进
定点固定化技术 抗体偶联、生物素－亲和素亲和、氨基酸置换（Cys）
质量转移效应:
分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给 出了游离酶在合适反应条件下的效率。
稳定性:
操作稳定性(表示为工作条件下的活性降低)，贮藏稳定性
效能:
生产力（产品量/单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/公斤产品）
包括：
酶本身的变化:
主要由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生变化;
但是载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种 类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应 时，酶往往会从载体上脱落。
共价结合法
酶与细胞的固定化PPT课件
第28页/共40页
• 1.琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法 • 用生理盐水配制3%～4%的琼脂，加热溶解灭菌后，至50℃左右，与等体
积的一定浓度的原生质体悬浮液混合将混合液用滴管滴到一定形状的多孔醋 酸纤维素上,置于冰箱或冰盒中冷却凝固，制成固定化原生质体。
第29第6页/共40页
1.吸附法
吸附法分为物理吸附法和离于交换吸附法 （1）物理吸附法 通过氢键、疏水作用和π电子
亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。 从而制成固定化酶。常用的载体有： （1）有机载体
纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等
（2）无机载体
氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。
体。
第27页/共40页
二、原生质体固定化
• 原生质体制备好后，把离心收集到的原 生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲 液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液。然 后采用包埋法制成固定化原生质体。
• 原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。 常用的凝胶有:琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角 叉菜胶和光交联树脂等。现举例说明如下:
第20页/共40页
• 2．包埋法 包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉莱胶等多孔凝胶中。 BredeliUS等(1979）首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞。毛地黄细胞、海巴朝细胞。
第21页/共40页
三、动物细胞固定化
• 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩，需要最温 和的固定化方法。因前，动物细胞固定的方法有吸 附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。
第16页/共40页
• 包埋法： • 1．聚丙烯酰胺凝胶包埋法 • 2．琼脂凝胶包埋法 • 3．海藻酸包埋 法 • 4．卡拉胶包埋法 • 5．明胶包埋法
• 1.琼脂-多孔醋酸纤维素固定化法 • 用生理盐水配制3%～4%的琼脂，加热溶解灭菌后，至50℃左右，与等体
积的一定浓度的原生质体悬浮液混合将混合液用滴管滴到一定形状的多孔醋 酸纤维素上,置于冰箱或冰盒中冷却凝固，制成固定化原生质体。
第29第6页/共40页
1.吸附法
吸附法分为物理吸附法和离于交换吸附法 （1）物理吸附法 通过氢键、疏水作用和π电子
亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上。 从而制成固定化酶。常用的载体有： （1）有机载体
纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等
（2）无机载体
氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。
体。
第27页/共40页
二、原生质体固定化
• 原生质体制备好后，把离心收集到的原 生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲 液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液。然 后采用包埋法制成固定化原生质体。
• 原生质体固定化一般采用凝胶包埋法。 常用的凝胶有:琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角 叉菜胶和光交联树脂等。现举例说明如下:
第20页/共40页
• 2．包埋法 包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉莱胶等多孔凝胶中。 BredeliUS等(1979）首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞。毛地黄细胞、海巴朝细胞。
第21页/共40页
三、动物细胞固定化
• 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩，需要最温 和的固定化方法。因前，动物细胞固定的方法有吸 附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。
第16页/共40页
• 包埋法： • 1．聚丙烯酰胺凝胶包埋法 • 2．琼脂凝胶包埋法 • 3．海藻酸包埋 法 • 4．卡拉胶包埋法 • 5．明胶包埋法
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
固定化酶的形状:
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产， 薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大， 主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
2. 分散法：
提高水不溶溶剂中酶反应速率的途径：
• 正确的体系和贮存状态使酶粉充分分散 （加入有利于分散的化合物,如PEG）；
• 通过与亲脂化合物的共价连接能增加酶在 有机相中的溶解度，包埋在膜体系中或通 过多相反应来实现酶的固定化；
• 将酶吸附到多孔载体中；
3. 物理吸附法：
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 法。
酶失活，酶活回收率低，甚至底物的专一性 等也会发生变化。
1．共价结合法：
结合方法主要有二种： ① 将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发
生偶联反应； ② 在载体上接上一个双功能基团，然后将酶偶
联上去。
载体
E
直接结合法
双功能 基团
E
通过双功能基团结合 法
1．共价结合法：
所用载体包括： 天然有机载体（如多糖，蛋白质，细胞）、 无机物（玻璃，陶瓷等）和合成聚合物（聚 酯，聚胺，尼龙）
③ 增加了生产的成本，工厂初始投资大；
④ 与完整菌体相比不适宜于多酶反应， 特别是需要辅助因子的反应；
⑤ 胞内酶必须经过酶的分离手续
二：固定化酶的制备原则：
1. 必须注意维持酶的催化活性及专一性。酶活性中 心不能受到破坏或与载体结合，尽量避免破坏酶 高级结构的条件，固定化的条件要温和。
2. 固定化酶必须结合牢固，从而使固定化酶能回收 贮藏，利于反复使用；
3. 所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应； 4. 固定化酶成本要低，以利于工业使用。
问题
• 固定化技术,固定化酶 • 为什么要进行酶的固定化? • 固定化酶有何优劣性? • 固定化酶技术的基本原则有哪些? • 固定化酶就是使酶从游离状态变成固体? • 固定化酶的活力比游离酶高? • 固定化酶更有利于多酶反应? • 固定化酶可以节省成本?
重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸 处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH8—9)条件下与酶 蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。
可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物， 在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N—端氨基或Lys的ε氨基 形成双偶氮化合物。常用载体及其反应如下：
参与共价结合的氨基酸不应是酶的必 需基团
• 常见的结合方法有10种
结合方法：
最常见的方法: 重氮偶联法;溴化氰法
活化基团
重点掌握溴化氰法
结合方法：
一.重氮反应(diazatitation):
适合水不溶性的带芳香氨基的载体.
载体在稀盐酸或亚硝酸钠中进行反 应,成为重氮盐衍生物,然后再在温和 的条件下和酶蛋白分子上相应的基团 如酚羟基,咪唑基或氨基进行共价结合, 得到固定化酶
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
固定化酶的缺点：
① 固定化时，酶的活力有损失；
② 只能用于可溶性底物，而且较适用于 小分子底物，对大分子底物不适宜；
（一）非共价结合法
包括：结晶法；分散法；物理吸附法；离子结合法
1. 结晶法：
就是使酶结晶从而实现固定化的方法,它提 供了非常高的酶浓度,从而提高了效率.刚性 强,结构稳定 • 其局限性是:在不断的重复循环中,酶会有所 损耗.
2. 分散法：
就是通过酶分散于水不溶相中 从而实现固定化的方法。关键 是解决酶在水不溶相中的分布 以及酶在有机溶剂中的稳定性.
酶与细胞的固定化 (2)优秀课件
第一节：酶的固定化
一．固定化酶的定义及其特点
酶的固定化:利用一定措施将酶束缚或限 制于一定区域内，仍能进行其特有的催 化反应，并可回收及重复使用的一类技 术。
固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在 的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以 回收使用.(不一定是固体)
合适的载体应具有良好的亲水性和一定的机 械强度.天然高分子亲水性较好,但机械强度 较差,玻璃和尼龙等强度好但亲水性较差.
共价结合的方式
• 有多种方式进行反应,取决于载体上的功能 基团和酶分子上的非必需侧链基团.
结合基团
• 载体上常用的功能基团包括: 芳香氨基,羟基,羧甲基,氨基等
可以与载体结合的酶的功能基团包括： 氨基,羧基,巯基,羟基,咪唑基,酚基等
固定化酶的应用
1.在工业生产中的应用： 1）氨基酰化酶：1969年，最早工业化应用的固定化酶。
DL－乙酰氨基酸 L－氨基酸 2）葡萄糖异构化酶： 3）天冬氨酸酶：1973日本，延胡索酸－－－－天冬氨酸 4）青霉素酰化酶 5）延胡索酸酶：生产苹果酸 6）B－半乳糖苷酶 2.在酶传感器方面的应用： 1）酶电极：葡萄糖电极；氰霉素电极；
• 缺点：结合力弱，容易脱落，受溶液离子强 度和pH影响较大
（二）化学结合法
包括：共价结合法；交联法
1．共价结合法：
酶与载体以共价健结合的固定化方法，是载 体结合法中最常用的方法。
1．共价结合法：
结合方法优缺点： • 优点：与酶结合牢固，不容易脱落； • 缺点：反应条件苛刻，操作复杂，容易引起
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 变化少，因而酶活力损失很少。
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等。
4. 离子结合法：
酶通过离子键结合于具有离子交换基的水 不溶性载体的固定化方法。（DEAE-纤维素， DEAE-葡萄糖凝胶,CM-纤维素等）
• 优点：操作简单，条件温和，酶活性中心和 高级结构不易受到破坏，酶活回收率比较高。
三：酶的固定化方法
• 酶的固定化方法很多，但没有 普遍适应的方法，必须根据不 同酶及其不同的用途通过反复 试验选择。
常用的固定化方法有：
(按化学反应的类型分)
分类 固定化方法
固定化方法 分类
非共价结合法
结晶法 分散法 物理吸附法 离子合法
化学结合法 包埋法
交联法， 共价结合法
微囊法， 网格法
固定化酶的模式图