生物技术大实验

生物技术大实验陆挺王大慧汪成富
苏州大学生命科学学院
二零零七年六月
前言
脂类被广泛地定义为能溶于有机溶剂的一类生物分子【1】。

甘油脂类是指主链中含有甘油的脂类。

主要的甘油脂类包括三酰基甘油和各种磷脂。

由脂肪酸和甘油组成的三酰基甘油可在动物的脂肪组织，植物种子或果实中大量储藏。

脂肪酸是三酰基甘油的主要成分，其作为能量被储存在三酰基甘油中。

虽然在肝脏和肠内也发现三酰基甘油，但是发现它们主要存在脂肪组织中。

磷酸甘油酯(简称磷脂)，是另一种含有磷酸基的甘油脂类。

这类脂类的共同特点是它们都是具有亲水性和疏水性的兼性分子，水解以后都产生磷酸和脂肪酸。

可见，脂肪酸也是磷脂的主要成分。

在真核和原核细胞的生物膜（包括细胞膜，细胞器膜）中，磷脂是主要的结构脂类。

磷脂双层可构成两相界面，是各种分子的通透性屏障。

磷脂组成的变化对细胞膜的流动性，膜蛋白的活性等细胞生理功能由重要的调节的作用。

【2】
溶血磷脂是一类重要的磷脂。

其中，溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid ,LPA）是目前已知的结构最简单的甘油磷脂。

它的系统命名为1或2－脂酰－甘油－3－磷酸（1 or 2-acyl sn-glycerol-3-phosphate）。

溶血磷脂酸在体内的信号转导途径中起着重要的作用，被称为多功能“磷脂信使”。

通过活化特定的G蛋白受体，LPA调控着多种细胞反应，如有丝分裂的发生、细胞粘附、细胞骨架重排、离子转运、细胞分化、平滑肌收缩以及细胞调亡等等【3】。

LPA存在于多种生物体体液中，如血清、血浆、眼球的水状体等。

多种类型的细胞均可产生LPA，并通过自分泌或旁分泌的形式释放到细胞外影响靶细胞的功能。

机体可由如下途径释放LPA：1）血小板在凝血酶刺激激活后可迅速产生和释放LPA；2）哺乳类的成纤维细胞在肽类生长因子刺激下可迅速产生LPA并释放到细胞外间质；3）人的脂肪细胞可产生LPA，并刺激前脂肪细胞的增殖[4]；4）在卵巢癌患者的腹水及血浆中可检测到增高的LPA[5]，其来源尚不清楚，但有可能是肿瘤细胞产生的；5）某些炎症细胞、内皮细胞、神经细胞及受损的细胞也可产生LPA[6]
多方面研究表明，LPA的产生同多种病生理状态密切相关。

LPA是促使肿瘤细胞生长和浸润的一个强有力的因子[7，8]，它在包括癌症、肥胖以及动脉硬化等疾病中起着重要的作用，近年来，越来越多的证据显示LPA与人卵巢癌及其他人恶性肿瘤的病理生理学关系密切[9，10]。

当前，LPA已经被用作卵巢癌检测的一个重要的分子指标[10，11]。

虽然LPA被广泛认作是一种类似于生长因子的磷脂分子，但是在早期的研究中，LPA是作为生物膜的一种成分以及脂类生物合成的代谢中间体为人们所认识。

肝脏和脂肪组织是合成三酰基甘油最活跃的组织。

其反应如下：
3磷酸甘油
↓
溶血磷脂酸
↓
磷脂酸
↓
甘油二酯
↓
甘油三酯
LPA转化成的PA是所有甘油酯类的前体物质[13]。

作为脂类生物合成的代谢中间体之一，PA同时也参加与磷脂信号转导，在细胞活化和有丝分裂期间表达量能够快速上调[14，15]。

LPA转化成PA的反应是磷脂合成的第二步反应，这步反应有溶血磷脂酸脂酰基转移酶（LPAAT）所催化。

LPAAT被发现存在于微粒体以及质膜上[16]，能被白细胞介素-1引发的磷酸化作用所调控[16，17]。

在内质网上，LPA以非常高的速度被LPAAT转化成PA。

通过经典遗传学方法或者序列同源比较的方法，已经从多种非乳动物和哺乳动物中得到了编码LPAAT的基因。

生物信息学的发展大大促使了在人类中进行LPAAT基因的克隆，迄今为止，已经报导了不少LPAAT基因。

在这当中，有多个研究小组是同时报到了这方面的研究工作[18，19，20，21]。

在本次大实验中，我们的主要工作就是对小鼠的LPAAT基因进行克隆和小鼠LPAAT-EGFPN融合蛋白的表达。

材料与方法
1.材料
1.1 PCR引物：由上海生工生物工程有限公司合成。

特异性引物： mLPAAT-F 5- ACCATGTTCCTGTTGCTACCTTTTG-3
mLPAAT-R 5- GGAGGCTCAGGACCGGCT-3
带酶切位点的引物：
mLPAAT－EGFPN-XhoⅠ-F 5- GGCCTCGAGATGTTCCTGTTGCTACCTTTTGA -3 mLPAAT－EGFPN-BamHⅠ-R 5- TTTGGATCCAAGGACCGGCTGCGGTCCTCATG -3 表达载体和宿主菌
1.2.1 载体pEGFP-N1
图1. pEGFP-N1表达载体图谱
1.2.2 克隆菌株： DH5α菌株，表达菌株：BL21 菌株
1.3 基因克隆相关分子生物学实验材料
1.3.1 λDNA Hind III/EcoR I双酶切DNA标准分子量
1.3.2 PCR产物纯化试剂盒
1.3.3 限制性内切酶
1.3.4 DNA连接酶
1.3.5 凝胶回收纯化试剂盒
1.3.6 质粒抽提试剂盒
1.3.7 DNA测序试剂盒：采用BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready
Reaction
1.3.8 克隆用的人脑cDNA文库和人胎脑cDNA文库
1.4 实验试剂
1.4.1LB培养基
多聚蛋白胨10.0 g
酵母抽提物 5.0 g
NaCl 10.0 g
O定容至1000 ml
加ddH
2
灭菌条件为121℃，高压湿热灭菌20 min；
1.4.2 蛋白分析
1.4.
2.1 SDS-PAGE胶配方：
12%分离胶 5%浓缩胶
H
O 3.4 ml 3.675 ml
2
30%Gel 4 ml 0.65 ml
Tris-HCL 2.5 ml (1.5M,pH8.8) 0.625 ml (1.0M,PH6.8)
10%SDS 100μl 50μl
10%APS 50μl 25μl
TEMED 5μl 5μl
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
10ml 5ml
1.4.
2.2 5×Tris-Gly电泳缓冲液：
15.1g Tris碱，94g Gly，50ml 10% SDS，加水至1L
1.4.
2.3 2×SDS-PAGE上样缓冲液：
2.0ml 0.5M Tris-HCL， 2.0ml甘油，2.0ml 20%（W/V）SDS，0.5ml 0.1%
（W/V）溴酚蓝，1.0ml β-巯基乙醇，2.5ml ddH
O
2
1.4.
2.4 SDS-PAGE染色液：
90ml 甲醇：水（1：1，V/V）；10ml冰乙酸；0.25g考马斯亮蓝R250 1.4.2.5 SDS-PAGE脱色液
90ml 甲醇：水（1：1，V/V）；10ml冰乙酸
1.4.
2.6 异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）
2 主要仪器设备
2.1 PCR扩增仪：PTC-200
2.2 Suprafuge 22型高速冷冻离心机
2.3 TGL-16台式离心机
2.4 ABI377型全自动DNA测序电泳仪
2.5 MODEL4001型DNA测序电泳仪
2.6 MODEL SA型DNA测序电泳槽
2.7 凝胶成像系统
2.8 HZ-C型台式恒温振荡器
2.9 电脉冲仪
2.10 微量加样器：1000 μl/200 μl/20 μl
3 国际生物学信息途径：
3.1 国际NCBI（Nation Center for Biotechnology Information）
非重复数据库(Non-redundant Database)
BLASTN: /blastn/nr/
BLASTP: /blastp/nr/
3.2 核酸及蛋白质序列分析软件：
Protscale ( /cgi-bin/protscale.pl/ )
CLUSTALW ( /clustalw/ )
3.3蛋白质分析软件包
Vector NTI
4实验方法
技术路线和实验方案
设计引物
↓
扩增mLPAAT特异的片段
↓
构建原核表达载体
↓
载体转化感受态细菌
↓
抽质粒鉴定
↓
质粒转化BL21
↓
融合蛋白的诱导表达
↓
融合蛋白的纯化
↓
蛋白质的检测分析
4.2 PCR体系：
25 μM 引物mLPAAT up 0.5 μl
25 μM 引物mLPAAT down 0.5 μl
10×Taq buffer 2.5 μl
1.0 μl
25 mM MgCl
2
20 mM dNTP 0.5 μl
模板质粒DNA 0.5 μl
Taq DNA聚合酶0.5 μl
ddH
O补充至总体积25 μl
2
PCR条件：
95℃ 5 min 1 cycle
95℃
60℃30cycle
72℃
72℃10 min 1 cycle
4.2.1 PCR产物回收
采用凝胶回收纯化试剂盒
4.2.2 载体的构建
4.2.2.1 运用相应限制性内切酶双酶切载体pEGFP-N1，纯化并定量。

反应体系：pEGFP-N1 6 μl
10× buffer 2 μl
BamH I 1 μl
Xho I 1 μl
ddH
O补充至20 μl
2
反应条件：37 ℃ 4 h
4.2.2.2 mLPAAT片段的酶切
运用相应限制性内切酶双酶切PCR产物，纯化并定量。

反应体系：PCR产物12 μl
10× buffer 4 μl
BamH I 2 μl
Xho I 2 μl
O补充至40 μl
ddH
2
反应条件：37 ℃ 4 h
4.2.3酶切产物与pEGFP-N1载体标准连接体系（standard reaction）及条件：
连接体系：酶切MLPAAT片段PCR产物5μl
酶切pEGFP-N1载体 1.5 μl
连接酶buffer 1.0 μl
10×T
4
连接酶（5 Unit/μl） 1.0 μl
T
4
O补充至15.0 μl
ddH
2
连接条件：4℃连接过夜
4.2.4 以连接产物转化DH5α感受态菌株
4.2.4.1 DH5α感受态菌株的制备
a. 从于 37℃培养16-20小时的新鲜平板上挑取一个单克隆DH5α菌落（直
径2-3mm ），转到一个含有5ml试管中。

于37℃剧烈振摇培养过夜（旋
转摇床，250转/min ）。

b. 从过夜的LB中吸取1 ml加入到100 ml LB的烧瓶中。

于37℃剧烈振摇
培养2-2.5小时（旋转摇床，300转/min）。

c. 培养物冰上放置10 min，转移到50ml 无菌离心管中，4100 rpm 4℃
10 min。

d. 倒出培养液，将管倒置1 min 以使最后残留的痕量培养液流尽。

重悬每份沉淀，放置于冰上10 min。

e. 以 10 ml用冰预冷的0.1 mol/ L CaCl
2
f. 于4℃以 5000 rpm 离心 10 min，以回收细胞。

g. 倒出培养液，将管倒置1 min 以使最后残留的痕量培养液流尽。

（含有10%
h. 每50 ml初始培养物用 2 ml 用冰预冷的0.1 mol/ L CaCl
2
甘油）
重悬每份细胞沉淀。

i. 用冷却的无菌吸头从DH5α感受态细胞悬液中各取100μl转移到无菌的
微量离心管中。

j. 将制备的DH5α感受态菌放置于-70 ℃保存。

4.2.4.2 转化DH5α感受态菌
a. 取出一管DH5α感受态菌，置于冰上，加入5μl连接产物，轻轻混
内容物，在冰上放置1-2 min。

b. 将管放到预加温到42℃的循环水浴中，恰恰放置90s，不要摇动试管。

c. 速将管转移到冰上，使细胞冷却1-2 min。

d. 600μl LB培养基加入管中，在冰上放置10 min。

e. 37℃水浴1 h，5000 rpm 离心 10 min。

f. 吸取多余的培养基，在管中留下100-150μl的培养基，混匀细胞，涂
布LB-Amp平板，将平板置于室温直至液体被吸收。

g. 倒置平皿，于37℃培养，12-16 h 后可出现菌落。

4.2.5煮菌验证
4.2.
5.1从平板上挑30个克隆划线到30个区域，37℃，倒置培养8小时以上。

4.2.
5.2各挑取30个克隆的适量菌至EP中，加20 ul无菌水，100℃，10 min,离心12，000 rpm，5 min。

4.2.
5.3从离心上清中各取10 ul，作为模板DNA，进行常规PCR反应。

4.2.
5.4 PCR产物各取5 ul,进行凝胶电泳。

4.2.
5.5根据阳性条带，确定阳性克隆的编号。

4.2.6 接菌，摇菌
4.2.7 抽质粒采用质粒抽提试剂盒
a.将binding buffer（绿盖）置于冰上
b.沉菌（5000 rpm，3～4 min），用250 ul suspension buffer（白盖）重悬菌，振荡器振荡，将沉淀打散，混匀。

c.加250ul lysis buffer（红盖），轻轻混匀，室温放置5min。

d.加350ul预冷的binding buffer，上下颠倒（柔和混匀）tube 5次，置于冰上10 min。

e.13000g离心10 min。

f.取上清于High pure filter管中，套入收集管（上柱），13000g离心30～60秒，滤出液重新倒入柱中，重复操作一次。

g.弃滤出液，加500ul wash bufferⅠ（黑盖），13000g离心30～60秒。

h.弃滤出液，加700ul wash bufferⅡ（蓝盖），13000g离心30～60秒。

i.弃滤出液，再空离心一次，13000g离心30～60秒，以除尽剩余wash buffer，若仍有酒精，置于桌上倒置1min，使酒精挥发。

j.卸收集管，套新的1.5ml eppendorf管，加30ul ddH
O（或solution
2
buffer（无色盖）或TE）静置5min，13000g离心60～90秒。

k.取2ul电泳，鉴定，定量，剩下的-20℃保存待用。

4.2.8 酶切鉴定
酶切体系同 4.2.2
4.2.8.1 琼脂糖凝胶电泳鉴定
4.2.9 目的克隆片段的测序验证
为进一步验证pEGFP-N1载体中的目的克隆片段，运用pEGFP-N1载体测序引物对目的克隆测序。

所用仪器为ABI377全自动测序仪(Perkin-Elmer Applied Biosystems Foster City, CA, USA)。

4.3 质粒转化BL21（方法同4.2.4.2）
4.4 EGFP-mLPAAT融合蛋白高表达菌株的筛选。

4.4.1 从平板上各挑取10个含pEGFP-N1-mLPAAT质粒的E.Coli BL21菌落接种5 ml的含抗生素的LB培养液中。

4.4.2 37℃ 250 rpm，16小时。

4.4.3 取100ul种子液，分别转接到10个5 ml LB培养液中（含抗生素），37。

>0.6。

培养3小时，至OD
600
4.4.4 加入IPTG至终浓度0.5 mM，37℃，250 rpm,培养4小时。

4.4.5 各样品5,000 rpm，10分钟，去上清，加入20 ul 2*SDS上样缓冲液，-20℃保存。

4.4.6 所有样品进行SDS-PAGE电泳。

a. 电泳缓冲液的配制
b. 配胶，分离胶与成层胶的配制
c. 电泳，先80V，15min；后150V，1h
4.4.7 考马斯亮蓝R250凝胶染色。

4.4.8 脱色液脱色。

4.4.9 根据目的融合蛋白的表达量，确定最高量表达菌株，对应编号，将该菌株加入30%甘油，-80℃保种。

4.5 EGFP-mLPAAT的最佳诱导时间的确定。

4.5.1 从-80℃冰箱冻存的高表达菌株接种至LB培养液中37℃，250rpm，16小时。

>0.6。

4.5.2 取100ul种子液转接至5ml LB培养液中，37℃，3小时，OD
600
4.5.3 加入IPTG终浓度0.5mM，25℃，250 rpm，0h,3h,6h,9h,12h,15h分别取样200ul。

4.5.4 各样品处理同4.4.5-4.4.8。

4.5.5 根据各时间点融合蛋白的表达量，确定诱导表达的最佳时间。

4.6 EGFP-mLPAAT融合蛋白的大量表达纯化。

4.6.1 取-80℃保存高表达菌种接种至10 ml LB培养液中，37℃，250 rpm，16小时。

>0.6。

4.6.2 转接至1 L LB培养液中37℃，250 rpm，3小时，至OD
600
4.6.3 25℃，250 rpm，12小时。

4.6.4 5,000 rpm，10分钟，收集菌体。

4.6.5 加入40 ml PBS（含有100 mg溶菌酶，0.1% Triton-100，25 ng/ml PMSF）重悬细菌，冰浴中超声破菌。

4.6.6 12，000 rpm，30分钟，4℃，收集上清，备上柱。

取上清，沉淀加入2*SDS 样品缓冲液，-20℃保存。

4.6.7 预处理层析柱，PBS平衡20倍柱体积，以0.5 ml/min速度上样，PBS以1 ml/min速度洗脱未结合蛋白。

4.6.8 洗脱下的目的蛋白，以PBS，4℃透析过夜。

4.6.9 取15 ul目的蛋白加2*SDS样品缓冲液。

4.6.10 SDS凝胶电泳（同4.4.6-4.4.8）
思考与讨论
1．讨论mLPAAT的生物学功能？
2．论述融合蛋白在原核细胞内表达的优越性？
3．试述你对构建EGFP-mLPAAT重组质粒的理解？
4．融合蛋白在大肠杆菌系统内的表达形式及其优缺点？5．谈谈你参加生物技术大实验后的体会与感想？
附表：
1、mLPAAT 基因序列CDS：479~1849
ORIGIN：
1 tgcaggctgt cgccncgatt aggctatgtc gaccacgccc tcgcaggatc ttcgtggcac 61 caaggcgatc tcttcttggt acttctgaca atacagatct ttagggacaa atttacccgc 121 tgaatgcttt ggggcaggag gaaagtaaaa ccttggaagc agccacatag ctgaacagaa 181 agctgcccct tgccgctcgc ttgcccggac actcaggact caggtgctgt tccagcctac 241 tcaccacaga ttgtcatctg tgcccgggag actggcattt ctggggtgct cctgtgaccc 301 ttctgcagtt ctgcgccaga gctctattca ggcagttgga tgacatgaac tttgagatgg 361 agttgtcacc cgtgagggac tggctgcctt tccaaggctt gtgctatctg aagggaccat 421 ctgaaggacg tgtttgtgtg tggaaaagag ggcaccagcc tgacgtgcgt cctcc acc at 481 gttcctgttg ctaccttttg atagcttgat tgtcaacctc ctgggtatct ccctgaccgt 541 cctcttcacc ctgctgcttg ttttcatcat cgtccctgcc atctttggag tgtcctttgg 601 tatccgaaag ctctacatga aaacactgct aaagatcttt gcgtgggcca ccctgagaat 661 ggagagagga gccaaggaga ggaaccacca gctgtacaag ccctacacca acggaatcat 721 tgcaaaagat cccacttctc tggaagaaga aatcaaagaa attcgtcgaa gtggtagtag 781 taaagctctg gataagacac ccgagttcga gctctctgac atcttctact tttgccggaa 841 aggaatggag actatcatgg atgatgaagt gacaaagaga ttctcggcag aggagctgga 901 gtcctggaac ttgctgagca gaaccaatta caacttccaa tacataagcc tgcggcttac 961 catcctctgg ggcttaggag tgctgattcg gtattgcttc ctcctgccac tcaggattgc 1021 gctggcattc acggggattg gcctcttggt agtgggaact actatggttg gatacctgcc 1081 aaatgggaga tttaaggagt ttttgagtaa acacgttcac ttaatgtgct accgtatctg 1141 tgtgcgagcc ctgacggcca tcattacgta ccacaacagg aaaaacagac caagaaatgg 1201 tggcatctgt gtggctaacc atacatcccc cattgatgtg atcatcttgg ccagcgacgg 1261 ctactacgcc atggtgggac aggttcacgg gggccttatg ggtgtgattc agagagcaat 1321 ggtgaaagcc tgcccccatg tctggtttga gcgttctgag gtgaaagatc gccacctggt 1381 ggctaagagg ctgactgagc atgtccagga taaaagcaag ctgcccatcc tcatcttccc 1441 agaaggaacc tgcatcaata acacatcagt gatgatgttc aagaagggaa gctttgaaat 1501 tggagccact gtttaccctg tggctatcaa gtatgaccct cagtttggtg acgccttctg 1561 gaacagcagc aagtatggca tggtgacgta ccttctgagg atgatgacca gttgggccat 1621 tgtctgcagc gtttggtacc tgcctcctat gactcgagag aaagatgaag atgctgtgca 1681 gtttgctaac agagtgaagt ctgccattgc ccggcaggga ggattggtag acctgctgtg 1741 ggacggtgga ttgaagagag aaaaggtgaa ggacacattc aaggaggagc agcagaagct 1801 atatagcaag atgatagtcg gaaaccatga ggaccgc agc cggtcctga g cctcc gtctt 1861 gtgctggctg aagcgccacc tctaaatcct gaagtgtgag ccagctgcag ttgttgctgc 1921 cacagcctct accgtcatcc ccgccagcca ctgctgcatc cttccggact ctggccctca 1981 ggctgttctg gactccagga ctggagctgc gtcagagctc cgtgggctgc ctgctgtcct 2041 ctaaccagaa tgcttctggc tggggctccc tgggacaaaa tgcctcttgt tcttatagta 2101 agcctctaag aggaatggca gtggagcagt tctagctggt gaaaaggtgg gccctgttct 2161 tgccctgaga ggatgttagg tgtttctgta gaaacagcca tatgctggta aagtcggaaa 2221 agacactgca gaggccggtg cctaaacagc ctccagctta gcgcttgaga tgtggcagaa
2281 aggactgtct gcaggagtgc tcacgtcctc cagcgagtgg agtcctaagt ccctgtgttc
2341 ctgcttatga agatcaccag aggagatagg aagagccagt gggctcctgg gcagttagct
2401 agccccaggc tgagcctgaa tcccccacat gacttgttta atatgtctca gtttccctgt
2461 ctgttccatg gaattgcgga gagagatggc ggtgtgccta cctcacaggg ttgttgtggg
2521 gattccagtg ctagtgcgtg tgaaggaaat gtgtgctgct ctcccaggga cagcttcaga
2581 gagcgtggca ggacaaggtc agagctacag ctgctgccca ggattttaaa attgtttgtg
2641 agtaaataaa actggatggt aaatgaaaaa aaaaaaaaaa aa
2、融合蛋白的预测：（简单预测为：EGFP+mLPAAT）
EGFP：
Length : 239
Molecular weight : 26.941 kDa
序列：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDA TYGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDT LVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQL ADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDEL Y K
mLPAA T：
Length : 456
Molecular weight : 52.181 kDa
序列：
MFLLLPFDSLIVNLLGISLTVLFTLLLVFIIVPAIFGVSFGIRKL YMKTLLKIFAWATLRMERG AKERNHQL YKPYTNGIIAKDPTSLEEEIKEIRRSGSSKALDKTPEFELSDIFYFCRKGMETIM DDEVTKRFSAEELESWNLLSRTNYNFQYISLRLTILWGLGVLIRYCFLLPLRIALAFTGIGLL VVGTTMVGYLPNGRFKEFLSKHVHLMCYRICVRALTAIITYHNRKNRPRNGGICV ANHTS PIDVIILASDGYYAMVGQVHGGLMGVIQRAMVKACPHVWFERSEVKDRHLV AKRLTEHV QDKSKLPILIFPEGTCINNTSVMMFKKGSFEIGATVYPV AIKYDPQFGDAFWNSSKYGMVT YLLRMMTSW AIVCSVWYLPPMTREKDEDA VQFANRVKSAIARQGGLVDLLWDGGLKRE KVKDTFKEEQQKL YSKMIVGNHEDRSRS
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