电泳法
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电 泳 技 术
带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。
电泳技术即是利用样品中各种带电粒子的
带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场
中的迁移速度不同，从而对样品分子进行分离、
鉴定、纯化和制备。在生物学领域，该技术多 一般要求薄板用的活性为Ⅱ ~ Ⅲ级
用于分离，纯化、鉴定蛋白质、核酸等大分子
物质。
电泳的分类
纸电泳
醋酸纤维素电泳
淀粉凝胶电泳
琼脂糖电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.影响电泳迁移率的因素：
1、影响电泳迁移率的外界因素： 电场强度 溶液的pH值 溶液的离子强度 电渗现象 2.影响电泳迁移率的内在因素： 质点所带净电荷的量 质点的大小和形状
迷你垂直型电泳槽
DNA序列分析电泳槽
中型双垂直电泳槽
3、操作步骤
1. 准备
醋酸纤维素薄膜的预处理：将薄膜小心放入盛有 缓冲液的培养皿内，使其漂浮在液面；用镊子轻压， 使其全部浸入缓冲液内。待膜完全浸透（约半小时） 后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓 冲液，同时分辨出光滑面和粗糙面。 标记：在粗糙面上用铅笔距薄膜条一端 1.5cm 处 划线即为点样线并作好标记，同时标上学号和正负 极。
3.4 毛细管电泳技术
毛细管电泳：使电泳过程在散热效率极高的毛细 管内进行，使焦耳热效应减小，能使用高电压， 全面改善分离质量和提高分析速度。
uap uos uef
阴离子
uap uos
中性分子
uap uos uef
阳离子
4、 CE 的检测器
CE对检测器的要求： 既能作灵敏检测，又不使谱带展宽。（死体积小） 一般采用柱上检测。 CE 检 测 器 方 法
点样端
1.滤纸桥
2.电泳槽
3.醋酸纤维素薄膜
4.电泳槽膜支架
5.电极室中央隔板
4. 染色
电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染 色5-10min。
5. 漂洗
用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每5min左右换 一次液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜 夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。
操作中，注意控制染色和漂洗的时间，防止背景 过深或某些区带太浅。
3.2 醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤 维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维 素薄膜。 这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全 消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的 亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时 电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电 泳时间短，样品用量少，5μg的蛋白质可得到满 意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量 异常蛋白的检测。
紫外可见光检测器 二极管阵列检测器
荧光检测器（激光诱导荧光）
电化学检测器 质谱检测器
其他
源自文库
1.紫外－可见检测器：最常用
类型：
固定波长
可变波长
DAD
特点：
除去保护层
通用性好， 特别是对蛋 白质的适用 很强。
3.激光诱导荧光检测器：灵敏度最高
优点：激光光强度大，单色性、相干性好；聚焦性 能好，易于校准并减小光的散射；可以使用更小孔 径毛细管；灵敏度高，检测限达，可实现单细胞检 测。
1、是否具有介质分为： 自由界面电泳
区带电泳
2、按其介质的物理性状不同可分为： (1)滤纸及其它纤维电泳：如玻璃纤维膜、乙酸 纤维膜、聚胺纤维薄膜。 (2)凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉 凝胶电泳。 (3)粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 (4)线丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。
区带电泳： 是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶 物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动 的电泳方法。 避免对流的干扰。
实验室常见的电泳装置
（ 核水 酸平 电电 泳泳 ） （ 蛋 白垂 质直 电 电泳 泳 ）
血清醋酸纤维素薄膜电泳
常用电泳技术和电泳方法
二、电泳方法简介 （一）纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方 法。是最早使用的区带电泳。
将滤纸条水平地架设在 两个装有缓冲溶液的容 器之间，样品点于滤纸 中央。当滤纸条被缓冲 液润湿后，再盖上绝缘 密封罩，即可由电泳电 源输入直流电压 （100V～1000V）进行 电泳。
3.3 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为 一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐 等杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽 相同。对DNA 电泳迁移率的影响也不一样，经化 学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其 机械强度无明显变化，主要用于DNA的限制酶原 位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10～500 bP）的分离。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的 浓度。
2. 点样
在薄膜的粗糙面点样。点样时，先用移液 枪将 5 微升血清均匀地涂在点样器表面，再用 点样器“印”在薄膜的点样区内，样品呈线状， 宽约1-2mm。
3. 电泳
将点样后的薄膜使粗糙面（点样面）向下，点样 端置于负极，贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，平 衡5min。 打开电源，调节电压和电流强度。调节电压至 100-120V 左右，电流强度为 0.4 ～ 0.6mA/cm 薄膜条 宽，电泳时间1小时左右。
缺点：通用性差，适合DNA检测， 样品需要衍生化。
检测方法：把一束激光发出的辐射通过短聚焦透 镜或显微物镜聚焦到毛细管壁上，通过一个棱镜 系统或者（显微物镜（光导纤维）将产生的荧光 收集到一个和激发光束成90度的位置上。
激光诱导荧光显微镜检测系统
采用前照明显微镜结 构，通过同一物镜收 集荧光发射，提高荧 光的收集效率，减小 背景干扰。
例2：CZE同时分离17种碱性药物
缓冲溶液： 磷酸二氢钠 毛细管： 6075m
印记法
分离荧光和反射光 可实现分子水平级 检测！
激光诱导荧光柱后鞘流池检测系统
鞘流的成分 与毛细管缓 冲液相同
消除样品、毛细管管壁界面产生的散射光，以减小背景信号的产生。 比普通在柱检测灵敏度高4个数量级，质量检测可达几个分子级。
例1：黄连成药中7种小檗碱生物碱的CZE分离
分离条件：
柱：57cm×75m 分离电压：14kV 检测波长：254nm 低压进样：2s 柱温：30℃ 电泳缓冲液： 50mmol/LNaH2PO4甲醇（65：35）
带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。
电泳技术即是利用样品中各种带电粒子的
带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场
中的迁移速度不同，从而对样品分子进行分离、
鉴定、纯化和制备。在生物学领域，该技术多 一般要求薄板用的活性为Ⅱ ~ Ⅲ级
用于分离，纯化、鉴定蛋白质、核酸等大分子
物质。
电泳的分类
纸电泳
醋酸纤维素电泳
淀粉凝胶电泳
琼脂糖电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.影响电泳迁移率的因素：
1、影响电泳迁移率的外界因素： 电场强度 溶液的pH值 溶液的离子强度 电渗现象 2.影响电泳迁移率的内在因素： 质点所带净电荷的量 质点的大小和形状
迷你垂直型电泳槽
DNA序列分析电泳槽
中型双垂直电泳槽
3、操作步骤
1. 准备
醋酸纤维素薄膜的预处理：将薄膜小心放入盛有 缓冲液的培养皿内，使其漂浮在液面；用镊子轻压， 使其全部浸入缓冲液内。待膜完全浸透（约半小时） 后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓 冲液，同时分辨出光滑面和粗糙面。 标记：在粗糙面上用铅笔距薄膜条一端 1.5cm 处 划线即为点样线并作好标记，同时标上学号和正负 极。
3.4 毛细管电泳技术
毛细管电泳：使电泳过程在散热效率极高的毛细 管内进行，使焦耳热效应减小，能使用高电压， 全面改善分离质量和提高分析速度。
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阴离子
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中性分子
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阳离子
4、 CE 的检测器
CE对检测器的要求： 既能作灵敏检测，又不使谱带展宽。（死体积小） 一般采用柱上检测。 CE 检 测 器 方 法
点样端
1.滤纸桥
2.电泳槽
3.醋酸纤维素薄膜
4.电泳槽膜支架
5.电极室中央隔板
4. 染色
电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染 色5-10min。
5. 漂洗
用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每5min左右换 一次液，连续更换三次，可使背景颜色脱去。将膜 夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。
操作中，注意控制染色和漂洗的时间，防止背景 过深或某些区带太浅。
3.2 醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤 维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维 素薄膜。 这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全 消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的 亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时 电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电 泳时间短，样品用量少，5μg的蛋白质可得到满 意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量 异常蛋白的检测。
紫外可见光检测器 二极管阵列检测器
荧光检测器（激光诱导荧光）
电化学检测器 质谱检测器
其他
源自文库
1.紫外－可见检测器：最常用
类型：
固定波长
可变波长
DAD
特点：
除去保护层
通用性好， 特别是对蛋 白质的适用 很强。
3.激光诱导荧光检测器：灵敏度最高
优点：激光光强度大，单色性、相干性好；聚焦性 能好，易于校准并减小光的散射；可以使用更小孔 径毛细管；灵敏度高，检测限达，可实现单细胞检 测。
1、是否具有介质分为： 自由界面电泳
区带电泳
2、按其介质的物理性状不同可分为： (1)滤纸及其它纤维电泳：如玻璃纤维膜、乙酸 纤维膜、聚胺纤维薄膜。 (2)凝胶电泳：如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉 凝胶电泳。 (3)粉末电泳：如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 (4)线丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。
区带电泳： 是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶 物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动 的电泳方法。 避免对流的干扰。
实验室常见的电泳装置
（ 核水 酸平 电电 泳泳 ） （ 蛋 白垂 质直 电 电泳 泳 ）
血清醋酸纤维素薄膜电泳
常用电泳技术和电泳方法
二、电泳方法简介 （一）纸电泳 指用滤纸作为支持载体的电泳方 法。是最早使用的区带电泳。
将滤纸条水平地架设在 两个装有缓冲溶液的容 器之间，样品点于滤纸 中央。当滤纸条被缓冲 液润湿后，再盖上绝缘 密封罩，即可由电泳电 源输入直流电压 （100V～1000V）进行 电泳。
3.3 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为 一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐 等杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽 相同。对DNA 电泳迁移率的影响也不一样，经化 学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其 机械强度无明显变化，主要用于DNA的限制酶原 位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10～500 bP）的分离。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的 浓度。
2. 点样
在薄膜的粗糙面点样。点样时，先用移液 枪将 5 微升血清均匀地涂在点样器表面，再用 点样器“印”在薄膜的点样区内，样品呈线状， 宽约1-2mm。
3. 电泳
将点样后的薄膜使粗糙面（点样面）向下，点样 端置于负极，贴在电泳槽支架的“滤纸桥”上，平 衡5min。 打开电源，调节电压和电流强度。调节电压至 100-120V 左右，电流强度为 0.4 ～ 0.6mA/cm 薄膜条 宽，电泳时间1小时左右。
缺点：通用性差，适合DNA检测， 样品需要衍生化。
检测方法：把一束激光发出的辐射通过短聚焦透 镜或显微物镜聚焦到毛细管壁上，通过一个棱镜 系统或者（显微物镜（光导纤维）将产生的荧光 收集到一个和激发光束成90度的位置上。
激光诱导荧光显微镜检测系统
采用前照明显微镜结 构，通过同一物镜收 集荧光发射，提高荧 光的收集效率，减小 背景干扰。
例2：CZE同时分离17种碱性药物
缓冲溶液： 磷酸二氢钠 毛细管： 6075m
印记法
分离荧光和反射光 可实现分子水平级 检测！
激光诱导荧光柱后鞘流池检测系统
鞘流的成分 与毛细管缓 冲液相同
消除样品、毛细管管壁界面产生的散射光，以减小背景信号的产生。 比普通在柱检测灵敏度高4个数量级，质量检测可达几个分子级。
例1：黄连成药中7种小檗碱生物碱的CZE分离
分离条件：
柱：57cm×75m 分离电压：14kV 检测波长：254nm 低压进样：2s 柱温：30℃ 电泳缓冲液： 50mmol/LNaH2PO4甲醇（65：35）