手动质粒大提及原生质体提取
划重点：质粒提取不用愁
划重点：质粒提取不用愁分子克隆试验是生物学研究中基本实验。
质粒是做常用到的分子工具，可以通过构建基因敲减或者过表达质粒进而探究基因功能。
前面我们介绍过分子构建的方法，今天就为大家介绍一下如何获得高纯度的质粒-质粒提取方法与注意事项。
首先，质粒的提取可分为质粒小提、质粒中提、质粒大提。
目前大多数实验室都选用试剂盒进行提取，可以根据实验的不同需求，选择相应的试剂盒。
质粒小提主要用于用于大肠杆菌中质粒DNA的小量提取，获得的质粒可以用于常规的载体构建，一般适用于5ml以下菌液。
而质粒中提，在小提的基础上可以进一步去除菌液中的内毒素，获得的质粒可以用于细胞转染，常规需要菌液量为10-15ml。
质粒大提与中提方法相同，可一次抽提100ml-300ml菌液获得大量质粒。
质粒提取的原理：质粒抽提的步骤原理即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。
最常用的方法是碱裂解法,即在强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性。
在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。
优点为操作过程简单，快速，获得质粒浓度高，目前被广泛使用。
下面详细介绍下质粒提取操作的每一步原理以及注意事项。
1、实验前准备：获得目的质粒后，转化入大肠杆菌中，进而涂板。
挑取单克隆菌落进行小摇，进而中摇，一般可获得15ml菌液。
2、取15ml菌液，转速12,000×g，室温离心1min，得到菌液沉淀。
3、弃LB培养基，向沉淀中加500 μl预冷的溶液1（含 RNase A 混合液，一般放于四度冰箱），漩涡振荡，此步的目的主要是将菌体沉淀悬浮起来。
大提质粒步骤
大提质粒的方法（500ml的菌液）第一天：待提质粒的工程菌在LB固体培养基（含Amp100μg/ml的LB琼脂平板）上37℃培养过夜，180rpm；第二天：在培养基上取单个克隆，接种于5ｍｌ左右含有100μg/mlAmp的LB液体培养基中（在试管中），37度摇床过夜，180 rpm。
第三天：以下为粗DNA的提取过程细菌的培养:1取过夜的菌液5ml，加入灭菌并预热的500mlLB液体培养基（含有100μg/mlAmp，接菌前加入氨苄）中。
（1L的三角瓶2个）；2 37度摇床，180r/min，至OD600为0.8之间时终止培养；3 将菌液分别收集到2个50ml的离心管离心，6000rpm，5分钟，4℃。
弃上清，中；（菌体可溶于TE（pH8.0）中-20或-70℃保存）细胞的裂解：4 每个离心管加入预冷的10ml裂解液I重悬菌体，充分混匀（混悬液）；5 每个离心管加入新鲜配制的裂解液II 20ml，盖上离心管盖，轻轻颠倒数次至充分混匀(反应应少于5min,室温，并且溶液和离心管应立即盖盖子)；6 分别加入冰预冷的裂解液Ⅲ 10ml，盖上离心管盖，轻轻颠倒数次，以充分混匀，直至溶液澄清，沉淀最大；7 离心，12000rpm， 10分钟，4℃。
用纱布过滤，将上清转于新的离心管中。
质粒的回收：8 量取上清的体积，并加入0.6倍的异丙醇，混匀，冰浴20-30分钟；9 离心，12000rpm， 10min，室温（不用4度离心）；（用一个离心管，以至沉淀在一个离心管中）10 弃去上清，将离心管倒置于滤纸上；（粗DNA）以下为聚乙二醇沉淀法纯化质粒11 5mlTE溶解湿润的核酸沉淀（在新的离心管中），（注意：DNA是否完全溶解）并在冰浴中冷却10分钟；（可以保存4℃冰箱）；12 加入5ml冰预冷的5MLiCl，混匀，13000rpm， 10分钟，4℃。
（去掉大分子RNA和蛋白质）13 将上清转入另一新离心管中，加入10ml异丙醇，混匀，冰浴20-30分钟14 13000rpm， 10min，4℃。
大提质粒提取流程
大提质粒提取流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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质 粒 提 取 原理及步骤
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载质粒提取原理及步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容For personal use only in study and research; notfor commercial use质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. HYPERLINK "/zili.htm" \l "（一）细菌培养物的生长?" 细菌培养物的生长。
2. HYPERLINK "/zili.htm" \l "（二）细菌的收获和裂解?" 细菌的收获和裂解3. HYPERLINK "/zili.htm" \l "(三)质粒DNA的纯化?" 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
质粒抽提原理与详细操作步骤
质粒抽提原理与详细操作步骤质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA 分子。
质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。
当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。
当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。
要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。
碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。
溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。
溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾 60.0 mL，冰乙酸 11.5 mL，无菌水28.5 mL，4℃保存，使用时置于冰浴中。
下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。
质粒大抽步骤(强化版)(精)
取 100ml (根據培養菌體的濃度選擇合適的量,低拷貝推薦用 200ml 過夜培養的菌液加入離心管,室溫 8, 000rpm (~8.228*g離心 3min 收集細菌,儘量吸除上清。
注意:菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉澱收集到一個離心管中,菌液量以能夠充分裂解為佳,菌液過多會導致裂解不充分從而降低質粒的提取效率。
儘量吸除上清,為確保上清液全部吸取,請用乾淨的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。
打開水浴鍋,將溫度設置為 65℃,放入洗脫液TB 進行水浴加熱。
向留有菌體沉澱的離心管中加入 8ml 溶液 P1(請先檢查是否已加入 RNaseA ,加入 RNaseA 後的 P1溶液須放入 4℃冰箱保存 ,使用移液器或渦旋振盪器徹底懸浮細菌細胞沉澱。
和純度偏低。
對於低拷貝質粒,加大菌體用量的同時按比例增加 P1、 P2、 P4的用量。
觀察細菌是否徹底懸浮,可將離心管橫放,看是否有塊狀沉澱。
P1的成分:50mMol/L 葡萄糖 +25mMol/L Tris-Cl(PH8.0+ 10mMol/L EDTA(PH8.0(絡合劑。
如果菌泥是 -20℃冰凍保存的,此時混勻較困難,提前加 P1,放置 20min ,恢復至室溫,方便混勻。
或者用 1ml 移液槍槍頭從管壁上刮下來;或者 37℃水浴加熱。
混勻的時候,使收集管傾斜,內部的液體會上下滾動,加速混勻,且不容易起泡沫用大槍頭向離心管中加入 8ml 溶液 P2,立即溫和地上下翻轉 6-8次,室溫放置 5min 。
DNA 。
此時菌液應變得清亮粘稠,如果未變得清亮,可能由於菌體過多,裂解不徹底,應減少菌體量。
P2的成分:0.2N NaOH+1% (m/VSDS向吸附柱 CP6中 (吸附柱放入 50ml 收集管中加入 2.5ml 的平衡液 BL , 8, 000rpm 離心 2min ,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
(用平衡液處理過的柱子最好立即使用;實驗前使用平衡液 BL 處理吸附柱,可以最大限度啟動矽基質膜,提高效率。
TOP实验室秘籍：质粒扩增及提纯的步骤详解
TOP实验室秘籍：质粒扩增及提纯的步骤详解小灵子，我，即将毕业的医学研三狗，分享一下从师姐以及大神那里学来的提质粒方法，第一次做，算比较成功，虽然其中过程非常曲折。
中间问了身边好多同学，都不是很会，研一上课的时候学实验，老师也只是简单讲了一下提纯的步骤，所以我这个科研小白还是打算来和大家分享一下，希望对有需要的同学有所帮助，也希望大家能够多多交流，万一有大神指点呢！Day1第一天最重要的是什么！当然是准备工作！准备工作1. 配液体 LB（这个东西我们这么叫，但是同科室专门做菌的小姐姐管它叫脑心脊液，也是我比较困惑的一点）蛋白胨 10g，酵母 7.5g，NaCl15g，去离子水定容到1000ml ——actually，用不了那么多，两个样最多用300ml，剩下的近期没有其他人用，扔掉我们还很心痛，所以暂时还放在我们4℃ 冰箱里保存着呜呜呜——所以，如果没有那么多样品的话，建议可以按比例减掉的哟！2. 配 CaCl 2 ：4.44g CaCl 2 + 500ml 去离子水（当然一次就用一点点，也可以按比例递减的）不过没用完，没结晶的话以后也可以用。
3. 配固体培养基：蛋白胨 1g ，酵母 0.5g， NaCl 1g ，琼脂1g，去离子水定容到 100ml。
4. 玻璃珠（这个是涂我们的小菌菌用的，我觉得用接种环、干净的棉签、小木棍都可以，实验室有啥用啥，能省就省！）5. 一套枪头（作为科研狗就别问我一套枪头是什么意思了！）6. 玻璃培养皿 (讲道理，塑料的10cm皿也可以)。
7. 离心管（ 15ml 的多来点！）8. 一盒Ep管（ 1.5ml 的就够了）9. 配抗生素：Ampicillin ：工作液100μg/ml ,可以先配成100μg/μl ,用时1:1000Kanamycin ：工作液25μg/ml ,可以先配成25μg/μl ,用时1:1000（不一定每个质粒都一样哦，记得看它带来的说明书）PS：固体培养基先不要高压，凉了就凝了！其他的速度高压，烘干放在超净台里等待我们接下来的实验hiahia~步骤一：摇菌将大肠杆菌（一点就够~具体我反正是加了10μl ）3~4ml LB 培养基中，37℃ 过夜，剧烈摇晃~ 150-200r 就可以啦。
质粒提取方法及步骤（精）
质粒提取方法及步骤（精）质粒提取方法及步骤碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少追其原因，我想大概是因为分子克隆里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述这是导致我的学生误入歧途的主要原因后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多老师也是这个状态这就不得不让人感到悲哀了我想这恐怕和我们的文化有点关系中国人崇尚读书，学而优则仕的观念深入人心经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的八股学生命科学是实验科学，它讲究动手如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的艺术家每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I ，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II ，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III ，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸让我们先来看看溶液I 的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH ，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl 溶液，是再自然不过的了那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部因此，如果溶液I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响所以说溶液I 中葡萄糖是可缺的那么EDTA 呢？大家知道EDTA 是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase 的活性，和抑制微生物生长在溶液I 中加入高达 10 mM 的EDTA ，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉如果不加EDTA ，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA 会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE 缓冲液中有EDTA 如果哪天你手上正好缺了溶液I ，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB 培养基来悬浮菌体就可以了有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块轮到溶液II 了这是用新鲜的0.4 N的NaOH 和2％的SDS 等体积混合后使用的要新从浓NaOH 稀释制备0.4N 的NaOH ，无非是为了保证NaOH 没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS ，所以才叫碱法抽提事实上NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒如果只用SDS 当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已很多人对NaOH 的作用误以为是为了让基因组DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA 变性复性的描述所导致有人不禁要问，既然是NaOH 溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA 片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA 也会断裂基因组DNA 的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明每个人都知道，溶液III 加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质最容易产生的误解是，当SDS 碰到酸性后发生的沉淀如果你这样怀疑，往1%的SDS 溶液中加如2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了大量沉淀的出现，显然与SDS 的加入有关系如果在溶液II 中不加SDS 会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质既然SDS 不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS 溶液中慢慢加入5 N 的NaCl ，你会发现SDS 在高盐浓度下是会产生沉淀的因此高浓度的盐导致了SDS 的沉淀但如果你加入的不是NaCl 而是KCl ，你会发现沉淀的量要多的多这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀如此看来，溶液III 加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS 中的钠离子形成了不溶性的PDS ，而高浓度的盐，使得沉淀更完全大家知道SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA 也一起被共沉淀了这个过程不难想象，因为基因组DNA 太长了，长长的DNA 自然容易被PDS 给共沉淀了，尽管SDS 并不与DNA 分子结合那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH ，因为长时间的碱性条件会打断DNA ，所以要中和之基因组DNA 一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS 共沉淀了所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA 条带很多人误认为是溶液III 加入后基因组DNA 无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA 分子在中性溶液中都是溶解的NaOH 本来是为了溶解细胞而用的，DNA 分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系溶液III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS 沉淀更充分一点不要以为PDS 沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA ，不然时间一长就会因为混入的DNase 而发生降解这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍酚（Phenol ）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M 的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA 沉淀出来这时候如果放到－20，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA 酒精沉淀回收，所以不要过分小心了高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA 分子之间就容易形成氢键而发生沉淀如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip 将沉淀打碎，就能得到好的样品得到的质粒样品一般用含RNase （50 ug/ml）的TE 缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA 会干扰电泳结果的琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA 时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋线性和开环这三条带碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA ，不信的话你用EcoRI 来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA 的位置与这三条带的位置不一样其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）如果你不小心在溶液II 加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb 的大肠杆菌基因组DNA 的片断非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA 序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致这里暂不深究【如何去除 RNA 】去除RNA 相对比较简单，首先是使用RNase 消化(抽提中或者抽提后。
质粒提取介绍-中学
影响质粒提取的因素
质粒提取的得率和质量与很多因素有关： • 如宿主菌的种类和培养条件； • 细胞的裂解； • 质粒拷贝数； • 质粒稳定性； • 抗生素用量； • 吸附柱的吸附能力。
质粒提取原理
质粒提取原理
P1：重悬细菌 抑制核酸酶
P2：强碱破壁 蛋白和核酸变性
P3：中和复性 蛋白缠绕基因组DNA沉淀 质粒DNA仍处于溶解状态
质粒提取原理
进行高速离心5min即可
吸取上清液
通过吸附柱
用乙醇沉淀漂ຫໍສະໝຸດ 液漂洗离心沉淀洗脱得DNA
溶解得DNA
质粒小量提取步骤
应用
• 用于鉴定阳性克隆; • 用于进行PCR扩增、酶切、转化; • 用于转染细胞、原生质体.
质粒提取
李蕾
什么是质粒
质粒（Plasmid）是一种染色体外 的稳定遗传因子， 大小从1-200kb不 等，为双链、闭环的DNA分子，并以超 螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有 自主复制和转录能力，能在子代细胞 中保持恒定的拷贝数，并表达所携带 的遗传信息。
什么是质粒
质粒提取原理
常用的质粒DNA提取方法有三种： • 碱裂解法（﹤15kb） • 煮沸法（﹤15kb） • 去污剂（如Triton和SDS）裂解法 （﹥15kb）
质粒鉴定与评价
琼脂糖电泳检测
质粒提取理想状态是只出现超螺旋一 条带，但是在提取过程中，由于机械力、 酸碱度等原因，使质粒DNA形态发生变化， 可能经单酶切鉴定后为一条 现两条或者三 条带的情况。如果加入P2后过渡激烈震荡， 就会出现基因组DNA片段。有时甚至提出4 条以上的条带（非常少见），但只要质粒 单酶切后为单一条带，就证明没有基因组 污染。
质粒鉴定与评价
质粒提取方法及步骤
质粒提取方法及步骤碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少追其原因，我想大概是因为分子克隆里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述这是导致我的学生误入歧途的主要原因后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多老师也是这个状态这就不得不让人感到悲哀了我想这恐怕和我们的文化有点关系中国人崇尚读书，学而优则仕的观念深入人心经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的八股学生命科学是实验科学，它讲究动手如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的艺术家每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸让我们先来看看溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响所以说溶液I中葡萄糖是可缺的那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长在溶液I 中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB 培养基来悬浮菌体就可以了有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块轮到溶液II了这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之基因组DNA一旦发生断裂，只要是50－100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带很多人误认为是溶液III加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的DNase而发生降解这里用25/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍酚（Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M 的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来这时候如果放到－20，时间一长反而会导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要过分小心了高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用tip将沉淀打碎，就能得到好的样品得到的质粒样品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但千万不要认为你看到的是超螺旋线性和开环这三条带碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，不信的话你用EcoRI 来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致这里暂不深究【如何去除RNA】去除RNA 相对比较简单，首先是使用RNase 消化(抽提中或者抽提后)。
大提质粒
手工法大量提取质粒溶液的配制：①5mol/L Nacl（贮存液）：在800ml蒸馏水中溶解292.2g Nacl，加水定容至1L，分装后高压灭菌备用。
②1 mol/L Tris（PH8.0）（贮存液）：在800ml蒸馏水中溶解121.1g Tris碱，加入浓HCl 调PH值至8.0（约加入浓HCl 42ml，应在溶液冷却至室温后方可最后调定PH值，）加水定容至1L，分装后高压灭菌。
③500mmol/L EDTA（PH8.0）（贮存液）：在800ml蒸馏水中加入186.1g EDTA-Na2·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调PH值至8.0（约需20g NaOH颗粒）后定容至1L，分装后高压灭菌备用。
④2 mol/L NaOH：在80ml蒸馏水中溶解8g NaOH，定容至100ml。
⑤STE液：0.1mol/L NaCl、10mmol/L Tris(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)，以上述贮存液配制。
⑥碱裂解液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris(pH8.0)、10mmol/L EDTA(pH8.0)（高压蒸汽灭菌15min，贮存于4℃）⑦碱裂解液Ⅱ：现用现配，0.2mol/L NaOH(临用前用2mol/L贮存液现用现稀释）、1％SDS （10%SDS稀释10倍）⑧碱裂解液Ⅲ：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml、水28.5ml至总体积100ml。
⑨TE缓冲液(pH8.0)：含10mmol/L 的Tris.Cl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)○10溶菌酶溶液（10mg/ml）：0.01g溶菌酶溶于1ml 10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)中，分装成小份（50ul/份）并保存于-20℃。
每一小份一经使用后丢弃。
○115mol/L Licl：用90ml的水溶解21.2g Licl。
定容至100ml。
质粒的提取与转化
所用试剂的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ用 酚和氯仿
酚和氯仿都是表面变性剂，非极性分子，可以使蛋白质失去水合状态而变性。 10%间甲酚，降低酚溶点，增加对蛋白质变性。 氯仿与水不互溶,能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。 在抽提DNA过程中，由于酚与氯仿是互溶的，所以用酚氯仿混合液效果好。
酚的质量与保存
在提取DNA过程中，酚的质量很重要。酚容易被空气氧化变成粉 红色，这种酚易降解DNA，不能用。 酚应该重蒸馏，并及时加入pH8.0的Tris水溶液或TE缓冲液饱 和酚，酚经水饱和后在抽提DNA时，不会吸收DNA样品中水份，减少 DNA的损失。加入Tris水溶液或TE缓冲液也可以使酚隔绝空气。 另外也可加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至最终浓度为0.1%目的是 抗氧化和抑制RNase酶活性。经这样处理后，将酚分装在棕色瓶中， 盖紧后，-20℃保存。可使用数月。
感受态细胞的保存
新鲜感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜感受 态细胞0℃~ 4℃贮存不超过3天。长期保存，必须将细胞在70℃干冰或液氮气体部分速冻5分钟，再置于-80℃冰箱中 保存，一般可保存1年。
质粒的转化
感受态细胞新鲜配制的或从-80℃冻存取出后置于冰水中融化。 ① 感受态细胞新鲜配制的或从 ℃冻存取出后置于冰水中融化。 取出分装到Eppendorf管中，每管 管中， ② 取出分装到 管中 每管100~200uL。 。 加入需转化的DNA溶液 溶液2~5uL充分混匀 充分混匀(1~5ng/uL DNA)。 ③ 加入需转化的 溶液 充分混匀 。 冰水中放置30分钟 分钟。 ④ 冰水中放置 分钟。 热休克) ⑤ 42℃水浴 秒。(热休克 ℃水浴90秒 热休克 冰浴2min。 ⑥ 冰浴 。 每管再加入1mL LB培养基，37℃振荡培养 小时。 培养基， ℃振荡培养1小时 小时。 ⑦ 每管再加入 培养基
质粒大量提取及纯化
扬州大学本科生毕业论文论文题目：质粒大量提取及纯化学生姓名：张晨所在学院：动物科学学院专业班级：动科06 指导老师：宋成义教授完成日期：2010年6月质粒大量提取及纯化动物科学张晨指导老师宋成义摘要：为了探讨氯霉素对重组质粒DNA提取产量的影响，本试验在含重组质粒pT2/HB-CMV-EGFP的大肠杆菌DH5α培养到对数生长期时添加氯霉素继续培养12小时，收集细菌用碱裂解法粗提质粒DNA，并用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。
结果表明，氯霉素可有效的促进松弛型重组质粒DNA拷贝数的增加，从而达到提高质粒DNA产量的目的。
为了优化质粒DNA纯化过程中溶液A的用量，本试验将同一份粗提质粒DNA平分成三组，分别加入不同量的溶液A。
纯化后测定各组DNA浓度和纯度，结果表明，溶液A用量（ml）:质粒DNA量(mg)为1:2时，纯化效果最好。
关键词：质粒提取；氯霉素；纯化Extraction and purification of Large-scale plasmid DNAZHANG ChenAbstract:To study the effect of chloramphenicol on plasmid DNA preparation, in this experiment the chloramphenicol was added to the recombinant E. coli culture at the logarithmic growth phase，and then the plasmid DNA was extracted by using the traditional alkaline method. Concentration and purity of the plasmid DNA was detected and the results showed that chloramphenicol could effectively increase the copy number of relaxed plasmid and increase the output of the plasmid DNA. In order to optimize the amount of solution A which was used to purify plasmid DNA, different amount of solution A was added to the coarse extraction of plasmid. Then the concentration and purity of the puritied plasmid DNA was determined.The results showed that the purification effect was the best when the proportion of solution A(ml) andcoarse plasmid DNA(mg) was by 1-2.Key Words:extract of plasmid DNA;chloramphenicol;purification;质粒是存在于细菌染色体外的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小型环状双链DNA分子,其分子量一般在0.2～10kD范围内[1]。
质粒大提程序
质粒大提程序1) 200mL含有50mg/mL氨苄或30mg/mL卡纳的培养基中振摇过夜（12-14h）2) 50mL离心管，4℃，4000rpm,10min收集2份细胞3) 每管加5mLSTE悬浮细胞后，4℃，4000rpm,10min收集细胞，置-20℃贮存10min4) 室温解冻后，每管加4mL冰预冷的溶液Ⅰ，重悬细胞5) 室温下每管加8mL溶液Ⅱ后充分混匀，室温静置5-10min6) 每管加6mL冰预冷的溶液Ⅲ，充分混匀，冰浴静置10min7) 4℃，11000rpm,30min收集裂解上清液（用纱布过滤）8) 每管加0.6倍体积异丙醇，室温静置10min9) 4℃，8000rpm,15min收集核酸沉淀，每管加5mL70%乙醇清洗10) 4℃，8000rpm,5min收集沉淀，晾10-15min，直至管壁无液滴11) 每管加2mLTE溶解核酸，4℃或冰浴静置30min12) 每管加2mL7.5mol/L乙酸铵溶液，冰浴静置10min13) 4℃，10000rpm,10min收集上清，每管加4mL异丙醇，混匀14) 4℃，10000rpm,10min收集沉淀，4-5mL70%乙醇清洗沉淀15) 4℃，10000rpm,5min收集沉淀，晾10-15min，直至管壁无液滴16) 每管加1mLTE溶解核酸，4℃或冰浴静置30min17) 两份溶液和到一管，加8μL10mg/mLRNase A，混匀转入EP管（每管转入500μL），37℃水浴静置30-60min18) 每管加250μL酚，250μL仿醇（24:1）抽提，4℃，12000rpm,10min，收集上清水相（a μL）19) 每管加aμL仿醇（24:1）抽提，4℃，12000rpm,10min，收集上清水相（bμL）20) 每管加2bμL-20℃乙醇和0.1bμL乙酸钠溶液，-20℃静置过夜21) 4℃，12000rpm,10min收集沉淀，每管加200μL70%乙醇清洗22) 4℃，12000rpm,5min收集沉淀，晾5-10min，直至管壁无液滴23) 每管加10-15μLTE溶解沉淀，合并到一个EP管中，保存于-20℃冰箱中三、质粒ＤＮＡ的大量制备在丰富培养基中扩增质粒细菌的收获和裂解收获碱裂解法（一）在丰富培养基中扩增质粒许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2－5mg质粒DNA，而且重复性也很好。
质粒大量提取及纯化
1质粒提取1）菌体活化及扩大培养。
取10µl的-80℃保存的菌液加入到10ml含抗生素的LB培养基中，摇菌培养（或直接划线挑取单菌落）。
吸取250µl活化菌液加入250ml的含抗生素的LB培养基中，摇菌过夜（约11h）。
2）取250ml过夜培养菌液，室温10000rpm（～11500g），离心3min，收集菌体。
倒掉上清液，将离心管倒置于干净的吸水纸上。
3）加入10ml溶液I（已加入RNase A），振荡离心管使菌体重悬。
4）加入10ml溶液II，立即温和上下翻转6-8次，充分混匀，室温放置5min。
温和混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。
此时菌液应变得清亮粘稠，如未变的清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应较少菌体量。
5）加入10ml溶液III，立即温和上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色絮状沉淀。
室温放置10min，10000rpm，离心10min，使白色沉淀离心至管底。
将全部溶液倒入过滤器CS1中，将滤液收集至一干净的50ml离心管中。
6）向滤液中加入0.35倍体积的异丙醇和0.5倍异丙醇体积的5M的NaCl溶液，上下颠倒充分混匀。
置于-80℃中，放置4-5h，使其析出更多质粒。
若此处无沉淀产生为正常现象；可直接加入0.4倍体积的异丙醇，不加NaCl溶液；-80℃放置时间越长，质粒析出越多，一般应保证4-5h，使能够看到白色混浊。
7）10000rpm(~11500×g)，4℃，离心30min，轻轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。
8）向管中加入6ml的70%酒精溶液，充分清洗沉淀。
10000rpm(~11500×g)，4℃，离心10min，轻轻倒掉上清液，将其倒置在吸水纸上。
清洗两次。
9）将离心管放置于超净台中吹干，加入1ml的ddH2O溶解沉淀。
2质粒纯化1）向DNA溶液中加水至500µL。
2）加入500µL“三混”溶液，混匀，13000rpm，离心5min，转移上清液。
质粒提取方法
实验目的：
1、学会小量制备质粒DNA的碱裂解方 法、 煮沸法、小量一步提取法这三种质 粒DNA的提取方法。 2、三种方法的比较，能够根据不同的 实验目的选择合适的方法。
实验原理：
碱变性原理 ： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性 DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.012.5 这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而 被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒 DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍 会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐 缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒 DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经 过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
小量一步提取法：
由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细 菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕 附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒 DNA会变性，机械力后复性。但质粒DNA的复性要快 于细菌染色体DNA。
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括 3个基本步骤:
1、培养细菌使质粒扩增 2、收集和裂解细胞 3、分离和纯化质粒DNA
（一）、煮沸法
试验步骤：
• 将振荡过夜培养的细菌1.5ml ，于8 000r/min离心1min， 弃上清液。 • 将沉淀回溶于350μL STET (0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris· Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。)中。 • 加入25μL溶菌酶(10mg/mL)，放入沸水中40s，立即于 10 000r/min离心10min。 • 吸出上清移至另一个Eppendolf 管中或用已灭菌的牙签 小心地将沉淀去除，加入 40μL2.5mol/LNaAc（PH5.2） 和420μL冰冻的异丙醇，振荡混匀，室温放置5 min。 • 12000g，离心5min，弃上清液，用70%乙醇洗涤两次， 然后将离心管倒扣在吸水纸上，使尽量干燥。 • 用20μL无菌水溶解沉淀，于－20℃冻存
大提质粒步骤完整版
大提质粒步骤试剂配制：1. 1M NaOH (400ml )：分子量为40，秤取16g NaOH，溶于400ml DDW中。
2. 2M Tris-HCl (500ml)：分子量为121.14，秤取121.14g Tris，溶于400 ml DDW 中，用HCl调节pH值为8.0，定容至500ml。
3. Buffer P1 (1000ml)：用50ml离心管量取20ml 0.5M的EDTA，然后量取25ml 2M 的Tris-HCl，加入700ml DDW，用HCl调节pH值为8.0，定容至1000ml。
4. Buffer P2（1000ml）：称取10g SDS，放入1000ml的玻璃瓶中，然后加入750ml DDW，最后加入200 ml 1M的NaOH，混匀，室温放置过夜，使其自溶。
(注：不需要定容，严格按步骤操作。
)5. Buffer P3 (1000ml)：秤取294.42g乙酸钾，溶于800ml DDW中，用冰醋酸调节pH值为5.5，定容至1000ml。
6. Buffer QBT（1000ml）：分别称取NaCl 43.83g，MoPS 10.46g，加入600ml DDW，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。
7. Buffer QC（1000ml）：分别称取NaCl 58.44g，MoPS 10.46g，加入600ml DDW，用NaOH调节pH值为7.0，然后加入150ml异丙醇，定容至1000ml。
8. Buffer QF（1000ml）：称取NaCl 73.05g，量取2M Tris-HCl 25ml，加入800ml DDW，用NaOH调节pH值为8.5，然后加入150ml 异丙醇，定容至1000ml。
9. 10×TE Buffer：量取1MTris-HCl(pH8.0) 100ml，500mM EDTA(pH8.0) 20ml，加入800mlDDW，均匀混合后定容至1L。
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大提质粒1．单菌落接种到5 ml含抗生素的LB培养液中（试管体积应比培养液至少大4倍；试管不应盖得太紧；转速应很剧烈）。
2．当OD600=0.6时倒入含抗生素的250 ml LB培养液，37℃300 r/min培养约14-18 h。
3. 4,000 rpm, 10 min, 4℃收集细胞。
4．去上清，加solution I 8 ml，涡旋振荡重悬（4℃）至溶液均匀无块状菌团。
5．每管加入solution II 16 ml 轻柔上下颠倒20下彻底混匀，置冰上5 min（时间不可过长）。
6．每管加入solution III 8 ml (4℃)，立即轻柔地上下颠倒，彻底混匀，使沉淀均匀混于溶液中，呈现絮状而非团状，冰上放置10min。
7．平衡后，4℃，12,000 rpm, 20 min。
8．将上清经两层神奇滤布（DDW润洗）过滤至新50 ml 离心管中（约30 ml）加入0.6V （约18ml）异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温，30 min。
9．平衡后，室温，12,000 rpm, 20 min。
10．小心弃上清，离心管敞开盖，倒置以去残余上清。
室温下70%乙醇涮洗管底及管壁，倒掉乙醇，倒置去净乙醇，待挥发无味后（不要太干燥）加入总量4.2 ml DDW【or 6.2 ml】。
11．转入15ml瘦型离心管中，加入CsCl 6 g 【or 8 g】（终浓度1g/ml），EB 120μl 【or 160μl】(母液浓度10 mg/ml)。
12．缓慢加入超速离心管6 ml【or 8 ml】，管内要装满，不能有气泡，精确配平（精确值0.01g）。
13．超速离心60,000rpm（~250,000 g），16 h，20℃。
升速调至次最快，降速调至no brake。
14．收集闭环条带：用10ml注射器针头在离心管顶端扎一个小孔；将10ml的一次性注射针器针头斜面向上插入闭合环下方约1cm处，针头的斜面开口正好位于较低的DNA区带（闭环质粒DNA）下方；缓慢吸出质粒DNA，小心不要搅动上方粘稠的染色体DNA区带。
15. 取等体积SSc饱和异戊醇上层加入离心管，反复上下颠倒混匀，静置5-10min，吸除上层含有EB的有机相，重复10次左右，直至溶液不含红色EB。
最后一次抽提可静置60-90 min 【通风橱中操作】。
16．吸300μl质粒溶液入进口Ep管，加入1.2 ml (4V) 70% 乙醇颠倒混匀，沉淀质粒，室温，>30 min。
17．小离心机，13,000 rpm,15 min，室温。
18．加入600μl，70% 乙醇洗一次，13,000 rpm，3 min，室温。
倒掉酒精，甩一下，用枪吸除剩余液体，放置5 min，呈半透明状，加DDW 200μl（依量而定）溶解。
19．稀释10倍或100倍，取2μl NANODrop测定浓度，再取500ng跑电泳。
List：1. Solution 1：50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl（pH 8.0）/ 10 mM EDTA（pH 8.0）；4℃存放S1 100ml葡萄糖(Glc) 0.9908g1M Tris·Cl 2.5ml0.5M EDTA 2.0ml2. Solution 2：0.2 N NaOH / 1%（m/V）SDS；（配10 N NaOH，S2要现配，先加水）S2 100 ml10N NaOH 2 ml10% SDS 10 ml3. Solution 3（4℃存放）S3 100ml5M乙酸钾60.0ml（MW=98.14g/mol，or 直接称取29.442g乙酸钾固体）；冰乙酸11.5mlH2O 28.5ml；4. 异丙醇isopropanol；5. CsCl（固体）；6. EtBr (10 mg/ml)；7. 石蜡油8. SSc饱和异戊醇20×SSc：800 ml DDW溶解175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠，用几滴14mol/L浓盐酸调pH 值=7，用水定容至1 L，分装（分在两瓶）后高压灭菌。
SSc饱和异戊醇：200 ml 20×SSc与300 ml 异戊醇充分颠倒混匀，室温静置分层（放置过夜，提前准备）。
使用时吸取上层。
9. 70%乙醇10. LB培养基（每瓶250ml）11. 神奇滤布，离心瓶（两种：离心菌的，沉淀DNA的）12. 冰13. 10 ml注射器若干14. 提前预约超速离心机拟南芥原生质体转化（所有药品均为进口）1．打开水浴锅，TM=55℃2. 配10 ml酶解液(8种试剂)，置于培养皿中【10ml酶解液，40片叶子，约产出3×106 protoplasts】酶解液(8种试剂)【现配】40 ml 10ml 15ml Cellulose R10 0.6 g（不要粘在管壁上）0.15g 0.225gMacrozyme R10 0.16 g 0.04g 0.06g0.8 M Mannitol 20 ml 5ml 7.5ml2 M KCl 0.4 ml 100μl 150μl1M MES 0.8ml 200μl 300μl55 o C，10 min(严格，前边摇2-3次，待管壁不再粘有酶，溶液澄清就不用摇)，待酶液自然降至室温，加入0.4 mL【10ml-100μl；15ml-150μl】1M CaCl2 母液以及18.4 mL 【10ml-4.6ml；15ml-6.9ml】DDW（补足40ml），0.04 g BSA【10ml-0.01g；15ml-0.015g】，最终酶液应为清亮棕色溶液，0.45μm滤膜过滤。
3．将0.4 M mannitol 滴至一次性培养皿上，将叶片切成细丝，一刀一刀断开切，忌来回蹭。
4．23 o C避光酶解2 h (或3 h，放置时间较长的酶液)，40 rpm。
收获前75 rpm，摇1 min。
5．配PEG【至少转化前1h配制，以便PEG完全溶解，室温放置】，提前将BD 50 ml 离心管置冰上。
PEG【最好现配，不灭菌】5mlPEG 4000 2 g0.8 M Mannitol 1.25 ml1 M CaCl2 0.5 mlDDW 1.5ml6．用等体积W5稀释酶/原生质体溶液，尼龙膜（W5润洗）过滤至50 ml 离心管收集原生质体，100 g，3min，23℃，升速3，降速3离心7．用5 ml 大枪头吸除酶液，原生质体多则把酶液吸净，少则留一点酶液，加入10-20 ml W5 （依量而定）洗涤。
100 g，3min，23℃，升速3，降速3离心8．吸去上清，再加入20 ml W5，轻摇离心管重悬原生质体。
冰上30min，镜检，Hemacytometer 血球计数板计数。
100 g，3min，23℃，升速3，降速3离心。
9．吸净W5上清，加入2-3 ml Mmg重悬，使原生质体浓度达到1.5-2×106 ml-1，冰上放置。
10．加15μg 质粒DNA至2ml离心管中，沿管壁缓慢加入150μl原生质体溶液【每次取的时候重悬混匀原生质体】，轻轻充分吹打混匀。
立即缓慢加入150μl PEG溶液，呈两层，轻柔颠倒充分混匀，不要有PEG溶液一点一点，而应是充分均匀的溶液。
11. 加完PEG后每管室温放置8-15min。
（PEG刚加入时要分层，否则转化效率不高）。
[大反应：取50 ml离心管，每管加入120 μg 质粒/每一种，然后用枪吸打混匀，阴性对照加一种质粒，然后用水补齐使总体积一致，然后用枪吸打混匀。
冰上放置。
50 ml离心管中加入3 ml 原生质体溶液，沿管壁缓慢加入，充分摇匀。
每次室温摇匀后随即每50 ml离心管加入3 ml PEG溶液，轻柔颠倒混匀，不要有PEG溶液一点一点，而应是充分均匀的溶液。
加完PEG后每管室温放置8-15 min。
]12．好的情况下，此时不应看见有沉渣。
加入1ml室温W5【W5沿管壁轻缓流入管底】，马上轻轻颠倒混匀，终止反应。
盖子一定不要盖得太紧，100 g，3min，23℃，升速3，降速3离心。
14．吸除上清，留约100μl，再加入1ml W5，100 g，3min，23℃，升速3，降速3离心。
15．吸除上清，再加入1-2ml W5，重悬原生质体，置于12孔板中，室温，放置于白色白炽灯下，液体不要粘在盖子上，用一张白纸遮盖住(光不要太强)，放约12-18 h。
注意事项：①3-4周的未经移苗的植物：取刚刚完全展开，叶面光滑，非凹凸不平的，最上面最中间的叶片，依次向下选取，取瘦长的，叶缘尖锐的叶片为佳，以第5-7片真叶为佳。
每四棵苗取8-10片叶子。
②每次做大反应（用于CO-IP）最多做8管，每管需3 ml原生质体溶液，浓度为106，10 ml酶液需40片叶子。
小反应用于做蛋白定位，每管需200 μl原生质体溶液，20μg质粒。
③提出原生质体后每一步都要动作轻缓，以免原生质体破裂，操作间隙置冰上。
100ml W5【室温保存】1 M MES 200 μl1 M CaCl2 12.5 ml2 M KCl 250 μlNaCl 0.9009gDDW add to 100ml20ml MMG【室温保存】1 M MES 80 μl0.8 M Mannitol 10 ml1 M MgCl2 300 μlDDW add to 20mlList：1.水浴锅，摇床，冰，0.4 M mannitol2.0.45μm（or 0.22μm）滤膜，培养皿，量筒，刀，75 μm尼龙膜，锡箔纸，计时器，弯头镊子（用于撕叶片下表皮）3.显微镜，移液器，移液管（最好灭菌），血球计数板，50 ml/2 ml离心管（进口）4.6/12孔板（6/12-well tissue culture plate）5.PEG现配，提前把质粒稀释到所需浓度（2μg/μl），准备好Confocal：1.准备：确认预约时间，剪枪头2.样品及锡箔纸，枪头（剪过的，未剪的），枪，载玻片，盖玻片，笔，签字笔，记录本，Ep管及板，DVD盘，剪刀，羊毛脂，擦镜纸3.每一次照完照片立即命名。