重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定解析

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

实验目的：

1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性

核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。

3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外

DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。

4. 掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。

5. 学习掌握热击法转化 E.coli的原理和方法。

6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段

的大小。

7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：

外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经

限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。

1. 重组子的构建

酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一

的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方

法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目

的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性

内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片