第十节 谷胱甘肽过氧化物酶(gshpx)活力测定
禾本科植物谷胱甘肽氧化物酶的活性测定
禾本科植物谷胱甘肽氧化物酶的活性测定摘要：本文以羊草的叶片和根为材料, 用0. 2 mo l /L pH 6. 2的磷酸缓冲液( 含1 mmo l/L EDTA-2Na，5%的水溶性PVP)作为谷胱甘肽过氧化物酶（GSH一PX）的提取介质，偏磷酸为酶促反应的蛋白质沉淀剂, 二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB ) 与GSH显色反应3min, 在412 nm测定酶管和非酶管的OD值, 以测定谷胱甘肽过氧化物酶的活性关键词：盐碱胁迫；羊草；GSH-PX；酶活性Analyzing Soluble Sugar Content and Biomass of Sweet Sorghumunder Saline-alkali StressAbstract:Soil salinization is a global issue. Experiments prove that growing state of sweet sorghum shows growth inhibition，lower production and physiological disorders under soil salinity In this study,sweet sorghum as our material，was sowed in neutral soil and saline soil, respectively，exploring characteristics of salinity stress for the sweet sorghum and the change of soluble sugar and biomass. According to the particularity of different soils，we observed the relationship between different varieties and salt-alkali stress at different growth stages.Profound understanding of physiological mechanism of sweet sorghum response to salt-alkali stress for screening sweet sorghum germplasm,identifying salinity tolerance and cultivating the new sweet sorghum species is significance.Keywords: Salt stress; sweet sorghum; Glutathione peroxidase; enzyme actirityⅠ1前言植物是一个需氧代谢的有机体。
组织、线粒体和细胞膜中GSH-PX 活力的测定
组织、线粒体和细胞膜中GSH-PX 活力的测定一、样本的前处理：1、10%组织匀浆的制备：a、取组织块（0.2-1g）用冰冷的生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5-10ml的小烧杯内。
b、用量筒量取预冷的匀浆介质或生理盐水。
匀浆介质或0.86%生理盐水的量应该是组织重量的9倍。
用移液管将总量2/3的匀浆介质或生理盐水移入烧杯。
用眼科小剪尽快剪碎组织块（天热时小烧杯要放入冰水中）c、将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩下的1/3匀浆介质或0.86%生理盐水用来冲洗残余在小烧杯中的碎组织一起倒入玻璃匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水的器皿中，右手将杆垂直插入套管中上下转动研磨数十次（6-8分钟），充分磨碎，使组织匀浆化。
或者用组织捣碎机10000-15000r/min研磨制成10%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆器制成10%组织匀浆（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3-4次，温度0-4℃），心肌组织等可延长匀浆时间。
【注】根据预试结果取最佳浓度进行测定。
d、将制备好的10%匀浆用普通离心机或低温离心机3000r/min左右离心10-15分钟。
将离心好的匀浆留上清棄下面沉淀。
e、根据你的实验需要，取适量上清液进行各种测定。
2、线粒体的制备：取10%的组织匀浆5-10ml，以1000-2000r/min离心10分钟（用普通离心机或低温低速离心机），取上清液以8000-10000r/min（低温高速离心机）离心15分钟，沉淀物为线粒体。
二、组织、线粒体和细胞膜中GSH-PX活力测定操作表：（1）、酶促反应：非酶管（对照管）酶管（测试管）1mmol/L GSH(ml)0.20.2样本**（ml）0.237℃水浴预温5分钟试剂一（37℃预温）（ml）0.10.137℃水浴准确反应5分钟试剂二（ml）22样本（ml）0.2混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1ml作显色反应。
大鼠谷胱甘肽过氧化物酶GSHPX酶联免疫分析ELISA
大鼠谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）的活性。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）水平。
用纯化的谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽-过氧化物酶，再与HRP标记的GSH-PX抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽-过氧化物酶呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）的活性。
试剂盒组成：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
谷胱甘肽过氧化物酶
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒
微量法100T/96S
测定意义：
GSH-Px是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。
GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与ROS反应，生成氧化型谷胱甘肽GSSG，从而保护生物膜免受ROS的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。
测定原理：
GSH-Px催化有机过氧化物氧化GSH，产生GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化NADPH还原GSSG，再生GSH，同时NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，而NADP+没有；通过测定340 nm光吸收减少速率来计算GSH-Px活性。
10种细胞损伤模型建立方法
10种细胞损伤模型建立方法转载请注明来自丁香园发布日期：2012-10-09 14:36 文章来源：丁香园分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键词：细胞细胞培养技术专题义翘神州丁香园丁香通点击次数：997现在很多实验都涉及到细胞损伤模型的建立和运用，如CCl4诱导肝细胞损伤模型（体内、体外）、PC12细胞的NO和淀粉样蛋白(Aβ)损伤模型、神经元缺血再灌注损伤模型，以及脉络宁对骨骼肌缺血再灌注损伤保护作用等。
一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。
将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。
然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。
分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。
将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。
2CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx 活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。
谷胱甘肽过氧化物酶的检测及意义
等)在技术上比较困难.而通过检测血液中抗氧物
(酶)及FR氧化产物的含量(酶活力)，来间接反映
氧白由从的存在，则比较容易，这也是当前氧白由从
研究中最普遍应用的方法.本文重点介绍一种抗过氧
化物酶—谷眺甘肤过氧化物酶的检测及意义.l谷胶甘肚过级化物酶及其盆要生理功能〔，·2，
GSH的消耗量，以反映酶活性.ZGSH+DTNB一卜
GssG+ZTNB.Gross〔5〕首先报道osH一PX宁舌力以
每克Hb每分钟GSH以一级反应速度(K)表示，
即
K一〔，·，‘忿2一:)·，二(GSHGSH
Haffcman〔‘，以单位时间内一09〔GsH〕降低量表示加
46
GsH中X活性，称为Haffeman单位.唐琼华等在
生一系列血液流变学的改变.
2.GSH一PX的检测
GSH一PX活性检测有直接法和问接法两种.
2.1直接法即测定GSH一PX的墓质GSH的消耗
量或GSSG的生成量.以反映其活性.
2.1.1紫外分光度法〔，，osH在波长255nm处呈
最大吸收，通过酶与基质作用，从255nm吸光度的
降低计算GSH的消耗量，从而判断酶活性.此法仅
成，在GSH一PX作用下，LOOH转化为无活性的
LoH.osH一px参与前列环素(，GIZ)和血栓素
(TxAZ)的合成，而LooH抑制pGI:合成酶的活
性，从而破坏了PGT:和TxA:之介，]的平衡.Lo0H
与TxA:呈正相关，PGI:与LooH呈负相关.将引
起血小板聚集和血管收缩，红细胞膜通透性降低，发
Faraji(.)对几种osH甲X测定方法进行T比
酵母中谷胱甘肽过氧化物酶_GSH_Px_活性的分析
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酵母中谷胱甘肽过氧化物酶 @ AB1 C DE F 活性的分析
盛 玮
淮北 !*H))) F @ 淮北煤炭师范学院生物系 G 安徽
表$ 培养条件 不同培养条件对酵母 %& ’()* 的影响 有 氧 无 氧 加 ,# E . A>B C D IJ" &<8$ "+ -$ 2 #+ ," .+ 0" 2 #+ ,0 ,+ ,. 2 #+ #"0+ ". 2 #+ "! ,#+ ," 2 #+ "0 .+ -" 2 #+ $,
以减轻和阻断脂质过氧化作用的一级引发作用g以及ab1kde通过还原过氧化物来减轻和阻止二级引发作用证实在红细胞中有ab1kde以来g大量的文献报导了各种哺乳动物中的ab1kdegab1kde的特性进行了研究但关于植物和微生物中的ab1kde报道较少本文以种酵母为实验材料g研究ab1kde种酵母中的活性在生物体中g特别是酵母g还原氧的衍生物的一些酶如超氧化物歧化酶过氧化氢酶g表现出来的酶的活性受细胞中酶的底物代谢速率所控制酶母细胞中的过氧化物的浓度与生长环境有关g因此本文又研究了酶母在含有1
"+!
在无氧条件下培养对酵母 %& ’()* 活性的影响 在培养基中添加 , F C D 的 GH<<=-#、 $# AF C D 的麦角甾酵 ; 进行无氧培养 + 培养结束后 ; 再 加 " F C D 的氯酶素 ; 阻止酵母在有氧的情况下生长和合成新的蛋白质 + 测定酵母的 %&’()* 的 活性; 其结果 4 见表 $ 9 表明 ; &<(%&’()* 的活性下降; 而 =>=(&<(%&’()* 活性上升+ "+. 酵母在含硒的培养基中生长对 %& ’()* 的影响 酵母 ,$", 在含有 ,# E . A>B C D 的 IJ" &<8$ 培养基中生长 ; 在对数期离心收集酵母 + 测定 %&’()* 活性 ; 结果 4 见表 $ 9 显示 ; 酵母在含 IJ" &<8$ 培养基中生长 ; &<(%&’()* 的活性增加 ; 这 与动物组织中的 %&’()* 相类似 +
大鼠谷胱甘肽过氧化物酶GSHPX酶联免疫分析ELISA
大鼠谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）的活性。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）水平。
用纯化的谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽-过氧化物酶，再与HRP标记的GSH-PX抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽-过氧化物酶呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）的活性。
试剂盒组成：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
细胞损伤模型
一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1大鼠肝细胞的分离和培养大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。
将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次。
然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液。
分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90％，高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞。
将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。
12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。
2CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同时间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT 反应。
根据检测结果制备CCl4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。
选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同时设溶媒对照组，每组至少设3个复孔。
3H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1），作用不同时间（0.5～4 h）后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。
鸭子谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX酶联免疫分析
鸭子谷胱甘肽过氧化物酶(GSH -PX)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T0.1 pmol/ml -24 pmol/ml使用目的：本试剂盒用于测定鸭子血清，血浆及相关液体样本中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH -PX)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸭子谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)水平。
用纯化的鸭子谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)，再与HRP标记的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX-PX)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中鸭子谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)浓度。
试剂盒组成1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
凯基谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测试盒
注意
注 1：空白管、标准管一般只需做 1-2 只。
注 2：最佳取样量及最佳取样浓度因样品种类不同，其 GSH-PX 活力不一。根据酶的百分抑制率与酶的活 力呈抛物线关系，各种测定样品取样量及取样浓度不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取
样量及最佳取样浓度。
最佳取样浓度的摸索
测试前先预试以确定最佳取样浓度：当您第一次使用本试剂盒测试某一种新的样品时最好先做三只不同浓
4℃或室温保存 6 个月
4℃保存 6 个月 4℃避光保存五天
4℃保存
GSH 的分子量为 307，每次测定前将 1 支 3.07mg 的 GSH 标准品粉剂加到 GSH 标准品的溶剂应用液 中，定容至 10ml 即为 1mmol/L 的 GSH 溶液，现用 现配。
取 1mmol/L GSH 溶液 2ml 加 GSH 标准品溶剂应用 液 18ml 定容至 20ml，作标准曲线用，若不做标准 曲线可以不配。
保存条件 4℃
3 5 7
GSH 应用液的配制： 1mmol/L GSH 溶液
100u mol/L GSH 溶液 20umol/L 的 GSH 标准溶液
试剂二应用液的配制：将已配好的 甲乙两种混合。此为过饱和溶液， 室温静置冷却后，如有结晶，则取 上清进行实验。 加蒸馏水 100ml 溶解 每支加蒸馏水 10ml 溶解 标准品溶剂应用液：GSH 标准品 溶剂贮备液：双蒸水=1：9 即 10 倍稀释配成应用液；按所需量现用 现配。
二．试剂盒的组成和配制
25 Tests (50 Tubes)试剂盒的组成和保存： 试剂编号 1
2
3 4 5
名称 贮备液
甲粉 乙液 粉剂 液体 粉剂
6
GSH 标准品粉剂
(完整版)GSH-Px活力的测定SOP
主要目的：——测定物质谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）活力。
主要原理：——谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）可以促使过氧化氢（H 2O 2）与还原性谷胱甘肽（GSH ）反应生成H 2O 及氧化性谷胱甘肽（GSSG ）,谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。
H 2O 22O+GSSGGSH-Px 的活力以催化GSH 的反应速度来表示，由于这两个底物在没有酶的条件下，也能进行氧化还原反应（称为非酶促反应），所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应引起的GSH 减少的部分。
而GSH 含量的测定可以跟据GSH 和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412nm 处测其吸光度即可计算出实验室签章一、试剂——谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒（南京建成生物研究所）二、仪器设备——96孔酶标板——UV-Vis可见多功能酶标仪——旋涡混匀器——离心机——水浴锅——移液枪及其相应量程枪头三、实验方法根据试剂盒说明书具体操作步骤如下:1. 非酶管和酶管各加入1 mmol/LGSH 0.2 mL ，酶管加入稀释后的待测血清和组织匀浆液0.2 mL ，37 ºC 水浴预温5分钟，酶管和非酶管分别加入试剂一应用液0.1 mL ，37 ºC 水浴准确反应5分钟，酶管和非酶管分别加入试剂二应用液2 mL ，同时非酶管加入待测细胞上清液0.2 mL 。
混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1 mL 作显色反应。
2. 空白管加入1 mL GSH 标准品溶剂应用液，标准管加入1 mL 20 μmol/LGSH 标准液，非酶管和酶管各加入上一步骤1 mL 上清液，然后空白管、标准管、非酶管和酶管各加入1 mL 试剂三应用液，0.25 mL 试剂四应用液和0.05 mL 试剂五应用液。
鸭子谷胱甘肽过氧化物酶GSH-PX酶联免疫分析
鸭子谷胱甘肽过氧化物酶(GSH -PX)酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T0.1 pmol/ml -24 pmol/ml使用目的：本试剂盒用于测定鸭子血清，血浆及相关液体样本中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH -PX)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸭子谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)水平。
用纯化的鸭子谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)，再与HRP标记的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX-PX)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中鸭子谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)浓度。
试剂盒组成1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
大鼠谷胱甘肽-过氧化物酶GSH-PX酶联免疫分析ELISA
大鼠谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）的活性。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）水平。
用纯化的谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽-过氧化物酶，再与HRP标记的GSH-PX抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽-过氧化物酶呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠谷胱甘肽-过氧化物酶（GSH-PX）的活性。
样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px_GPX)活性检测试剂盒说明书__微量法UPLC-MS-4499
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px/GPX）活性检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：UPLC-MS-4499规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体60mL×1瓶4℃保存试剂一粉剂×2瓶4℃保存试剂二液体10μL×1瓶4℃保存试剂三液体30mL×1瓶4℃保存试剂四液体15mL×1瓶4℃保存试剂五液体5mL×1瓶4℃保存标准品粉剂×1支4℃保存稀释液液体20mL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、试剂一：临用前加入3.3mL稀释液，充分溶解；2、试剂二：临用前按2μL试剂二：10mL蒸馏水的比例稀释试剂二，现用现配；3、试剂三：瓶底若有结晶可50℃水浴溶解，此溶液为饱和溶液，若底部最终还有结晶，吸取上清使用即可；4、标准品：10mg还原型谷胱甘肽。
临用前加入0.405mL稀释液溶解为80μmol/mL的标准溶液备用。
产品说明：谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px或GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。
GPX能够催化还原型谷胱甘肽（GSH）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。
GPX催化H2O2氧化GSH，产生GSSG，GSH能与DTNB生成在412nm处有特征吸收峰的化合物，412nm下吸光度的下降即可反应GPX的活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、天平、台式离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、EP管。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、组织：按照组织质量（g）:提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取0.05g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。
谷胱甘肽过氧化物酶
谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）检测
谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione Peroxidase, GPX）是广泛存在于生物体内的一种重要的过氧化物分解酶，能催化还原型谷胱甘肽（GSH）转化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物，从而保护生物膜免受活性氧（ROS）的损害，维持细胞的正常功能。
此外，GPX还具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等作用。
迪信泰检测平台采用生化法，结合相应的酶类的试剂盒，可高效、精准的检测谷胱甘肽过氧化物酶的活性变化。
此外，我们还提供其他ASA-GSH循环类的检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定谷胱甘肽过氧化物酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 谷胱甘肽过氧化物酶活性信息。
第十节谷胱甘肽过氧化物酶（gshpx）活力测定
1.3.6.2 血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH －Px ）活力测定）活力测定 1.3.6.2.1 原理原理谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。
对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH 氧化的反应速度，及单位时间内GSH 减少的量来表示，GSH 和5,5,5’5’5’--二硫对硝基苯甲酸（DTNB ）反应在GSH-Px 催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm 波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH 减少的量，由于GSH 能进行非酶反应氧化，能进行非酶反应氧化，所以最后计所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH 减少。
减少。
1.3.6.2.2 试剂和仪器试剂和仪器仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器样器试剂：叠氮钠磷酸缓冲液试剂：叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0 N a N 3 16.25mg 终浓度2.5mmol/L EDTA-N a2 7.44mg 终浓度0.2mmol/L N a2HPO 41.732g 终浓度0.2mol/L N a H 2PO 41.076g终浓度0.2mol/L加蒸馏水至100mL ，用少量HCL 、N a OH 调pH7.0，4℃保存。
℃保存。
1mmol/L 谷胱甘肽（还原型GSH ）溶液）溶液GSH 30.7mg 加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL ，临用前配制，冰冻保存1－2日。
日。
1.25－1.5mmol/LH 2O 2溶液溶液取30％H 2O 2 0.15－0.17mL ，用双蒸水稀释至100mL ，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
倍即可。
偏磷酸沉淀液偏磷酸沉淀液 HPO 3 16.7g （先用蒸馏水溶解）（先用蒸馏水溶解） EDTA 0.5g N a Cl280g加蒸馏水至1000mL ，用普通滤纸过滤，室温保存。
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1.3.6.2 血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定1.3.6.2.1 原理谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。
对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。
1.3.6.2.2 试剂和仪器仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器试剂：叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0N a N316.25mg 终浓度2.5mmol/LEDTA-N a27.44mg 终浓度0.2mmol/LN a2HPO4 1.732g 终浓度0.2mol/LN a H2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L加蒸馏水至100mL，用少量HCL、N a OH调pH7.0，4℃保存。
1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。
1.25－1.5mmol/LH2O2溶液取30％H2O20.15－0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
偏磷酸沉淀液HPO316.7g（先用蒸馏水溶解）EDTA 0.5gN a Cl 280g加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。
0.32mol/LN a2HPO4溶液:N a2HPO422.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。
DTNB显色液DTNB 40mg柠檬酸三钠 1.0g加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。
0.2M磷酸缓冲液pH7.40.9%生理盐水1.3.6.2.3 实验步骤1.3.6.2.3.1 样品制备溶血液：取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4h内测定酶活力。
若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。
测前取出样品室温自然解冻。
组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M磷酸缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复3次制成5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以12500×g离心10min（低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加20％（v/v）甘油分装于塑料管，放置-20－-80℃，可保存数周，而酶活力不减。
1.3.6.2.3.2 GSH标准曲线的制作：取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。
取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。
以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD423值为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.6.2.3.3 测定步骤：试剂样品管（mL）非酶管（mL）空白管（mL）1.0mmol/LGSH 0.4 0.4样品** 0.4双蒸水* 0.437℃水浴预温5minH2O2（37℃预热）0.2 0.237℃水浴准确反应3min （严格控制时间）偏磷酸沉淀液 4 43000r/min离心10min离心上清液 2 2双蒸水0.4偏磷酸沉淀液 1.60.32mol/LN a2HPO4 2.5 2.5 2.5DTNB显色液0.5 0.5 0.5显色反应1min后于423nm波长（1cm光径），读OD值，5min之内读数准确。
* 样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。
**溶血液0.1－0.4mL组织上清液1:20稀释，取稀释液0.4mL注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
1.3.6.2.3.4 计算鼠全血GSH-Px活力单位规定每1mL全血，每分钟，扣除非酶反应的log[GSH]降低后，使log[GSH]降低1为一个酶活力单位。
非酶管log[GSH]-样品管log[GSH]鼠全血GSH-Px活力单位（U/mL全血）= ────────────────3min×0.004mLlog[非酶管OD－空白管OD]-log[样品管OD-空白管OD]= ────────────────────────3min×0.004mL组织GSH-Px比活力单位规定每毫克蛋白质，每分钟，扣除非酶反应，使GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。
（非酶管OD－样品管OD）×A**×5组织GSH-Px比活力单位（U/mg蛋白）= ───────────────────3min×样品蛋白质的mg数* * Folin法或双缩脲法测样品蛋白质含量标准GSH浓度（μmol/L）** A= ───────────即标准曲线斜率。
标准GSH光密度（OD）1.3.6.2.4 注意事项1.3.6.2.4.1 由于H2O2易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮备液3mL，测定1cm光径的240nm处OD值。
OD浓度（mmol/L）＝————————0.036（消光系数）若OD值为0.45，则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。
1.3.6.2.4.2 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关，还受反应时间限制。
加入显色剂后，反应体系pH为6.5时，11min开始显色，此时比色5min 内读数准确。
1.3.7抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH）测定谷胱甘肽是一种低分子清除剂，它可清除O2-、H2O2、LOOH。
谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种三肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，是GSH-PX和GST两种酶类的底物，为这两种酶分解氢过氧化物所必需，它能稳定含巯基的酶，和防止血红蛋白及其它辅助因子受氧化损伤，缺乏或耗竭GSH会促使许多化学物质或环境因素产生中毒作用，GSH量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。
1.3.7.1血或组织中还原型谷胱甘肽（GSH）测定方法1.3.7.1.1原理GSH-和5，5'-二硫对硝基甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基甲酸阴离子，于420nm波长有最吸收峰，测定该离子浓度，即可计算GSH的含量。
1.3.7.1.2仪器和试剂仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器试剂：0.9％生理盐水4％磺基水杨酸溶液0.1mol/L PBS溶液（pH=8.0）：称取Na2HPO4 13.452g，KH2PO4 0.722g，加蒸馏水至1000mL。
0.004％DTNB溶液：称取DTNB 40mg溶于1000mL的0.1mol/L PBS溶液（pH=8.0）中。
叠氮纳缓冲液：NaN316.25 mgEDTA-Na27.44 mgNa2HPO4 1.732 gNaH2PO4 1.076 g加蒸馏水至1000mL，用少量HCl、NaOH调pH7.0，4℃保存。
标准溶液：称取还原型GSH 15.4mg，加叠氮纳缓冲液至50mL，终浓度为1mmol/L，临用前配制。
1.3.7.1.3 实验步骤1.3.7.1.3.1 样品制备：溶血液上清液：取0.1mL抗凝全血加双蒸水0.9mL（1：9溶血液），充分混匀，直至透亮为止。
取溶血液0.5mL加4%磺基水杨酸0.5mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。
血清上清液：取0.1mL血清加4%磺基水杨酸0.1mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。
组织上清液：取组织0.5g加生理盐水4.5mL充分研磨成细浆（10%肝匀浆），混匀后取浆液0.5mL加4%磺基水杨酸0.5mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。
1.3.7.1.3.2 样品测定：溶血液或组织样品测定：测定管空白管上清液0.5mL －4%磺基水杨酸－0.5mLDTNB 4.5mL 4.5mL 混匀，室温放置10 分钟后，420nm处测定吸光度。
血清样品测定：测定管空白管上清液0.1mL －4%磺基水杨酸－0.1mLDTNB 0.9mL 0.9mL 混匀，室温放置10 分钟后，420nm处测定吸光度。
注：该指标检测，需新鲜样品取材后当天完成。
用双缩脲法测定血清（或溶血液）、组织匀浆蛋白质含量。
如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
1.3.7.1.3.3 标准曲线取1mmol/L GSH标准溶液0、10、20、50、100、150、200µL,分别加入生理盐水至0.5mL，即得到0、20、40、100、200、300、400µmol/L的GSH标准液系列，各管加入DTNB4.5mL，混匀，室温放置10 分钟后，空白管调零，420nm处测定吸光度。
以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。
1 2 3 4 5 6 71mmol/L GSH（mL）0 0.01 0.02 0.05 0.10 0.15 0.20生理盐水（mL）0.50 0.49 0.48 0.45 0.40 0.35 0.30DTNB（mL） 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 GSH量（μmol/L）0 20 40 100 200 300 4001.3.7.1.3.4 计算样品GSH含量= 对应曲线浓度值（μmol/L）×溶血液稀释倍数×上清液稀释倍数（μmol /L全血）= 对应曲线浓度值（μmol/L）×10×2样品GSH含量= 对应曲线浓度值（μmol/L）×上清液稀释倍数（μmol /L血清）= 对应曲线浓度值（μmol/L）×2样品GSH含量= 对应曲线浓度值（μmol/L）×上清液稀释倍数÷上清液组织含量（μmol /g组织）= 对应曲线浓度值（μmol/L）×2÷100g组织/L样品GSH含量= 对应曲线浓度值（μmol/L）×上清液稀释倍数÷上清液蛋白含量（μmol /gprot）= 对应曲线浓度值（μmol/L）×2÷匀浆gprot/L1.4数据处理与结果判定1.4.1数据处理一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。