生物技术大实验
生物技术大实验陆挺王大慧汪成富
苏州大学生命科学学院
二零零七年六月
前言
脂类被广泛地定义为能溶于有机溶剂的一类生物分子【1】。甘油脂类是指主链中含有甘油的脂类。主要的甘油脂类包括三酰基甘油和各种磷脂。由脂肪酸和甘油组成的三酰基甘油可在动物的脂肪组织，植物种子或果实中大量储藏。脂肪酸是三酰基甘油的主要成分，其作为能量被储存在三酰基甘油中。虽然在肝脏和肠内也发现三酰基甘油，但是发现它们主要存在脂肪组织中。
磷酸甘油酯(简称磷脂)，是另一种含有磷酸基的甘油脂类。这类脂类的共同特点是它们都是具有亲水性和疏水性的兼性分子，水解以后都产生磷酸和脂肪酸。可见，脂肪酸也是磷脂的主要成分。在真核和原核细胞的生物膜（包括细胞膜，细胞器膜）中，磷脂是主要的结构脂类。磷脂双层可构成两相界面，是各种分子的通透性屏障。磷脂组成的变化对细胞膜的流动性，膜蛋白的活性等细胞生理功能由重要的调节的作用。【2】
溶血磷脂是一类重要的磷脂。其中，溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid ,LPA）是目前已知的结构最简单的甘油磷脂。它的系统命名为1或2－脂酰－甘油－3－磷酸（1 or 2-acyl sn-glycerol-3-phosphate）。
溶血磷脂酸在体内的信号转导途径中起着重要的作用，被称为多功能“磷脂信使”。通过活化特定的G蛋白受体，LPA调控着多种细胞反应，如有丝分裂的发生、细胞粘附、细胞骨架重排、离子转运、细胞分化、平滑肌收缩以及细胞调亡等等【3】。LPA存在于多种生物体体液中，如血清、血浆、眼球的水状体等。多种类型的细胞均可产生LPA，并通过自分泌或旁分泌的形式释放到细胞外影响靶细胞的功能。机体可由如下途径释放LPA：1）血小板在凝血酶刺激激活后可迅速产生和释放LPA；2）哺乳类的成纤维细胞在肽类生长因子刺激下可迅速产生LPA并释放到细胞外间质；3）人的脂肪细胞可产生LPA，并刺激前脂肪细胞的增殖[4]；4）在卵巢癌患者的腹水及血浆中可检测到增高的LPA[5]，其来源尚不清楚，但有可能是肿瘤细胞产生的；5）某些炎症细胞、内皮细胞、神经细胞及受损的细胞也可产生LPA[6]
多方面研究表明，LPA的产生同多种病生理状态密切相关。LPA是促使肿瘤细胞生长和浸润的一个强有力的因子[7，8]，它在包括癌症、肥胖以及动脉硬化等疾病中起着重要的作用，近年来，越来越多的证据显示LPA与人卵巢癌及其他人恶性肿瘤的病理生理学关系密切[9，10]。当前，LPA已经被用作卵巢癌检测的一个重要的分子指标[10，11]。
虽然LPA被广泛认作是一种类似于生长因子的磷脂分子，但是在早期的研究中，LPA是作为生物膜的一种成分以及脂类生物合成的代谢中间体为人们所认识。
肝脏和脂肪组织是合成三酰基甘油最活跃的组织。其反应如下：
3磷酸甘油
↓
溶血磷脂酸
↓
磷脂酸
↓
甘油二酯
↓
甘油三酯
LPA转化成的PA是所有甘油酯类的前体物质[13]。作为脂类生物合成的代谢中间体之一，PA同时也参加与磷脂信号转导，在细胞活化和有丝分裂期间表达量能够快速上调[14，15]。
LPA转化成PA的反应是磷脂合成的第二步反应，这步反应有溶血磷脂酸脂酰基转移酶（LPAAT）所催化。LPAAT被发现存在于微粒体以及质膜上[16]，能被白细胞介素-1引发的磷酸化作用所调控[16，17]。在内质网上，LPA以非常高的速度被LPAAT转化成PA。
通过经典遗传学方法或者序列同源比较的方法，已经从多种非乳动物和哺乳动物中得到了编码LPAAT的基因。生物信息学的发展大大促使了在人类中进行LPAAT基因的克隆，迄今为止，已经报导了不少LPAAT基因。在这当中，有多个研究小组是同时报到了这方面的研究工作[18，19，20，21]。
在本次大实验中，我们的主要工作就是对小鼠的LPAAT基因进行克隆和小鼠LPAAT-EGFPN融合蛋白的表达。
材料与方法
1.材料
1.1 PCR引物：由上海生工生物工程有限公司合成。
特异性引物： mLPAAT-F 5- ACCATGTTCCTGTTGCTACCTTTTG-3
mLPAAT-R 5- GGAGGCTCAGGACCGGCT-3
带酶切位点的引物：
mLPAAT－EGFPN-XhoⅠ-F 5- GGCCTCGAGATGTTCCTGTTGCTACCTTTTGA -3 mLPAAT－EGFPN-BamHⅠ-R 5- TTTGGATCCAAGGACCGGCTGCGGTCCTCATG -3 表达载体和宿主菌
1.2.1 载体pEGFP-N1
图1. pEGFP-N1表达载体图谱
1.2.2 克隆菌株： DH5α菌株，表达菌株：BL21 菌株
1.3 基因克隆相关分子生物学实验材料
1.3.1 λDNA Hind III/EcoR I双酶切DNA标准分子量
1.3.2 PCR产物纯化试剂盒
1.3.3 限制性内切酶
1.3.4 DNA连接酶
1.3.5 凝胶回收纯化试剂盒
1.3.6 质粒抽提试剂盒
1.3.7 DNA测序试剂盒：采用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction
1.3.8 克隆用的人脑cDNA文库和人胎脑cDNA文库
1.4 实验试剂
1.4.1LB培养基
多聚蛋白胨10.0 g
酵母抽提物 5.0 g
NaCl 10.0 g
O定容至1000 ml
加ddH
2
灭菌条件为121℃，高压湿热灭菌20 min；
1.4.2 蛋白分析
1.4.
2.1 SDS-PAGE胶配方：
12%分离胶 5%浓缩胶
H
O 3.4 ml 3.675 ml
2
30%Gel 4 ml 0.65 ml
Tris-HCL 2.5 ml (1.5M,pH8.8) 0.625 ml (1.0M,PH6.8)
10%SDS 100μl 50μl
10%APS 50μl 25μl
TEMED 5μl 5μl
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
10ml 5ml
1.4.
2.2 5×Tris-Gly电泳缓冲液：
15.1g Tris碱，94g Gly，50ml 10% SDS，加水至1L
1.4.
2.3 2×SDS-PAGE上样缓冲液：
2.0ml 0.5M Tris-HCL， 2.0ml甘油，2.0ml 20%（W/V）SDS，0.5ml 0.1%
（W/V）溴酚蓝，1.0ml β-巯基乙醇，2.5ml ddH
O
2
1.4.
2.4 SDS-PAGE染色液：
90ml 甲醇：水（1：1，V/V）；10ml冰乙酸；0.25g考马斯亮蓝R250 1.4.2.5 SDS-PAGE脱色液
90ml 甲醇：水（1：1，V/V）；10ml冰乙酸
1.4.
2.6 异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）
2 主要仪器设备
2.1 PCR扩增仪：PTC-200
2.2 Suprafuge 22型高速冷冻离心机
2.3 TGL-16台式离心机
2.4 ABI377型全自动DNA测序电泳仪
2.5 MODEL4001型DNA测序电泳仪
2.6 MODEL SA型DNA测序电泳槽
2.7 凝胶成像系统
2.8 HZ-C型台式恒温振荡器
2.9 电脉冲仪
2.10 微量加样器：1000 μl/200 μl/20 μl
3 国际生物学信息途径：
3.1 国际NCBI（Nation Center for Biotechnology Information）
非重复数据库(Non-redundant Database)
BLASTN: https://www.360docs.net/doc/702147983.html,/blastn/nr/
BLASTP: https://www.360docs.net/doc/702147983.html,/blastp/nr/
3.2 核酸及蛋白质序列分析软件：
Protscale ( https://www.360docs.net/doc/702147983.html,/cgi-bin/protscale.pl/ )
CLUSTALW ( https://www.360docs.net/doc/702147983.html,/clustalw/ )
3.3蛋白质分析软件包
Vector NTI
4实验方法
技术路线和实验方案
设计引物
↓
扩增mLPAAT特异的片段
↓
构建原核表达载体
↓
载体转化感受态细菌
↓
抽质粒鉴定
↓
质粒转化BL21
↓
融合蛋白的诱导表达
↓
融合蛋白的纯化
↓
蛋白质的检测分析
4.2 PCR体系：
25 μM 引物mLPAAT up 0.5 μl
25 μM 引物mLPAAT down 0.5 μl
10×Taq buffer 2.5 μl
1.0 μl
25 mM MgCl
2
20 mM dNTP 0.5 μl
模板质粒DNA 0.5 μl
Taq DNA聚合酶0.5 μl
ddH
O补充至总体积25 μl
2
PCR条件：
95℃ 5 min 1 cycle
95℃
60℃30cycle
72℃
72℃10 min 1 cycle
4.2.1 PCR产物回收
采用凝胶回收纯化试剂盒
4.2.2 载体的构建
4.2.2.1 运用相应限制性内切酶双酶切载体pEGFP-N1，纯化并定量。
反应体系：pEGFP-N1 6 μl
10× buffer 2 μl
BamH I 1 μl
Xho I 1 μl
ddH
O补充至20 μl
2
反应条件：37 ℃ 4 h
4.2.2.2 mLPAAT片段的酶切
运用相应限制性内切酶双酶切PCR产物，纯化并定量。
反应体系：PCR产物12 μl
10× buffer 4 μl
BamH I 2 μl
Xho I 2 μl
O补充至40 μl
ddH
2
反应条件：37 ℃ 4 h
4.2.3酶切产物与pEGFP-N1载体标准连接体系（standard reaction）及条件：
连接体系：酶切MLPAAT片段PCR产物5μl
酶切pEGFP-N1载体 1.5 μl
连接酶buffer 1.0 μl
10×T
4
连接酶（5 Unit/μl） 1.0 μl
T
4
O补充至15.0 μl
ddH
2
连接条件：4℃连接过夜
4.2.4 以连接产物转化DH5α感受态菌株
4.2.4.1 DH5α感受态菌株的制备
a. 从于 37℃培养16-20小时的新鲜平板上挑取一个单克隆DH5α菌落（直
径2-3mm ），转到一个含有5ml试管中。于37℃剧烈振摇培养过夜（旋
转摇床，250转/min ）。
b. 从过夜的LB中吸取1 ml加入到100 ml LB的烧瓶中。于37℃剧烈振摇
培养2-2.5小时（旋转摇床，300转/min）。
c. 培养物冰上放置10 min，转移到50ml 无菌离心管中，4100 rpm 4℃
10 min。
d. 倒出培养液，将管倒置1 min 以使最后残留的痕量培养液流尽。
重悬每份沉淀，放置于冰上10 min。
e. 以 10 ml用冰预冷的0.1 mol/ L CaCl
2
f. 于4℃以 5000 rpm 离心 10 min，以回收细胞。
g. 倒出培养液，将管倒置1 min 以使最后残留的痕量培养液流尽。
（含有10%
h. 每50 ml初始培养物用 2 ml 用冰预冷的0.1 mol/ L CaCl
2
甘油）
重悬每份细胞沉淀。
i. 用冷却的无菌吸头从DH5α感受态细胞悬液中各取100μl转移到无菌的
微量离心管中。
j. 将制备的DH5α感受态菌放置于-70 ℃保存。
4.2.4.2 转化DH5α感受态菌
a. 取出一管DH5α感受态菌，置于冰上，加入5μl连接产物，轻轻混
内容物，在冰上放置1-2 min。
b. 将管放到预加温到42℃的循环水浴中，恰恰放置90s，不要摇动试管。
c. 速将管转移到冰上，使细胞冷却1-2 min。
d. 600μl LB培养基加入管中，在冰上放置10 min。
e. 37℃水浴1 h，5000 rpm 离心 10 min。
f. 吸取多余的培养基，在管中留下100-150μl的培养基，混匀细胞，涂
布LB-Amp平板，将平板置于室温直至液体被吸收。
g. 倒置平皿，于37℃培养，12-16 h 后可出现菌落。
4.2.5煮菌验证
4.2.
5.1从平板上挑30个克隆划线到30个区域，37℃，倒置培养8小时以上。
4.2.
5.2各挑取30个克隆的适量菌至EP中，加20 ul无菌水，100℃，10 min,离心12，000 rpm，5 min。
4.2.
5.3从离心上清中各取10 ul，作为模板DNA，进行常规PCR反应。
4.2.
5.4 PCR产物各取5 ul,进行凝胶电泳。
4.2.
5.5根据阳性条带，确定阳性克隆的编号。
4.2.6 接菌，摇菌
4.2.7 抽质粒采用质粒抽提试剂盒
a.将binding buffer（绿盖）置于冰上
b.沉菌（5000 rpm，3～4 min），用250 ul suspension buffer（白盖）重悬菌，振荡器振荡，将沉淀打散，混匀。
c.加250ul lysis buffer（红盖），轻轻混匀，室温放置5min。
d.加350ul预冷的binding buffer，上下颠倒（柔和混匀）tube 5次，置于冰上10 min。
e.13000g离心10 min。
f.取上清于High pure filter管中，套入收集管（上柱），13000g离心30～60秒，滤出液重新倒入柱中，重复操作一次。
g.弃滤出液，加500ul wash bufferⅠ（黑盖），13000g离心30～60秒。
h.弃滤出液，加700ul wash bufferⅡ（蓝盖），13000g离心30～60秒。
i.弃滤出液，再空离心一次，13000g离心30～60秒，以除尽剩余wash buffer，若仍有酒精，置于桌上倒置1min，使酒精挥发。
j.卸收集管，套新的1.5ml eppendorf管，加30ul ddH
O（或solution
2
buffer（无色盖）或TE）静置5min，13000g离心60～90秒。
k.取2ul电泳，鉴定，定量，剩下的-20℃保存待用。
4.2.8 酶切鉴定
酶切体系同 4.2.2
4.2.8.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定
4.2.9 目的克隆片段的测序验证
为进一步验证pEGFP-N1载体中的目的克隆片段，运用pEGFP-N1载体测序引物对目的克隆测序。所用仪器为ABI377全自动测序仪(Perkin-Elmer Applied Biosystems Foster City, CA, USA)。
4.3 质粒转化BL21（方法同4.2.4.2）
4.4 EGFP-mLPAAT融合蛋白高表达菌株的筛选。
4.4.1 从平板上各挑取10个含pEGFP-N1-mLPAAT质粒的E.Coli BL21菌落接种5 ml的含抗生素的LB培养液中。
4.4.2 37℃ 250 rpm，16小时。
4.4.3 取100ul种子液，分别转接到10个5 ml LB培养液中（含抗生素），37。
>0.6。
培养3小时，至OD
600
4.4.4 加入IPTG至终浓度0.5 mM，37℃，250 rpm,培养4小时。
4.4.5 各样品5,000 rpm，10分钟，去上清，加入20 ul 2*SDS上样缓冲液，-20℃保存。
4.4.6 所有样品进行SDS-PAGE电泳。
a. 电泳缓冲液的配制
b. 配胶，分离胶与成层胶的配制
c. 电泳，先80V，15min；后150V，1h
4.4.7 考马斯亮蓝R250凝胶染色。
4.4.8 脱色液脱色。
4.4.9 根据目的融合蛋白的表达量，确定最高量表达菌株，对应编号，将该菌株加入30%甘油，-80℃保种。
4.5 EGFP-mLPAAT的最佳诱导时间的确定。
4.5.1 从-80℃冰箱冻存的高表达菌株接种至LB培养液中37℃，250rpm，16小时。
>0.6。
4.5.2 取100ul种子液转接至5ml LB培养液中，37℃，3小时，OD
600
4.5.3 加入IPTG终浓度0.5mM，25℃，250 rpm，0h,3h,6h,9h,12h,15h分别取样200ul。
4.5.4 各样品处理同4.4.5-4.4.8。
4.5.5 根据各时间点融合蛋白的表达量，确定诱导表达的最佳时间。
4.6 EGFP-mLPAAT融合蛋白的大量表达纯化。
4.6.1 取-80℃保存高表达菌种接种至10 ml LB培养液中，37℃，250 rpm，16小时。
>0.6。
4.6.2 转接至1 L LB培养液中37℃，250 rpm，3小时，至OD
600
4.6.3 25℃，250 rpm，12小时。
4.6.4 5,000 rpm，10分钟，收集菌体。
4.6.5 加入40 ml PBS（含有100 mg溶菌酶，0.1% Triton-100，25 ng/ml PMSF）重悬细菌，冰浴中超声破菌。
4.6.6 12，000 rpm，30分钟，4℃，收集上清，备上柱。取上清，沉淀加入2*SDS 样品缓冲液，-20℃保存。
4.6.7 预处理层析柱，PBS平衡20倍柱体积，以0.5 ml/min速度上样，PBS以1 ml/min速度洗脱未结合蛋白。
4.6.8 洗脱下的目的蛋白，以PBS，4℃透析过夜。
4.6.9 取15 ul目的蛋白加2*SDS样品缓冲液。
4.6.10 SDS凝胶电泳（同4.4.6-4.4.8）
思考与讨论
1．讨论mLPAAT的生物学功能？
2．论述融合蛋白在原核细胞内表达的优越性？
3．试述你对构建EGFP-mLPAAT重组质粒的理解？
4．融合蛋白在大肠杆菌系统内的表达形式及其优缺点？5．谈谈你参加生物技术大实验后的体会与感想？
附表：
1、mLPAAT 基因序列CDS：479~1849
ORIGIN：
1 tgcaggctgt cgccncgatt aggctatgtc gaccacgccc tcgcaggatc ttcgtggcac 61 caaggcgatc tcttcttggt acttctgaca atacagatct ttagggacaa atttacccgc 121 tgaatgcttt ggggcaggag gaaagtaaaa ccttggaagc agccacatag ctgaacagaa 181 agctgcccct tgccgctcgc ttgcccggac actcaggact caggtgctgt tccagcctac 241 tcaccacaga ttgtcatctg tgcccgggag actggcattt ctggggtgct cctgtgaccc 301 ttctgcagtt ctgcgccaga gctctattca ggcagttgga tgacatgaac tttgagatgg 361 agttgtcacc cgtgagggac tggctgcctt tccaaggctt gtgctatctg aagggaccat 421 ctgaaggacg tgtttgtgtg tggaaaagag ggcaccagcc tgacgtgcgt cctcc acc at 481 gttcctgttg ctaccttttg atagcttgat tgtcaacctc ctgggtatct ccctgaccgt 541 cctcttcacc ctgctgcttg ttttcatcat cgtccctgcc atctttggag tgtcctttgg 601 tatccgaaag ctctacatga aaacactgct aaagatcttt gcgtgggcca ccctgagaat 661 ggagagagga gccaaggaga ggaaccacca gctgtacaag ccctacacca acggaatcat 721 tgcaaaagat cccacttctc tggaagaaga aatcaaagaa attcgtcgaa gtggtagtag 781 taaagctctg gataagacac ccgagttcga gctctctgac atcttctact tttgccggaa 841 aggaatggag actatcatgg atgatgaagt gacaaagaga ttctcggcag aggagctgga 901 gtcctggaac ttgctgagca gaaccaatta caacttccaa tacataagcc tgcggcttac 961 catcctctgg ggcttaggag tgctgattcg gtattgcttc ctcctgccac tcaggattgc 1021 gctggcattc acggggattg gcctcttggt agtgggaact actatggttg gatacctgcc 1081 aaatgggaga tttaaggagt ttttgagtaa acacgttcac ttaatgtgct accgtatctg 1141 tgtgcgagcc ctgacggcca tcattacgta ccacaacagg aaaaacagac caagaaatgg 1201 tggcatctgt gtggctaacc atacatcccc cattgatgtg atcatcttgg ccagcgacgg 1261 ctactacgcc atggtgggac aggttcacgg gggccttatg ggtgtgattc agagagcaat 1321 ggtgaaagcc tgcccccatg tctggtttga gcgttctgag gtgaaagatc gccacctggt 1381 ggctaagagg ctgactgagc atgtccagga taaaagcaag ctgcccatcc tcatcttccc 1441 agaaggaacc tgcatcaata acacatcagt gatgatgttc aagaagggaa gctttgaaat 1501 tggagccact gtttaccctg tggctatcaa gtatgaccct cagtttggtg acgccttctg 1561 gaacagcagc aagtatggca tggtgacgta ccttctgagg atgatgacca gttgggccat 1621 tgtctgcagc gtttggtacc tgcctcctat gactcgagag aaagatgaag atgctgtgca 1681 gtttgctaac agagtgaagt ctgccattgc ccggcaggga ggattggtag acctgctgtg 1741 ggacggtgga ttgaagagag aaaaggtgaa ggacacattc aaggaggagc agcagaagct 1801 atatagcaag atgatagtcg gaaaccatga ggaccgc agc cggtcctga g cctcc gtctt 1861 gtgctggctg aagcgccacc tctaaatcct gaagtgtgag ccagctgcag ttgttgctgc 1921 cacagcctct accgtcatcc ccgccagcca ctgctgcatc cttccggact ctggccctca 1981 ggctgttctg gactccagga ctggagctgc gtcagagctc cgtgggctgc ctgctgtcct 2041 ctaaccagaa tgcttctggc tggggctccc tgggacaaaa tgcctcttgt tcttatagta 2101 agcctctaag aggaatggca gtggagcagt tctagctggt gaaaaggtgg gccctgttct 2161 tgccctgaga ggatgttagg tgtttctgta gaaacagcca tatgctggta aagtcggaaa 2221 agacactgca gaggccggtg cctaaacagc ctccagctta gcgcttgaga tgtggcagaa
2281 aggactgtct gcaggagtgc tcacgtcctc cagcgagtgg agtcctaagt ccctgtgttc
2341 ctgcttatga agatcaccag aggagatagg aagagccagt gggctcctgg gcagttagct
2401 agccccaggc tgagcctgaa tcccccacat gacttgttta atatgtctca gtttccctgt
2461 ctgttccatg gaattgcgga gagagatggc ggtgtgccta cctcacaggg ttgttgtggg
2521 gattccagtg ctagtgcgtg tgaaggaaat gtgtgctgct ctcccaggga cagcttcaga
2581 gagcgtggca ggacaaggtc agagctacag ctgctgccca ggattttaaa attgtttgtg
2641 agtaaataaa actggatggt aaatgaaaaa aaaaaaaaaa aa
2、融合蛋白的预测：（简单预测为：EGFP+mLPAAT）
EGFP：
Length : 239
Molecular weight : 26.941 kDa
序列：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDA TYGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDT LVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQL ADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDEL Y K
mLPAA T：
Length : 456
Molecular weight : 52.181 kDa
序列：
MFLLLPFDSLIVNLLGISLTVLFTLLLVFIIVPAIFGVSFGIRKL YMKTLLKIFAWATLRMERG AKERNHQL YKPYTNGIIAKDPTSLEEEIKEIRRSGSSKALDKTPEFELSDIFYFCRKGMETIM DDEVTKRFSAEELESWNLLSRTNYNFQYISLRLTILWGLGVLIRYCFLLPLRIALAFTGIGLL VVGTTMVGYLPNGRFKEFLSKHVHLMCYRICVRALTAIITYHNRKNRPRNGGICV ANHTS PIDVIILASDGYYAMVGQVHGGLMGVIQRAMVKACPHVWFERSEVKDRHLV AKRLTEHV QDKSKLPILIFPEGTCINNTSVMMFKKGSFEIGATVYPV AIKYDPQFGDAFWNSSKYGMVT YLLRMMTSW AIVCSVWYLPPMTREKDEDA VQFANRVKSAIARQGGLVDLLWDGGLKRE KVKDTFKEEQQKL YSKMIVGNHEDRSRS
参考文献
1.[美] 杰弗里·佐贝主编。《生物化学》复旦大学出版社，1989年5月第1 版
2.沈同，王镜岩主编。《生物化学》高等教育出版社，1991年第二版
3.Mooleanaar WH.(1995) Lysophosphatic acid ,a multifunctional phospholipid messenger,
J Biol Chem Jum 2 ;270(22) : 12949-52
4.Valet P,Pages C,Jeanneton O,Daviaud D,Barbe P,Record M,Saulnier-Blache
JS,Lafontan,M.(1998) Alpha2-adrenergic receptor-mediated release of lysophosphatic acid by adipocytes. A paracrine signal for preadipocyte growth .J Clin Invest Apr1; 101
(7) :1431-8
5.Xu Y,Shen Z,Wiper Dw,Wu M,Morton RE,Elson P,Kennedy AW,Belinson J,Markman
M,Casey G.(1998) Lysophosphatic acid as a potential biomarker for ovarian and other gynecologic cancers.JAMA Aug 26; 280(8):719-23
6.江波，江林涌，周汉良，磷脂酸和溶血磷脂酸的生理功能。生理科学进展
2002年第33卷02期：159-162
7.Imamura F,Horai T, Mukai M,Shinkai K, Sawada M,Akedo H.(1993) Induction of in vitro
tumor cell invasion of cellular monolayers by lysophosphatidic acid or phospholipase D.
Biochem Biophys Res Commun Jun 15;193(2):497-503
8.Xu Y ,fang Xj,Casey G,Mills GB.(1995) Lysophospholipids activate ovarian and breast
cancer cells .Biochem J Aug 1; 309(Pt 3):933-40
9.Fishman DA,Liu Y,Ellerbroek SmM,Stack Ms.(2001) Lysophosphatidic acid promotes
matrix metalloproteinase(NMP) activation and NMP-dependent invasion in ovarian cancer cells. Cancer Res Apr1;61(7):3194-9
10.Budnik LT,Mukhopadhyay AK.(2002) Lysophosphatidic acid and its role in
reproduction .Biol Reprod Apr1;66(4):859-65
https://www.360docs.net/doc/702147983.html,ls GB,Eder A,Fang X,Hasegawa Y,Mao M,Lu Y,Tanyi J,Tabassam FH,Wienei
J,Lapushin R,Yu S,Parrott JA,Compton T,Tribley W,Fishman D, Stack MS,Gaudette D,Jaffe R,Furui T,Aoki J, Erickson JR.(2002) Critical role of lysophaspholipids in the pathophysiology, diagnosis, and management of ovatian cancer .Cancer Treat Res;107:259-83
12.伍云，溶血磷脂酸——多功能信使。国外医学·生理.病理科学与临床分册2002年第
22卷03期：242-244
13.Kent C.(1995) Eukaryotic phospholipid biosynthesis. Annu Rev
Biochem;64:315-343
14.Brindly DN,Waggoner DW.(1996) Phosphatidate phosphohydrolase and singal
transduction.Chem Phys Lipids May 24;80(1-2):45-57
15.English D,Cui Y,Siddiqui RA.(1996) Messenger functions of phosphatidic
acid .Chem Phys Lipids May 24;80(1-2):117-32
16.Bursten SL,Harris WE,Bomsztyk K,Lovett D.(1991) Interleukin-1 rapidly
stimulates lysophosphatidate acyltransferase and phosphatidate phosphohydrolase activities in human mesangial cells.J Biol Chem Nov 5;266(31):20732-43
17.Soling HD,Fest W,Schmidt T,Esselman H,BachmannV.(1989) Signal transmission
in exocrine cells is associated with rapid activity changes od acyltransferases and diacylglycerol kinase due to reversible protein phosphorylation.J Biol Chem Jun 25;264(18):10643-8
18.Aguado B,Cambell RD.(1998) Characterizationn of a human lysophosphatidic acid
acyltranserase that is encoded by a gene located in the class Ⅲ region of human major histocompatibility complex. J Biol Chem Feb 13;273(7):4096-105 19.Eberhardt C,Gray PW,Tjoelker LW.(1997) Human lysophosphatidic acid acyltransferase.
CDNA cloning, expression, and localization to chromosome 9q34.3 J Biol Chem Aug 8;272(32):20299-305
20.Stamps AC,Elmore MA,Hill ME,Kelly K,Makda,AA Finnen MJ.(1997) A human cDNA
sequence with homology to non-mamalian lysophosphatidic acid acyltransferases.Biochem J 1997 Sep 1;326(Pt 2):455-61
21.West J,Tompkins CK,Balantac N,Nudelman E,Meengs B,White T,Bursten S,Coleman
J,Kumar A,Singer JW,Leung DW,(1997) Cloning and expression of two human lysophosphatidic acid acyltransferase cDNAs that enchance cytokine-induced signaling responses in cells. DNA Cell Biol Jun;16(6):691-701
生物技术综合大实验
2013-2014学年生命科学综合大实验GFP分离与纯化
1.文献综述 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）是由238个氨基酸组成，分子量是26.9kDa，最初是从维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria )中分离出来的，在蓝光照射下会发出绿色荧光。来源于水母的野生型GFP在395nm和475nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509nm，处于可见光谱的绿色区域，来源于海肾的GFP只在498nm有单个激发峰。 GFP是典型的β桶形结构，包含β折叠α和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着荧光基团，防止它被周围环境淬灭，内部面向桶形的侧链诱Ser65-Tyr66-Gly67三肽环化，导致荧光基团形成。 北京时间10月8日下午5点45分，2008年诺贝尔化学奖揭晓，三位美国科学家，美国Woods Hole海洋生物学实验室的Osamu Shimomura(下村修)、哥伦比亚大学的Martin Chalfie和加州大学圣地
亚哥分校的Roger Y.Tsien（钱永健）因发现并发展了绿色荧光蛋白（GFP）而获得该奖项。 下修村首次从Aequorea victoria中分离出GFP。他发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要成就在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白质和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为了现实。
1生物学实验常用技术
生物学实验常用技术一、分子方面 1、基因工程 1)PCR (Polymerase Chain Reaction) (二楼PCR仪器全部会用) 2)RT-PCR;Q-PCR 3)琼脂糖凝胶电泳;胶回收 4)酶切/链接 5)转化 6)固体/液体LB培养基配制 (高压蒸汽灭菌锅使用方法) 7)质粒大/小抽原理及步骤 (手提、溶液I、II、III作用) 8)基因组DNA抽提 9)RNA提取; 2、蛋白质工程 1)蛋白收集 (蛋白裂解液+PMSF; 1×Loading 裂解(推荐)) 2)SDS-PAGE(电泳胶的配制) 2)考马斯亮蓝染色,银染 3)Western blot 4)蛋白定量常用的方法及原理, 以及熟练操作Bradford法蛋 白定量 (TRIZOL法原理、注意事项及步骤) 二、细胞方面 1)细胞培养、传代 2)细胞冻存与复苏 冻存液配制: (1)DMSO:血清=1:9(推荐)
(2)DMSO:培养基:血清=1:3:6 均可 DMSO为细胞专用型;现用现配,效果最好;冻存时细胞在-80℃中不要超过一周,最好在24-48h内放入液氮罐中保存。 3)细胞培养基配制(过滤除菌)、胰酶配制(过滤除菌),PBS配制(灭菌);(不同培养基的区别;谷氨酰胺(提供氮源),2周补充一次) 4)转染 5)MTT原理及操作(检测细胞存活率或死亡率) 6)碱性磷酸酶实验(ALP,检测细胞分化) (5、6 需学会SPSS软件及graphpad prism5软件使用) 7)Hoechst染色 8)结晶紫染色(不推荐) 9)苏木精/伊红染色 (9可以替代8,以后实验推荐使用9,图片漂亮) 10)荧光显微镜的使用 11)激光共聚焦显微镜样品制备(细胞固定,染色,洗脱) (7、8、9、10、11需学会Photoshop常用工具处理数据) 12)流式细胞仪样品制备(包括:转染效率与细胞凋亡染色标记)以及仪器操作(需学会FlowJo软件分析流式结果) 三、动物实验 1)小鼠的定制: 常见的小鼠: ICR小鼠(正常),9元/只
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
生物技术大实验考试复习题
生物技术大实验 一、核酸凝胶电泳的基本原理是什么？ （1）核酸分子糖—磷酸骨架中的磷酸集团，呈负离子化状态；核酸分子在一定电场强度的电场中，他们会向正极移动。 （2）电泳中使用无反应活性的稳定支持介质，电泳迁移率与与分子摩擦系数成反比。物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下分离出不同分子量大小或相同分子量而构型有差异的核酸分子。 二、CTAB法提取植物总DNA中CTAB的中文名称及其作用原理是什么？ CTAB的全称是十六烷基三甲基溴化铵 基因组DNA的提取包括组织粉碎，细胞膜破坏，蛋白质去除和DNA的沉淀.一般取植物的幼嫩组织，其DNA含量丰富，组织易于破碎。组织破碎方法有很多种，可以研磨，捣碎机捣碎，超低温冷冻使组织细胞间结冰，稍加研磨即可以粉碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。DNA提取缓冲液主要是由对DNA有稳定作用的盐如Tris,EDTA和破坏细胞的试剂SDS或者CTAB组成。蛋白质的去除是用苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇或无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，之后用RNase处理去除少量的RNA，即得植物总DNA溶液。 三、SDS-PAGE电泳的基本原理是什么？ SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，SDS能断裂分子内和分子间氢键，使蛋白变性，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 用SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白质的分子量和纯度。在4%浓缩胶和12%分离胶上，以标准分子量蛋白（Protein Marker,High 29-205 kDa）为对照，电泳分离。经考马斯亮蓝-R250染色和脱色液脱色后，比较样品与标准分子量蛋白的迁移率，确定蛋白质的分子量及酶制剂纯度。 四、RNA提取过程中的注意事项有哪些？ RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。 注意事项 1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml 是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。 2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
生物技术专业介绍
生物技术专业介绍 生物技术专业是于2000年设立并正式开始招生，经过多年的建设，现已成为学校的优势专业，是山东省特色专业，又是山东省应用型特色名校工程重点建设专业。 一、人才培养目标 培养德、智、体、美全面发展，系统掌握农业生物技术的基本理论、基本知识、基本技能，具有较强的自主学习能力、实践能力、创新能力，能够支撑现代农业生物技术产业体系，服务于山东区域经济社会发展的高素质应用型人才。 二、特色和优势 1. 构建了一支高学历、教学经验丰富、科研能力强的一支师资队伍。本专业现有专职教师70人，其中正高职称22人、副高职称28人，讲师20人，高级职称教师占71.4%；具有博士学位的教师57人，占专职教师的81.4%；具有国外学习和研修经历的19人；泰山学者海外特聘专家3人、山东省教学名师2人、国务院特殊津贴获得者1人、“留学回国人员成就奖” 获得者1人、博士生导师4人。 2. 具有生物学科特色。本专业具有植物学、动物学、微生物学、生理学、遗传学等多学科支撑，以及生物化学与分子生物学省级重点学科支撑，生物学科特色鲜明。我们在生物技术专业的建设中，以厚基础，宽口径为前提，在课程体系与教学内容上力求突出自身的学科优势，形成专业特色，培养高素质应用型生物技术专业人才。 3. 以科研促教学，提高人才培养质量。（1）通过科研，提高教师自身素质，为提高教学质量提供了重要保证；（2）科研促进了教学条件的建设。在投资1000多万购置实验仪器的基础上，目前又新组建了科研用组培室与炼苗室各1间及教学用组培室与炼苗室各1间，极大充实了教学条件；（3）科研充实了教学内容。通过科研，提高教师学术水平，把新知识、新观点及时充实到教学中，激发学生对学科的兴趣，切实提高教学质量；（4）科研培养学生动手能力、创新思维。本专业于2003年率先在全校实施了“本科生导师制”制度，使学生从大二开始进入实验室，参与教师的科研活动，独立设计试验并完成科研任务，切实提高学生独立操作能力及创新能力。 三、学科建设 本专业为山东省特色专业，先后获得生物化学与分子生物学、遗传学、植物
《生物制药技术》实验指导-实验三、四
《生物制药技术》实验指导 实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型） 实验目的： 掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。 实验原理： 层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。 分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。 薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。 材料、试剂和器材： 仪器和设备： 玻璃层析缸；层析板（薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售）；吹风机；紫外投射仪；离心机（1.5ml转子） 试剂：
生物技术应用中心实验室建设方案
生物制药技术中心实验室 建 设 方 案 为进一步提高实验实训教学质量的水平，推进实验实训教学的改革和建设，贯彻落实教育部关于实验室工作“巩固、深化、提高、发展”的要求，引入有效的竞争激
励机制，充分调动实验技术人员的积极性和创造性，构建高水平的实验技术平台，特制定本建设方案。 一、建设背景与目标 2006年12月学院为了适应21世生物应用技术人才的培养和资源共享理念的需要，在学校高校中率先对管理体制进行改革，成立了详详细细学院实验实训中心，将原生物科学系中心实验室更名为生物技术应用中心实验室并隶属该实验实训中心管理。 生物技术应用中心实验室下设化学、生物化学、畜牧业生产技术应用、生物化学制药与检测技术、园艺技术应用、食品营养与检测技术、生物技术应用等6大类18 个实验室，承担我院生物制药、食品营养与检测、畜牧兽医、园林和园艺5个专业、多层次的生物技术实验教学任务。并利用该中心实验室，开展了食品检验工、花卉工、园艺工、动物疫病防治员、动物检验检疫员、药物分析工和药物制剂工的职业技能培训与鉴定工作。每年接纳学生约2000人，年均总实验人时数在109500万左右。 中心实验室累计投入170万元购置了一大批先进教学仪器设备，增强了实验教学手段，改善了教学环境，提高了实验技术水平，为培养适应21世纪国家建设与社会 发展需要的、具有高技能、高素质创新、实践性生物技术人才创造条件，提供良好的实验教学技术平台。 中心实验室形成了独立设课与管理的运转模式。各实验室由生物技术应用中心实验室实行统一管理和调配，仪器设备共享，全面负责生物科学系各专业专业基础、专业课的实验教学和各专业的职业技能鉴定培训与鉴定工作。同时，不断增加从事实验教学的高职称、高学历的教师，优化实验教学体系、调整实验内容，学生通过实验课程的学习获得了良好的技能训练，他们的动手能力，创新思维，综合技能能得到显著提高。 通过院系的共同建设和发展，先后取得了具有积极示范推广意义的科技成果，即xxx省科技进步三等奖和xxx市科技进步二等奖。在理论与实践教学改革中勇于探索 和创新，获xxx省教学成果一等奖。突出的实验教学改革成果促进了畜牧兽医专业精品课程的建设(《xxxx》和《xxxx》于2004年和2006年分获省级精品课程)。本中心设施齐全先进、实验教学团队优秀、管理体制规范高效、环境人文安全，实验教学成绩显著，2004年和2006年度被评为xx省优秀实验室。经过多年的改革与建设，生 物技术应用中心实验将向海南省实验教学示范中心的目标迈进。
本科生六个基本生物学实验
实验一：感受态细胞的制备 1.原理： 当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则需要该技术进行细菌的转化，以大量获得这一质粒。转化细菌的方式有很多种，如电转化法、脂质体转染法、显微注射法、CaCl2处理法制备感受态细胞等。一般的实验室都应用CaCl2处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒DNA能穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可在抗菌素培养基上生长形成菌落。这一方法是分子生物学常用实验方法。 2.实验材料 2.1LB液体培养基 2.20.1mol/L CaCl2溶液：称取1.1g无水CaCl2，溶于90ml双蒸去离子水中， 定容至100ml，用0.22μm滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4℃保存。 2.3 DH5α菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml离心管，枪头（以上需灭菌）； 移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，普通冰箱，-70℃冰箱 3.操作方法 3.1从37℃培养12—16h的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到含有3ml LB培养基的试管内，37℃振摇过夜。次日取菌液1ml，接种到含有100ml LB培养基的500 ml烧瓶中，37℃剧烈振摇培养约2—3h（振摇速度为200—300r/min），待OD600值达到0.3—0.4时，将烧瓶取出立即置冰浴10—15min。 3.2自该步骤起皆需无菌操作。在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的、冰预冷的50 ml离心管中。 3.34℃离心，4000g×5min回收细胞。 3.4弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。 3.5加入冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。 3.64℃离心，4000g×5min,弃去上清液，倒置于滤纸1min。 3.7再加4ml用冰预冷的0.1mol CaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。 3.8置4℃冰箱置12—24h，即可应用于转化。 思考题： 制备感受态细胞时加入CaCl2的作用是什么？ 钙离子结合于细胞膜上，使细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，细胞膜的通透性发生变化，使外源DNA进入。
生物技术实验解析
实验一酵母细胞的固定化 1.实验目的 掌握酵母细胞的固定化方法。 2.原理 利用固定包埋法将酵母物细胞用物理的方法包埋在载体之中。这种方法既操作简单，又不会明显影响生物活性，是比较理想的方法，目前应用最多。其理想的固定化载体应是应对微生物无毒性，传质性能好，性质稳定，不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、光硬化性树脂、聚乙烯醇等。 3.试剂和仪器设备 鲜酵母、海藻酸钠、无水氯化钙，烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计 4.实验步骤 （1）称取海藻酸钠0.75g于100mL烧杯中，加25mL蒸馏水搅匀，在沸水浴中溶胀15min，得A液。 （2）取一个50mL烧杯，加入鲜酵母5g和25 mL馏水，搅匀，得B液。 （3）待A液冷却后，将B液与A液混合，用尼龙布过滤，得C液。 （4）称取2.2g无水CaCl2，溶解于200 mL蒸馏水中。 （5）用注射器带7号平针头将C液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞，固化30min，过滤、洗涤，称重。 5.实验数据及其处理 记录固定化酵母细胞的质量。 固定化酵母细胞的质量为：0.75g 6.问题讨论 如何验证固定化酵母细胞的催化能力？ (1)观察制作的凝胶珠的颜色和形状 如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定化的酵母细胞数目较少。如果形成的凝胶珠不是圆形或者椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败。 （2）观察发酵的葡萄糖溶液 利用固定酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生很多气泡，同时会闻到酒味。 （3）检查凝胶的黏性和弹性。
西北农林科技大学-生物技术综合大实验
生物技术综合大实验——原核系统表达的 绿色荧光蛋白的纯化 宋捷（69）纪成功孔令浩王玉康王鹏程董奉新 （西北农林科技大学） 摘要：绿色荧光蛋白（GFP）的提纯是一套十分成熟的蛋白质提纯系统，本教学实验使用原核的大肠杆菌系统，通过转化带有GFP基因的原核表达载体到BL21表达菌株中，通过氨苄抗性筛选，用阿拉伯糖诱导表达。通过硫酸铵盐析，疏水层析，阴离子交换柱层析，凝胶过滤层析，各级纯化用紫外显色和SDS凝胶电泳检测，终末纯化后纯度较高。本实验较为成功的提取提纯了GFP，并较好训练蛋白质提纯技术。 关键词：GFP 蛋白提纯疏水层析离子交换层析凝胶过滤层析 — 1.介绍：GFP最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发 现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。分子质量约为27kd，有238各氨基酸基团］，三维结构为β圆柱，圆柱两端由一些较短的α螺旋盖住，圆柱中央是几段α螺旋，生色团位于圆柱中央。该结构性质稳定。本实验通过该分子的较为稳定，疏水特性，易电离成阳离子，分子较小的体征，选择盐析，疏水层析，阴离子交换层析，凝胶过滤层析逐级提纯GFP。 2.材料和方法 2.1.pGFP质粒克隆及提取 质粒是已经构建完成的，GFP基因表达由易受阿拉伯糖诱导的启动子控制，及常表达的氨苄抗性。碱裂解法（试剂实验室自配）提取。取1ml菌液于离心管，1000rpm离心30s，弃上清——加入100μl提质粒溶液I，震荡混匀——加入200μl溶液II，温和混匀置至于冰上5min——加入150μl溶液III，混匀，置于冰上5min——1000rpm 离心3min，转移上清于另一新离心管，加入900μl无水乙醇，混匀，室温静置3min ——12000rpm离心5min，弃上清，待其干燥——于30μl TE中溶解，冰上暂存。 2.2.转化 取 OD600 ~ BL21，冰浴30min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2——悬浮沉淀，冰浴15min——4000rpm离心10min，弃上清——加入200μl CaCl2悬浮沉淀，备用。取1μl质粒DNA加入制备好的感受态细胞，温和混匀，置于冰上30min——42°C水浴锅，热击45-60s——冰浴10min——加入900μl LB培养基，37°C，150rpm震荡培养30min——涂板（LBp/ara），37°C温育过夜。 2.3.筛选重组子及扩大培养 <
生物实验技术专业个人简历模板原创
……………………….…………………………………………………………………………………姓名：杜宗飞专业：生物实验技术专业 院校：浙江大学学历：本科……………………….…………………………………………………………………………………手机：×××E – mail：×××地址：浙江大学
自荐信 尊敬的领导： 您好！今天我怀着对人生事业的追求，怀着激动的心情向您毛遂自荐，希望您在百忙之中给予我片刻的关注。 我是生物实验技术专业的2014届毕业生。大学四年的熏陶，让我形成了严谨求学的态度、稳重踏实的作风；同时激烈的竞争让我敢于不断挑战自己，形成了积极向上的人生态度和生活理想。 在大学四年里，我积极参加生物实验技术专业学科相关的竞赛，并获得过多次奖项。在各占学科竞赛中我养成了求真务实、努力拼搏的精神，并在实践中，加强自己的创新能力和实际操作动手能力。 在大学就读期间，刻苦进取，兢兢业业，每个学期成绩能名列前茅。特别是在生物实验技术专业必修课都力求达到90分以上。在平时，自学一些关于本专业相关知识，并在实践中锻炼自己。在工作上，我担任生物实验技术01班班级班长、学习委员、协会部长等职务，从中锻炼自己的社会工作能力。 我的座右铭是“我相信执着不一定能感动上苍，但坚持一定能创出奇迹”！求学的艰辛磨砺出我坚韧的品质，不断的努力造就我扎实的知识，传统的熏陶塑造我朴实的作风，青春的朝气赋予我满怀的激情。手捧菲薄求职之书，心怀自信诚挚之念，期待贵单位给我一个机会，我会倍加珍惜。 下页是我的个人履历表，期待面谈。希望贵单位能够接纳我，让我有机会成为你们大家庭当中的一员，我将尽我最大的努力为贵单位发挥应有的水平与才能。 此致 敬礼！ 自荐人：××× 2014年11月12日 唯图设计因为专业，所 以精美。为您的求职锦上添花，Word 版欢迎 下载。
关于生物技术综合实验报告
关于生物技术综合实验报告生物技术综合实验 甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达 学生：学号： 同实验者： 谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH 的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。 实验一甘薯叶片RNA提取 一、实验目的 1. 了解真核生物RNA提取的原理； 2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。 二、实验原理 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，
核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。 三、实验材料 1. 材料 甘薯叶片，品种为徐薯18 2. 试剂 ①无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌； ② Trizol试剂； ③氯仿； ④异丙醇、75％乙醇； ⑤ TBE缓冲液； ⑥上样缓冲液 3. 仪器
分子生物学实验技术实验内容
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer
《生物技术综合实验》教学大纲
《生物技术综合实验》实验课程教学大纲 课程名称(中文) 生物技术综合实验 课程名称(英文) Comprehensive Experiments of Biotechnology 课程编号33101105 课程类型专业必修课 教材名称《生物技术综合实验指南》（陆勇军等）自编教材 是否独立设课是√否 学时学分:总学时 108 总学分 3 实验学时108实验学分3 开出时间：四年级第十学期 适用专业生物技术专业、生物技术及应用专业、逸仙班 先修课程《生物化学》、《生物技术学》、《微生物学》、《遗传学》 备注：课程类型分为公共必修课、公共选修课、专业必修课、专业选修课 一、课程简介及基本要求 本课程是一门综合性实验课程。要求学生在掌握生物化学、生物技术学、微生物学和生物化学技术原理等的基础上，学习和掌握生物技术实验的基本原理和技术，主要包括基因工程常规操作（如从生物材料中提取功能基因、再把该基因克隆到载体DNA上。然后转化至细菌或酵母中进行表达等）技术及一系列生物大分子的提取（包括从微生物、动物或植物材料中提取）、分离、纯化的方法和技术。了解并掌握各种常规生化仪器及发酵器材的使用和保养；培养和训练学生具有良好的科研素质、有较强的分析问题和解决问题的能力，为今后独立从事生物技术及相关学科领域的研究奠定基础。 二、课程目的及要求 1.通过实验综合运用各门理论课相关知识，并加深理解。 2.培养学生实事求是的科学品德、团结合作的科学工作精神、善于思考和分析、解 决问题的能力，全面提升他们的科研素质，为今后独立从事生物技术及相关学科 领域的研究奠定基础。 3.要求学生课前做好预习，熟悉每个单元实验的原理和方法，也可根据自己的理解 和兴趣，设计相关研究实验。
2020年(生物科技行业)生化及分子生物学大实验
（生物科技行业）生化及分子生物学大实验
实验20质粒DNA的提取和鉴定 教学内容提要及时间分配： 1、实验原理讲解：8分钟 碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA和质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。在pH值高达12.6的碱性环境中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的俩条链不会完全分离。当用pH 值4.8的KAc或NaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中；而线状染色体DNA则不能复性，形成缠绕的网状物,通过离心，染色体DNA和不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物壹起沉淀下来而被除去，用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒DNA沉淀，再用RNase除去RNA，即可获得较纯净的质粒DNA。 2、实验试剂和器材6分钟 溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。 溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS（从10%SDS
母液中稀释，SDS母液可室温保存），现配现用。 溶液Ⅲ：5mol/LKAc60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL，高压灭菌，4℃冰箱保存。溶液终浓度为:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。 3mol/L醋酸钠(pH5.2)：800mL水中溶解408.1gNaAc·3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100mL，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。 STE缓冲液：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。 TE缓冲液：10mmo/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。 3、实验步骤讲解：6分钟 将含有质粒pGFPuv的DH5α菌种划线接种在LB固体培养基（含有100μg/mL Amp）上，37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mLLB液体培养基(含有100μg/mL Amp)中，37℃振荡培养14~16小时。 取1.5mL培养液加入1.5mL离心管中，室温12,000r/min离心1分钟。 加入500μLSTE，涡旋打匀，室温12,000r/min离心1分钟。 弃上清，将管倒置于纸巾，使液体流尽。 加入100μL溶液Ⅰ重悬菌体，涡旋振荡，冰浴5分钟。 加入新配制的溶液Ⅱ200μL，盖紧管口，快速轻柔颠倒5次，至溶液澄清(千万不要振荡)，冰浴5分钟。 加入150μL预冷的溶液Ⅲ，盖紧，管口朝下，轻柔振荡5~10次，冰浴5~10分钟，12,000r/min离心10分钟。 取上清移入干净Eppendorf管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，剧烈振荡20秒。
《生物技术大实验》试题
2011级生物化学与分子生物学专业硕士研究生 《生物技术大实验》期末考试 1、请介绍第三代核酸测序技术。 答: 第三代核酸测序技术的基本原理:基于纳米孔的单分子读取技术，英国牛津纳米孔公司成功研发出第三代基因测序技术。该测序技术读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景。 当前，基因测序工作费时且昂贵，测序时，分子必须进行多次复制(这一步被称为扩增)，同时进行荧光示踪标记，这一过程会带来错误，因此，一个基因要被测序多次才能得到值得信赖的结果。此外，购买和操作测序仪器的费用也不菲，目前，测定一个完整的基因组需要上万美元。 在纳米孔测序技术中，DNA分子依靠被称为核酸外切酶的蛋白质以一次一个碱基的速度通过小孔。这个酶能清楚地区分出4个DNA碱基编码：A、C、G、T，也可以检测出该碱基是否被甲基化，一个单孔能在大约70天左右测定一个完整的基因序列。 第三代核酸测序技术优点:纳米孔技术不需要荧光标记物并且很可能不需要进行扩增，能直接并快速“读”出DNA，同时足够廉价，使进行大量重复实验成为可能。纳米孔公司已经研发出包含几百个纳米孔的芯片，该芯片可以用在一台机器上，快速且廉价地给大量DNA进行排序。 基因测序于上世纪70年代由弗雷德-桑格尔发明，他因此获得了诺贝尔奖，第一份人类基因草图于2001年绘制成功，花费了40亿美元。 第三代核酸测序技术展望:纳米孔公司总裁戈登-桑赫纳说，该技术预示了基因测序领域的一个跳跃变化，花费不到1000美元就可以完成一个基因测序。借助该技术，在未来5年内，测序费用将有可能降至500美元。到那时，基因测序可以成为英国国民健康保险制度的一部分，民营保险公司也支付得起。该技术也可以让医生使用DNA 来预测并且预防诸如心脏病、糖尿病等疾病，更加有效地开药。 世界著名基因测序公司Illumina的总裁杰伊-弗拉特利称，10年后，每一个新生婴儿都会被“配备”完整的基因排序，费用不超过5000美元。
《生物制药技术》实验
《生物制药技术》实验指导 实验一金霉素链霉菌培养基的制备（验证型） 实验目的： 1、学会培养基的配制 2、掌握灭菌方法。 实验原理： 金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦称“金色链霉菌”，放线菌门(Actinobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。在固体培养基上产生金色色素，故名。其菌落为草帽型, 菌落直径一般为3～5毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。菌落开始为白色，长孢子后变青色。在显微镜下可以看到短杆状的菌丝。抗菌素工业上用以生产金霉素。 放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。放线菌在土壤中分布最多，大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。放线菌大都好氧，属于化能异养，菌丝纤细，分枝，常从一个中心向周围辐射生长。因其生长具辐射状，故名放线菌。放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认是真菌。但其菌落较小而致密，不易挑取。不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用，可产生抗菌素，现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种，其中，有50多种抗生素已经广泛地得到应用，如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病；有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶；有的用于农业生产，如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。 四环素类抗生素是由链霉菌生产或经半合成制取的一类广谱抗生素。抗菌谱极广，包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。品种主要包括金霉素、四环素和土霉素。 器材： 1ml移液枪；铝锅；电炉 试剂： NaBr母液（100 g／L） KCl母液（100 g／L） M-促进剂母液（2.5 g／L） 实验步骤： 1．种子培养基 种子培养基(g／L)：可溶性淀粉40，黄豆饼粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO34，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。 先称取黄豆饼粉20g，单独煮沸10分钟，加入少量凉水降温，4层纱布压榨取汁，与其它称好的各成分混合，定容至1L。 每50ml分装到250ml三角瓶中，每组2瓶。 2．定向发酵培养基
生物技术实验报告
生物技术实验报告 篇一：生物技术实验报告 组别：第六组 组员：苏琳伟、陈治、陈家和、陈硅 报告人：陈硅 学号：10349069 词汇&释义： Parafilm 封口膜 Chloroform 氯仿（三氯甲烷） Isopropanol 异丙醇 DEPC 焦碳酸二乙酯 TRIZOLa mono-phasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate Phenol苯酚 isthiocyanate 异硫氰酸胍 MCS multiple cloning site （polycloning site） 注：MSC是DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有
多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 实验任务： 1. 从猪肌肉纤维中提取RNA; 2. 2对RNA上EGFP基因密码子片段进行RT-PCR扩增; 3. 将经RT-PCR技术扩增的cDNA与插入载体质粒，并将其转化入大肠杆菌进行克隆； 4. 从大肠杆菌中提取含目的基因的载体质粒。 实验目的: 1.掌握提取纯化总RNA的原理和技术； 2.掌握RT-PCR原理和技术； 3.掌握TA克隆原理和技术。 实验原理： A．总RNA提取和纯化 RNA 分离的最关键因素是尽量减少RNA 酶的污染。但RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA 酶外，环境中也存在大量RNA 酶。因此在提取RNA 时，应尽量创造一个无RNA 酶的环境，包括去除外源性RNA 酶污染和抑制内源性RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去
除外源性RNA 酶，通过RNA 酶的阻抑蛋白Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA 酶。 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，是一种由苯酚和异硫氰酸胍组成的单相溶液它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品最大使用量（1ml Trizol），动物组织( 50mg)，植物组织(100 mg)，丝状真菌( 100mg)，动物细胞(5×106～1×107)，酵母(1×107) 。 TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA 的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA 条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其
生物化学实验技术复习重点汇编详细
前言 1.本课程主要讲述了哪些实验技术，其中被称为生化实验室中三大实验技术的是？ 答：层析技术、电泳技术、离心技术、分光光度技术、免疫化学技术。其中层析技术、电泳技术、离心技术是生物学的三大实验技术。 第一章生物化学基本操作与要求 1.洗涤液的种类配置与应用 答：（1）铬酸洗液（称取5g重铬酸钾粉末置于250mL烧杯中，加水5mL，尽量使其溶解，慢慢加入浓硫酸100mL，边加边搅拌。冷却后贮存备用，若颜色变绿，表示洗液已失效。）用于洗涤玻璃器皿。（2）浓盐酸，洗去水垢或某些无机盐沉淀。（3）30%硝酸，洗涤CO2 测定仪器及微量滴管（4）45%尿素，洗涤蛋白制剂、血样（5）有机溶剂，洗涤油脂、脂溶性染料（6）去污粉，一般污染物 2.化学试剂的分级 答： 3.什么是准确度、精密度？ 答：准确度表示实验分析测量值与真实值相接近的程度。误差。精密度是指在相同条件下多次测量结果互相吻合的程度，表现了测定结果的再现性。偏差。 4.如何提高实验的准确度、精密度？ 答：准确度：减少系统误差1.仪器校正2.空白试验3.对照实验；精密度：减少偶然误差 1.平均取样 2.多次取样。 第二章层析技术 1.层析技术及其原理 答：层析技术是一种基于被分离物质的物理、化学、生物学特性的不同，使它们在某种机制中移动速度不同而进行分离和分析的方法。 2.名词：固定相、流动相、分配系数 答：固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等）也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等。 分配系数：是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量的比值， Kd=固定相中的总量/流动相中的总量。 3.层析法的分类 答：按流动相的形式分：气相色谱法1.气固色谱法2.气液色谱法，液相色谱法1.液固色谱法2.液液色谱法；按固定相的形式分：1.柱层析法2.纸层析法3.薄层层析法。 4.几种主要凝胶的中英文名称、型号、及型号数字代表的含义 答：葡萄糖凝胶（dextran型号Sephadex G-10~200数字代表凝胶的吸水率） 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide主要型号有Bio-Gel P-2~300,数字代表它们的排阻极限的10-3）琼脂糖凝胶（agarose Sepharose,Bio-Gel A）