农杆菌转化步骤

1.micro-tom 种子的处理：

①75%乙醇侵泡种子：30s，这一步时间不宜过长。

②10% Naclo 消毒20min，无菌水清洗4-5次，最后一次浸泡半小时。

③处理完的种子放到萌发培养基上（MS固体培养基），24±1℃黑暗培养6天，转入光照

条件下4-7天，等待长出子叶。

2.农杆菌转染

①三种培养基的配制：

无抗性的生芽培养基：1/2MS + 2mg/l 6-BA + l IBA

抗性生芽培养基：1/2MS + 2mg/l 6-BA + l IBA + 10mg/L Hyg + 250mg/L羧苄

抗性生根培养基：1/2MS + l IBA + 10mg/L Hyg + 250mg/L羧苄

②农杆菌的处理

A：转基因的农杆菌，200ul加入20mlLB液体培养基中，并加入10ul （25ug/ml）kana 和20ul（ml）Ref，28℃过夜培养24小时

B：取过夜培养的农杆菌200ul于20mlLB培养基中，不加入任何抗生素，加入10ul AS （100umol/L），28℃摇菌8小时，直到OD600=左右

C：取无菌苗子叶，横切，放入菌液侵染15min，无菌纸吸干残留菌液，近轴面朝下，放在无抗性的生芽培养基，暗培养2天

D：2天后取出，放入抗性培养基中，筛选培养。

E：待长出不定芽，再转入抗性的生根培养基，待生根

F：炼苗，移栽

农杆菌浓度在OD600值最好，侵染15min效果最好。Hyg的浓度10mg/L最好。AS：100umol/L。羧苄初期抑菌的浓度一般200-300mg/L。